专利名称：定量测定人体丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型属于体外临床诊断试剂技术领域，具体涉及一种适用于测定人体全血、血 清或血浆等中的丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶等生化指标的干化学试纸。
背景技术：
丙氨酸氨基转移酶又称谷丙转氨酶，它催化L一丙氨酸和L一谷氨酸之间氨基的转移。 丙氨酸氨基转移酶主要存在于肝细胞的胞浆中，在心肌、骨骼肌及其它组织中的含量较低。 丙氨酸氨基转移酶是肝脏的特异性酶，血清值升高表明肝细胞质膜存在渗漏并退化，其升 高的程度与受累细胞的数量有关。
临床上测定丙氨酸氨基转移酶的试剂可分为液体试剂和干化学试纸两类。干化学试纸 主要用于快速检测。同液体试剂相比，干化学试纸具有方便、灵活、污染小、操作简便等 优点。
目前，检测丙氨酸氨基转移酶的的干化学试纸多为国外产品，主要有纵向和横向两类。 第一类是以强生公司和富士公司为代表的多层膜干片法，利用感光胶片的涂层技术将试剂 层、辅助试剂层、光漫射层和分布层等试剂涂布在透明支持层上，从支持层的反面测定光 密度的变化。如专利U.S. PAT.N0.5, 508， 173。第二类是罗氏公司的干化学产品，U.S. PAT.NO.4,604,264将试剂涂布在多丝的纤维或织物上，全血通过玻璃纤维横向过滤后与上 试剂层接触反应，通过上部覆盖的一透明薄膜测定光密度的变化。
上述这些产品，有的生产工艺复杂，需要专门的技术；有的可能存在某些缺陷，如加 样和测定在同一侧可能会造成干扰。而且目前应用的干式生化分析仪为大中型设备，它将 若干个生化项目集中在一台仪器上测定。在测定单一的丙氨酸氨基转移酶项目时，如流动 采血车等场合，其功能和速度会受到限制。本实用新型旨在提供独立的小型机和试纸，更 适合丙氨酸氨基转移酶的大规模快速筛査。 发明内容
本实用新型的目的在于提供一种使用方便、快速的定量测定人体全血、血清或血浆中 的丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸。
本实用新型提供的定量测定丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸，为长条形， 一端为手持 区，另一端为测试区，其结构如图1和图2所示。它由上支持层、下支持层、底物层和显
色层组成。其中，上支持层和下支持层通过自带的胶层粘合在一起。在上支持层的测试区 开有加样孔，下支持层的对应位置开有测试孔。底物层和显色层迭合，位于加样孔和测试 孔处的上支持层和下支持层之间。
本实用新型中，上支持层和下支持层可采用高分子聚合材料，如聚乙烯、聚氯乙烯、 聚苯乙烯或聚酯纤维等。其中优选聚酯纤维。单片支持层的厚度为100-250um,大小为6 X50mm-12X80mm。上下支持层上的加样孔和测试孔为圆形，直径相同，为4-8mm。加样孔 3用于滴加样品，测试孔用于观察和测定反应区颜色的变化。
本实用新型中，底物层用来接受样品，样品在底物层扩散，将浸渍在底物层上的试剂 溶解，样品中的可检测部分被转运到显色层的样品面。底物层优选反应区面积能容纳大约 10-30yl血液，并能将大约6-10pl样品转运至显色层的材料。适合做底物层的材料包括 玻璃纤维、各种滤纸或无纺布等，特别优选玻璃纤维，其结构疏松，血液样品中的可检测 部分和试剂能快速渗透至显色层，縮短了反应时间。
本实用新型中，显色层为浸渍有检测试剂和色原的各种滤纸、无纺布或合成膜等，优 选聚砜、聚醚砜或尼龙等材料的合成膜，特别优选具有孔径大小呈梯度变化的孔的合成膜， 合成膜上的小孔孔径范围为0.2-10um。合成膜有一个用于点样的样品面，和一个可观察 到颜色变化的检测面。当血液渗透到膜的大孔面上后，样品逐渐穿过膜，流过的孔径越来 越小。最后，红细胞等物质到达膜的某个位置就不再往下渗透。含有丙氨酸氨基转移酶的 剩余样品渗透到小孔面，通过一系列反应，使色原颜色发生变化，从而指示样品中丙氨酸 氨基转移酶的浓度。
本实用新型中，反应试剂分布于底物层和显色层上。定量全血或血清/血浆滴加于加样 孔内，样品均匀分布并渗入试剂层中。样品中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)催化底物L一 丙氨酸和a—酮戊二酸钠，产生L一谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸被丙酮酸氧化酶在黄素腺嘌 呤二核苷酸(FAD)及硫胺素焦磷酸(TPP)存在下氧化产生过氧化氢。在过氧化物酶作 用下，过氧化氢氧化无色色原生成有色产物，颜色变化与样品中的丙氨酸氨基转移酶活性 成正比，用反射光度计可测定之。
本实用新型中，反应试剂包括缓冲体系、底物、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、色原、 激活剂、稳定剂等。缓冲体系可以是磷酸盐缓冲液、Tris-HCL或Good's缓冲液等，浓度 为0.05M—1.0M，反应最佳pH值在6.5-8.0。底物采用L一丙氨酸和a —酮戊二酸钠，底 物在丙氨酸氨基转移酶的催化下产生L一谷氨酸和丙酮酸。L一丙氨酸的浓度为 0.5M-1.5M, a —酮戊二酸钠的浓度为5mM-50mM。生成的丙酮酸被丙酮酸氧化酶在黄素 腺嘌呤二核苷酸(FAD)及硫胺素焦磷酸(TPP)存在下氧化产生过氧化氢。丙酮酸氧化
酶的适宜浓度为30-100U/ml ， FAD浓度为0.1mg/ml-0.2mg/ml ， TPP浓度为 0.4mg/ml-0.8mg/ml;丙酮酸氧化酶的激活剂采用Mg2+， Mg"的浓度为1.0g/L-3.0g/L;酶的稳
定剂采用二糖、多糖类或蛋白类稳定剂等，如蔗糖、海藻糖和牛血清白蛋白等，在体系中 的重量浓度为0.1-2.0%。在过氧化物酶作用下，过氧化氢氧化无色色原生成有色产物。过 氧化物酶浓度为30-100U/ml。色原作为指示剂，可以是单一组分或两种组分的色原物质， 优选色原强吸收处的波长不同于样品的强吸收处的波长，特别优选强吸收处的波长为 610-650nm的色原，浓度为0.03%-0.5%。
为定量测定丙氨酸氨基转移酶活性，发明人还研制了反射式分光光度计(另案申请专 利)，与本实用新型试纸条配套使用。6-血样滴加于试纸条上，反应温度控制在37土 0.3°C，用该光度计测定试纸反应后在630士20nm波长下反射光密度的变化，测试在3. 5_5 分钟内完成。自动报告和存储实验结果，并打印。
本实用新型使用丙酮酸氧化酶法测定丙氨酸氨基转移酶活性，采用底物层和显色层迭 合的结构，试剂稳定性好，显色强度高，均匀度好，减少了加样端测定产生的气泡、过量 液体、红细胞等造成的干扰，可使用全血和血清/血浆作为标本。本实用新型制造工艺简 单，与专门设计的小型反射式光度计配套，使用更为方便快速。
图1为本实用新型的干化学试纸图示。
图2为本实用新型的干化学试纸剖面图示。
图中标号1为上支持层，2为下支持层，3为加样孔，4为测试孔，5为底物层，6 为显色层。
图3为实施例1的测定结果的回归直线方程。
具体实施方式
实施例1:上、下支持层采用PVC片，用打孔机打出加样孔3和测试孔4，孔直径为 4mm，孔距为8mm。底物层5采用玻璃纤维，粘贴于上支持层。显色层6采用尼龙膜，粘贴 于下支持层。将配制好的底物溶液和显色液用BIO-DOT喷点仪分别点样于底物层5和显色 层6，每孔6W。将喷点后的试纸放入30-5(TC的真空干燥箱中，干燥后取出。将上、下支 持层对合粘帖在一起，加样孔3与测试孔4对齐。用滚刀机将试纸切成8mm宽的试纸条即 成。
试剂组成如下
磷酸盐缓冲液 50mM L一丙氨酸 500mM
a —酮戊二酸钠 10mM MgCl2*6H20: 2.4g/L 过氧化物酶 30U/ml 丙酮酸氧化酶 30U/ml 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) : 0. lmg/ml
硫胺素焦磷酸(TPP) : 0.4mg/ml 4-氨基安替比林 1.2g/L DAOS(色原) 0.85g/L
(N-乙基一N— (2—羟基一3—磺酸基丙基)_3， 5 — 二甲氨基苯胺) 牛血清白蛋白 0.2% 将6u 1 7%牛血清白蛋白配制的丙氨酸氨基转移酶校准品滴加于加样孔，用反射式光 度计进行测定，读取2.5—4分钟时的反射强度的变化。结果见表l:
ALT浓度(U/L) 反射强度变化
15. 6 62. 5
125 200
0.032 0. 050 0. 080 0. Ill
以此建立直线回归方程为Y(反射强度变化)二O. 0004X(ALT浓度)+0. 0245， r2=0. 9987。 如图3所示。
实施例2:上、下支持层采用PET片，用打孔机打出加样孔3和测试孔4，孔直径为 4mm，孔距为8腿。底物层5采用玻璃纤维，显色层6采用PES膜，宽度为8 mm。将底物 层5和显色层6分别浸泡于底物溶液和显色液中，完全浸湿后取出，刮平。将浸湿的试纸 放入30-50℃的真空干燥箱中，干燥后取出。将底物层5粘贴于上支持层，显色层6粘贴 于下支持层。将上、下支持层对合粘帖在一起，加样孔3与测试孔4对齐。用滚刀机将试 纸切成8mm宽的试纸条即成。 试剂组成如下
Good's缓冲液 200rnM
L一丙氨酸 lOOOmM
a -酮戊二酸钠 20mM
MgCl臭0: 2.0g/L
过氧化物酶 100U/ml
丙酮酸氧化酶 100U/ml
黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) : 0.2mg/ml
硫胺素焦磷酸(TPP) : 0. 8mg/ml
KH2P04 : 20mM
3',3，，5'， 5，-四甲联苯胺(色原) 0.1%
海藻糖 0.5%
用高浓度的丙氨酸氨基转移酶血清稀释红细胞，得到红细胞压积为20%、 30%、 40 %、 50%和60%的全血标本，加样量为20ul，分别滴加于加样孔，用反射式光度计进行 测定，读取3—4分钟时的反射强度的变化。结果见表2:
红细胞压积 反射强度变化
20% 0. 056
30% 0. 063
40% 0. 062
50% 0. 059
60% 0. 039
结果说明红细胞压积在30% — 50%的全血标本在测定时几乎不受红细胞的干扰。
权利要求1、一种定量测定丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸，其特征在于形状为长条形，一端为手持区，另一端为测试区，由上支持层(1)、下支持层(2)、底物层(5)和显色层(6)组成；其中，上支持层(1)和下支持层(2)通过自带的胶粘层粘合在一起；在上支持层(1)的测试区开有加样孔(3)，下支持层(2)的对应位置开有测试孔(4)；底物层(5)和显色层(6)迭合，位于加样孔(3)和测试孔(4)处的上支持层(1)和下支持层(2)之间；底物层(5)和显色层(6)上浸渍有反应试剂。
2、 根据权利要求1所述的定量测定丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸，其特征在于所述的上支持层和下支持层的材料为高分子聚合材料，单片支持层的厚度为100-250μm，大小为6X50mm-12X80mm，上支持层和下支持层的规格相同，其上的加样孔(3)和测试孔(4) 为圆形，直径为4-8mm。
3、 根据权利要求1所述的定量测定丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸，其特征在于所述的底物层(5)的材料采用玻璃纤维、各种滤纸或无纺布。
4、 根据权利要求1所述的定量测定丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸，其特征在于所述的显色层(6)的材料为各种滤纸、无纺布或合成膜。
5、根据权利要求4所述的定量测定丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸，其特征在于所述合成膜为聚砜、聚醚砜或尼龙。
6、根据权利要求5所述的定量测定丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸，其特征在于所 述合成膜具有孔径大小呈梯度变化的孔，其中小孔的孔径范围为0.2-10μm。
专利摘要本实用新型属于体外临床诊断试剂领域，具体为一种定量测定人体丙氨酸氨基转移酶活性的干化学试纸。试纸由长条形的上、下支持层组成，在测试区从上到下依次为加样孔、底物层、显色层和测试孔。底物层可选用玻璃纤维、滤纸和无纺布等材料，浸渍有底物等试剂；显色层为各种滤纸、无纺布或合成膜，浸渍有色原等试剂。样品从加样孔进入底物层，转运至显色层的样品面，含有被检测成分的液体渗透至显色层的检测面，通过化学反应引起色原颜色的改变，通过下支持层上的测试孔在显色层的检测面即可测定光密度的变化。该试纸用于快速测定人体全血、血清或血浆中的丙氨酸氨基转移酶的活性，是肝功能检测的重要指标之一。
文档编号G01N33/52GK201181295SQ20072007344
公开日2009年1月14日 申请日期2007年8月9日 优先权日2007年8月9日
发明者朱世成, 缦 王, 漪 田 申请人:上海科华生物工程股份有限公司