专利名称：：用于检测青蒿素衍生物的分析方法、试剂盒和装置的制作方法
技术领域：
：本发明是关于一种用于确定青蒿素衍生物(artemisininderivatives,ARTS)在样品中的存在的分析方法，和在该方法中使用的装置和试剂盒。
背景技术：
：青蒿素衍生物(ARTS)和青蒿素衍生物的组合(artemisininderivativecombination,ACTs)被认为是目前可获得的最有效的抗疟药物，可以提供快速的治疗，并且没有关于寄生菌株出现抗药性的报告。所有成功的药物都存在通过不符合标准的技术，以更低的成本在缺乏质量控制的情况下被仿造或生产的风险。世界卫生组织(WHO)给仿造药物(counterfeitdrug)做出如下定义"故意地欺骗性地贴错关于性质和/或来源的标签。仿造既可以针对品牌产品也可以针对普通产品，仿造的药物可以包括成份正确的产品，也包括成份错误、没有活性成份、具有不充分的活性成份、或具有伪造的包装的产品"[2]。另外，WHO估计，在发展中国家销售的药物约25%为仿造药物，并且，在某些国家这一比例高达40%或更高[3，4]。由于漠视优良的生产实践，生产出了不符合标准的药物；并且由于较差的质量控制，这些不符合标准的药物的成份和/或分解时间可能超出可接受的范围数倍。对于在主要的药物公司中执行的为获得专利的产品而设定的标准，很多发展中国家不具有实施所需要的技术、财力或人力资源。今天，不能被接受的事实是，在受控制的药店之外的出售的药品由于其低价而吸引了最贫困的人群，对于这部分人来说通过药效和安全性指示的药物的质量更加不可靠。额外的复杂因素还在于，贫困的人不仅购买最便宜的产品，而且购买市场中可获得的最小的包装。在需求超过产量的情况下，还存在仿造药物占据市场的威胁。青蒿琥酯(artesimate)是一种常用的青蒿素衍生物，它被制成片剂和注射剂的形式，最近还与阿莫地喹共同制备以作为联合治疗来施用。伪造的青蒿琥酯片剂在东南亚大陆流行，已经在那里成为非常严重的公共卫生问题，并且已经不可避免地导致很多原本可以在疟疾感染中活下来的人发生死亡。尽管标示的很像通常使用的由桂林南药股份有限公司(GuilinPharmaceuticalCompany,中国，桂林)生产的青蒿琥酯，但是在测试时，在那些青蒿琥酯片剂中并没有发现含有活性化合物[5，6]。目前，在东南亚大陆中流通的青蒿琥酯中有三分之一到二分之一为仿造的。还存在很严重的忧虑，那就是，正如近来在肯尼亚和刚果进行的研究所证明的，在非洲，这可能同样会成为一个主要的问题[7]。如果仿造的青蒿素衍生物随着真正的产品进入非洲，将会带来非常严重的公共卫生问题。这将会导致ARTs和ACTs效果的降低，从而失去对其作用的信心。由于仿造的药物绕过了传统的销售渠道，因此税收将会受到损失；并且由于监督药物[9]的作用和安全，以及额外的治疗受感染的人带来的经济负担，健康体系的成本将会增加。由于缺乏发色团(具有紫外/可见吸收性质的化学基团)，ARTs是无色的，并且不能通过简单的比色试验被检测到。己经开发了一些复杂的技术(()高效液相色谱(HPLC)/e.d.c,高效液相色谱(HPLC)/紫外(UV)柱后衍生化检测，液-质联用(LC/MS))，但这些方法不能在这一领域使用，并且对发展中国家来说非常昂贵。因此，目前在商业上已经开发出了一种用于现场检测仿造青蒿琥酯的分析方法。这一方法经过改进，包括了对蒿甲醚(artemether)和双氢青蒿素(dihydroartemisinin)的检测[6]。该方法为试管测试法，依赖于商业上可获得的重氮盐，固红ITR盐(FastRedITRsalt,Sigma公司)的反应，与它们一起，三个青蒿素衍生物(ARTS)导致黄色产物生成。不幸的是，这一测试是不确定的，因为黄色有可能是与其它药物，如强力霉素(doxycycline)和叶酸产生的。另外，其它黄色的抗疟疾剂，如阿莫地喹(amodiaquine)、强力霉素、苯苑醇(lumefantrine)和米帕林(mepacrine)，在以联合制剂的形式被使用时(例如，很快将被广泛使用的青蒿琥酯/阿莫地喹)，将会引起混淆。通过目前可以获得的技术，不可能在联合治疗时(例如阿莫地喹/ARTs联合治疗)确定ARTs的存在，因为ART或阿莫地喹的存在都会产生假"阳性"的黄色结果。
发明内容考虑到目前现场检测方法的限制，本发明人发明并验证了一种使用者/现场友好的方法；特别地，适用于对所有实验室研究人员可获得的青蒿素衍生物进行鉴定。本发明人开发的这一方法特别地实用，因为它允许对ART的存在进行确定，并对阳性结果进行确认。根据本发明，提供了一种用于确定青蒿素衍生物在样品中的存在的方法，该方法包括将样品与选自二硝基苯肼和固蓝RR(FastBlueRR)的试剂进行结合；观察样品的颜色变化，以所述颜色变化做为存在有青蒿素衍生物的指示。由于允许快速并便宜地确定青蒿素衍生物的存在，因而本发明的方法特别地实用。青蒿素衍生物的存在通过颜色变化来指示。没有发现其它的抗疟疾药物能够产生同样的颜色变化。另外，该方法提供了两种独立的试剂，可以用于确认青蒿素衍生物的存在。仅仅需要使用一种试剂。由于可以根据使用者的偏好或者哪一种对使用者最容易获得而选择试剂，因此具有显著的优点。并且这也允许对所得的结果进行确认，减少了由于试剂的问题或使用者的失误而产生错误结果的可能性。具体实施例方式青蒿素是一种公知的基于植物黄花蒿(herbArtemisiaannua)提取物的抗疟疾药物。该术语为本领域技术人员所公知。青蒿素衍生物是以青蒿素为基础的具有相同或相似的性质的化合物。特别地，青蒿素衍生物包括双氢青蒿素、蒿乙醚(arteether)、青蒿琥酯、青蒿酮(artemisone)和对羧基苯甲醚(artelinicacid)。作为在此使用的术语，青蒿素衍生物也包括基于青蒿素的合成化合物，例如OZ277。仅仅作为例子，一些青蒿素衍生物的结构如图1所示。所述固蓝RR是一种用作偶联剂的常用试剂，以在不同介质中测定酶的活性。简单地说，酶的活性是通过与固蓝B盐一起将醋酸萘转化成萘酚并形成相应的紫色的重氮染料而测定的。在本领域中，固蓝RR表示的是4'-氨基-2',5-二甲氧基苯甲酰苯胺，为公知术语。二硝基苯肼也是已知的班特尼试剂(Brady'sreagent),为本领域技术人员所公知。优选情况下，本方法在强酸性介质中实施。这使得青蒿素衍生物发生降解，分解的产物可以和试剂进行反应。特别地，本方法优选在pH小于2的条件下实施，更优选在pH小于1的条件下实施。任何适合的酸都可以用于制备所述酸性介质，例如但不限于，盐酸、硝酸、磷酸和硫酸。优选使用盐酸。任何其它适合的介质也可以使用。术语"样品"包括任何使用者希望对其中是否存在有青蒿素衍生物进行检测的样品。特别地，术语样品在此是指任何含有青蒿素衍生物的片剂或其它药物样品。所述样品可以为任何形式，例如可以为固态或液态。当所述样品为固态形式时，使用者可以将样品溶解在溶剂中，特别是水或有机溶剂中，例如甲醇。替代性地，固态样品可以直接溶解在试剂中。所述样品也可以在添加试剂之前溶解在酸性介质中。优选情况下，所述样品为固态形式，优选地为粉碎的片剂形式。当检测潜在的仿造片剂时，实用的方法是将片剂粉碎，并对得到的粉末进行检测，从而确定青蒿素或其衍生物是否在整个药片中存在。已知的是，一些仿造药物在不含有青蒿素衍生物或其衍生物的药片表面附着一薄层青蒿素。对这些药物的表面进行的测定表明它们是真正的药物，但事实上，包含在药片中的活性成分与它应当具有的含量相比，则显著的降低。特别是在测定可能含有包括赋形剂在内的其它成份的药物样品时，由于ARTs溶解在这些溶剂中，但很多赋形剂和药物不溶解，因此将样品溶解在有机溶剂中(特别是甲醇、乙醇或乙氰)具有特别的优点。这提供了能够除去一些化合物的额外的选择步骤。优选地，所述溶剂为甲醇。为了在酸性介质中实施本方法，并且使用有机溶剂，所述溶剂优选为被酸化的。使用酸化的溶剂特别实用，因为这可以使两个优选的方法步骤相结合，从而减少步骤的总数，减少了实施该方法的时间。特别地，可以使用酸化的甲醇，例如用盐酸酸化的甲醇。甲醇和盐酸可以以适当的比例使用，例如，以2:1，1:1，和l:2的比例。可以使用任何适当浓度的盐酸，例如1M，2M，5M或8M。术语"样品"也可以包括从受试对象得到的样品，如尿或血液样品。特别地，对尿样进行检测能够有帮助于检查受试对象是否排泄出青蒿素或其衍生物。优选地，所述样品和试剂在载体上进行结合。所述载体可以为任何合适的成份，可以将所述样品和试剂在所述载体上进行结合，并观察颜色的变化。特别优选地，所述载体为滤纸或薄层色谱层析板(thinlayerchromatographyplate,TLC板)。可以使用任何适合的薄层色谱层析板，例如，具有氧化铝底衬的薄层色谱层析板。所述样品和试剂可以以任何适当的形式进行结合。例如，当试剂为液态而样品为固态时，所述样品可以溶解在试剂中。替代性的，所述样品可以为液态，或者在与试剂结合之前溶解在液体中。当试剂和样品在载体上结合时，二者可以以任何适当的方式进行结合。例如，二者可以如上述方式进行结合，然后施加于载体上，例如通过喷雾、滴加或倾倒而被施加至载体上，或者将载体浸在结合物中。替代性的，可以将试剂和样品中的一个施加在载体上，然后再施加另外一个。例如，可以先将样品施加在载体上，然后再将试剂施加在样品所在的区域，或者可以先将试剂施加在载体上，然后将载体浸入溶解的样品中。如本领域技术人员所公知，存在很多能够使样品和试剂结合并对其进行施加的方式，并不受上述例子所限。当使用二硝基苯肼作为试剂时，优选情况下，所述样品在溶液中变成黄色或橙色，或者在载体上为粉色。当使用固蓝RR为试剂时，优选情况下，所述样品变成蓝色。'本发明人惊奇地发现，其它抗疟疾药物、赋形剂和如止疼药、抗生素和抗病毒药(antiretroviral)等在内其它药物使用本发明的方法并不产生阳性结果。大部分被测试的化合物根本不产生颜色变化。一部分产生轻微的颜色变化，但与青蒿素或其衍生物的颜色变化的程度不同或颜色不同。本发明的方法对青蒿素或其衍生物是特定的并且敏感的。本发明人测试了在生产抗疟疾制剂时所使用的超过30种赋形剂、80种药物(纯物质但为药丸)和30种抗疟疾药。没有在任何测试中发现干扰。在二硝基苯肼的二硝基苯肼(DNP)分析(两个载体)或固蓝RR在薄层色谱层析上的分析都没有发现干扰。发明人发现，红霉素抗生素可能带来干扰，因为在使用固蓝RR进行检测时，红霉素在每个载体上都产生蓝色。红霉素带来的干扰可以通过颜色测试而进行确认，并且该步骤可以包含在本方法中。另外，通过使用二硝基苯肼进行重复检测，使用固蓝RR时所产生的任何干扰都可以轻松地被确认为干扰，而不是阳性结果。如上文指出的，本方法还可以与红霉素的颜色检测相结合，以确认阳性结果是由青蒿素衍生物导致的，而不是红霉素。本方法可以包括使所述样品与咕吨氢醇(xanthydrol)和乙酸、盐酸的混合溶液进行反应；和对得到的溶液进行加热。如果存在红霉素，则可以观察到红色。优选地，所述咕吨氢醇的用量为约0.2g/L;优选地，所述乙酸与盐酸组合的比例为1:99。替代性地，本方法可以包括将所述样品与盐酸溶液进行反应。如果存在红霉素，则在数分钟后将观察到黄色。优选地，本方法包括将所述载体进行干燥。这可以以任何适当的方式完成，包括简单地将所述载体置于室温下直至被干燥。优选地，本方法包括将一部分样品与二硝基苯肼组合，并且将一部分样品与固蓝RR组合，观察两种组合的颜色变化。由于本方法提供了对青蒿素衍生物的存在的双重确认，从而有利于避免出现假阳性，因此特别实用。本发明还提供了一种用于检测青蒿素衍生物在样品中的存在的试剂盒，该试剂盒包括载体、和选自二硝基苯肼和固蓝RR的试剂。优选地，所述试剂盒包括如何对青蒿素衍生物进行检测的说明。所述试剂盒优选含有两种试剂。优选地，如上文所述，所述试剂盒含有溶剂，待测样品可以溶解在所述溶剂中。特别地，所述试剂盒优选含有酸化溶剂。所述试剂盒还可以包括指南，例如颜色图，以帮助使用者确认是否达到了阳性结果。在测试中产生的颜色的强度用于指示存在的青蒿素或其衍生物的量。所述颜色图可以包括许多不同的颜色强度，允许使用者了解存在的青蒿素或其衍生物的量。所述试剂盒还可以包括阳性样品，以用于与测试样品平行运行，作为对照或对比。另外，还提供了一种用于检测青蒿素衍生物的存在的装置，该装置包括载体，该载体负载有选自二硝基苯肼和固蓝RR的试剂。优选地，所述载体负载有二硝基苯肼和固蓝RR两种试剂。所述试剂以任何方式负载在所述载体上，当含有青蒿素衍生物的样品施加在载体上时，可以看到颜色变化。所述装置的至少一部分可以为彩色的，优选具有在得到阳性结果时可以被观察到的一种或多种颜色。使用者可以轻松地将施加样品后的试剂颜色与装置上的颜色相比较，从而对阳性结果进行确认。可以对所述装置进行设置，从而使样品可以以任何方式进行施加。所述样品可以通过喷雾、滴加或倾倒的方式加到装置上含有所述试剂的区域。优选地，所述装置为测试棒(dipstick)。术语测试棒为本领域技术人员所公知，指一种用于测试样品的装置。测试棒通常为载体，一般是伸长的形状，可以浸入到液态样品中。所述测试棒负载有试剂，该试剂在样品中存在特定化合物时能够改变颜色。所述装置，例如测试棒，可以具有涂层，特别是其中嵌有所述试剂的涂层。所述涂层可以为任何适当的涂层，例如氧化铝、纤维素或二氧化硅。下面通过实施例具体地描述本发明。实施例样品的制备使用2.5毫克纯化学物质作为参考药物，替代性地，将5毫克从待分析样品(片剂、胶囊等)中得到的粉碎的粉末溶解在体积为200微升的甲醇中。将溶液混合30秒(摇晃或其它可用的方法，如漩涡或超声波浴)，然后在工作台上静置数分钟(沉淀)。试剂的制备DNP:将25毫克2，4-二硝基苯肼溶解在50毫升80%甲醇1M盐酸溶液中。FBS:将125毫克固蓝RR盐溶解在25毫升的水中。将该溶液与25毫升80%甲醇2M硫酸溶液混合。测试材料在板/滤纸上的实施薄层色谱层析(TLC):使用硅胶60F254A1板(Merck)。滤纸可以使用任何标准的滤纸。使用微量吸液管或带刻度的毛细管在TLC或滤纸上施加(缓慢施加溶液，以避免出现大的点)体积为5-10微升的溶液(见样品的制备)。喷雾过程使用两种试剂进行喷雾，直到板/滤纸饱和(湿)。将TLC/滤纸置于室温下至干燥。替代性地，可以将试剂缓慢地滴加到TLC或滤纸上。观察结果DNP:在室温下，约30分钟至1小时左右，观察到ARTS为粉色的点(黄色背景)。FBS:在室温下，约l-3小时左右，观察到ARTS为蓝色的点(白色背景)。两个反应在TLC上进行的都比在滤纸上进行的要快。表1、2和3显示了根据上述方法对不同抗疟疾药物、赋形剂和其他药物的检测结果。标明了格林前、格林后、改进的格林前、改进的格林后的列，分别表示使用格林(Green等.)发明的方法测试得到的样品颜色。格林前和格林后分别表示添加了最初的格林方法中用于检测青蒿琥酯的格林试剂之前和之后，其中该方法使用的是水溶性试剂。改进的格林前和改进的格林后分别表示添加了改进的格林方法中用于检测衍生物的试剂之前和之后，其中，该方法中使用的是有机溶剂。标明了FBS、DNP和H2S04(分别为前和后)的列，分别表示在载体上的溶液中添加固蓝盐、二硝基苯肼和硫酸之前和之后的颜色。术语"nc"用来表示没有颜色。术语"nt"表示没有测试。可以看出，所有检测的青蒿素衍生物都可以观察到颜色的变化，而其它物质中则没有观察到颜色的变化。两个溶解度的列表示在水中的溶解度和在有机溶剂中的溶解度。参考文献Newton，P.，S.Proux，etal.(2001).FakeartesunateinsoutheastAsia,Lancet357(9272):1948-1950.Newton,P.N.，A.Dondorp,etal.(2003).CounterfeitartesunateantimalarialsinsoutheastAsia.Lancet362(9378):169.GPHF-Minilab,pdfdocumentsavailableusingthefollowinglink:Http:〃www,gphf.org/web—en/publikationen/manuals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