用于多肽的双标记以容许质谱分析中的多通道化的化合物和方法

专利名称：：用于多肽的双标记以容许质谱分析中的多通道化的化合物和方法
技术领域：
：本发明提供了通过质谱方法筛选目标(targets)的方法和工具。更特别地，本发明的方法和工具容许利用同位素和同量异序肽标记(isotopicandisobaricpeptidelabelling)过程的组合利用液相色谱质镨法平行筛选多个样品。
背景技术：
：来自高度复杂的混合物的蛋白质的分析和鉴定需要巨大的分辨能力。通常用于分辨这样的混合物的两种方法是2-维凝胶电泳(2D-GE)和(2维的)液相色谱法((2D)-LC)。高分辨率2D誦GE由Klose(1975)7/ww""ge"";l26,231-243和0'Farre11(1975),J.Ao/.CTzem.250,4007-40021引进。2D國GE在分辨率上是非常卓越的(>5000蛋白质)，但是受到缺乏自动化和重现性的困扰。此外，蛋白质例如疏水膜蛋白、碱性蛋白、酸性蛋白、非常大的或非常小的蛋白质是难以分辨的。对于逃避使用凝胶电泳鉴定的许多有前景的疾病标志物，2D-LC提供了很好的选择，容许复杂的蛋白质混合物的高分辨率分离[HanashWa/.(2003)A^/w厂e422,226-232;LiptonWa/.(2002)尸roc.AAaf/.」cadSc/.L/"&499,11049-11054]。2D-LC方法比2D-GE更适合于分离较小的蛋白质，并且自动化性和处理量显著地更好。已经描述了通过液相色镨法分离蛋白质/肽消化物的几种技术，包括毛细管电泳(CE)、反相(RP)HPLC、和2-维液相色谱法。一般地，2D-GE或2D-LC分离的肽和蛋白质通过质谱法或通过测定氨基酸组成和/或氨基酸序列来鉴定。在通过质谱技术测定不同样品(例如，疾病对比对照)之间统计学上显著的蛋白质表达差异方面最相关的难题是来自不同样品的MS信号的相对定量。因而，高度希望的是开发一些方法，其容许平行地加工多个样品来尽可能降低不同样品之间的技术上的变化性。近来，已经引入了两种方法来实现这一点。第一种技术被称为同位素编码的亲和标签(Isotope-CodedAffinityTag,ICAT)技术，容许基于相关蛋白质混合物的差异化同位素标签化进行定量的蛋白质组学分析[GygiWa/.(1999)A^.Ao&c/mo/.17,994-999]。描述的ICAT试剂利用了三种功能元件用于还原的半胱氨酸残基的选择性标记的硫醇反应基团(thiol-reactivegroup),生物素亲和标签以容许半胱氨酸标记的肽的选择性分离，以及同位素标签，其以两种同位素形式合成，"轻"(非同位素)或"重"(利用2H或"C)形式。由于仅中度数量的产生的肽在它的原始序列中含有半胱氨酸，所以消化的亲和纯化的样品的复杂度显著降低。两种独立标记的肽样品("轻，，对比"重，，)在它们进行分离技术如液相色镨之前被组合(附图1),随后是MS筌定。一种可选择的方法利用同量异序标记的试剂，称为用于相对和绝对定量的同量异序标签(IsobaricTagforRelativeandAbsoluteQuantitation,iTRAQ)。Ross等人(2004,A/o/.Ce〃./Vo&omz"3,1154-1169)描述的这种技术提供了四种不同的iTRAQ试剂，各自含有报告基团、平衡基团和与伯胺基团反应的肽反应基团(附图3)。报告基团是具有114、115、116或117Da的质量的基团，取决于每种试剂中12C/13C和160/180的差异化的同位素组合。平衡基团在质量上从31到28Da变化，以确保对于所述四种试剂，报告基团和平衡基团的组合的质量保持恒定(145Da)。因此，用这些试剂的每一种(包含报告基团和平衡基团中不同同位素的特定组合)标记相同的肽产生了同量异序的并在液相色谱中共同洗脱从而是色谱分析不能区分的肽。在MS/MS分析期间，来自所述肽的报告基团离子碎片显示114到117Da的不同的质量。这些碎片的强度可以用于定量单独的肽。因而，在四种不同的样品中特定肽的存在可以通过用不同的iTRAQ试剂标记每一种样品来差异化地测定。iTRAQ标记物被用于从MS/MS谱定量相对和绝对肽丰度，并容许在单次实验中标记多达四种不同的样品。此外，标记的肽是同量异序的并且都产生一种离子物种，其在MS中观察到并被用于CID。这产生了提高的信号强度以及正确的肽鉴定的提高的可能性，特别是对于具有低丰度的分子而言，其是许多生物学上有意义的蛋白质的特征。近来，商业上可获得的ITRAQ试剂的组已经变成八种，包括具有113、118、119和121的质量的4艮告基团。MS信号的绝对和相对定量在通过基于质语方法的技术的生物标记物发现方面是未解决的问题。然而，不同的样品，例如(不同的疾病组，疾病的不同发展阶段、疾病对比对照/健康)之间的相关表达差异的鉴定需要高度可重现的技术，因为相关的生物标记物仅能来自大量的测量。以上描述的ICAT和iTRAQ技术容许2个(ICAT)或多达4或8个(iTRAQ)单独的样品的多通道化，并容许同时地处理它们从而最小化技术变化性。尽管如此，这两种方法都具有显著的局限性。ICAT方法仅容许研究两种不同的样品或两个疾病组，其通常不能代表疾病相关群组的全部系歹'J(例如，疾病的不同发展阶段)。因此，非常有益的是拥有可用的技术，其容许研究超过2个群组。虽然容许多个样品的分析，iTRAQ技术具有明显的缺点，它需要对每个MS信号(对于未标记的和标记的肽)进行MS/MS用于报告信号的相对定量。实际上，当起始材料具有高度复杂性，例如在人类血清或其他体液中时，这是不可行的，因为分析将是非常耗时的。
发明内容本发明通过在一种单一标记试剂中组合同位素标记物组件(isotopiclabelcomponent)和同量异序才示i己物纟且4牛(isobariclabelcomponent)克服了现有技术的有限的多通道化。通过产生可以使用的更大数量的差异化标记试剂，组合的样品检测的多通道性被提高。根据本发明的标记工具和方法具有的优点是，差异化标记的肽可以在MS上容易地鉴定，从而将分析限制到感兴趣的肽上。本发明的双标记方法的使用具有的优点是，质谱法的分析时间被显著降低，因为只有在不同样品之间观察到肽的差异化表达的那些肽才需要通过MS/MS来分析。利用本发明的标记方法的工具和方法对于蛋白质样品的多重筛选(multiplescreening)是有兴趣的。更特别地，它们使得同时测定不同蛋白质样品中蛋白质的定量和/或定性差异成为可能。这可以用于测定表达水平方面的差异，以及还容许测定不同的蛋白质样品之间蛋白水解力口工(proteolyticprocessing)方面的差异，例如，在疾病的情境中。就此来说，本发明提供了可以被直接比较的用于不同样品的多重筛选的方法，例如，在比较疾病的不同阶段和/或不同的疾病形式方面。本发明的标记试剂容许进行多通道标记实验，其中仅使用一个标记步骤。虽然所有差异化标记的蛋白质的最终鉴定是由MS/MS保证的，但是蛋白质或肽上同位素标记物的存在容许在MS谱中鉴定所有差异化标记的肽，因为它们将作为不同的独立的峰出现，具有与同位素标记物中的差异相应的质量差异。这容许了将进一步的MS/MS分析限制到在MS步骤中已经被鉴定为被差异化表达的那些肽上。此外，亲和标记物的存在容许进一步将第一MS分析限制到被有效地标记的肽上。本发明的特别的和优选的方面在附随的独立和从属权利要求中列出。从属权利要求的特征可以视情况与独立权利要求的特征以及与其他从属权利要求的特征组合，而不仅仅是如权利要求中明确阐述的那样。本发明的第一方面涉及用于多肽的质谱分析的一组标记试剂，每种标记试剂包含异重标记物组件(allobariclabelcomponent)、蛋白质/肽反应基团、以及包含报告基团(RP)和平衡基团(BG)的同量异序标记物组件(isobariclabelcomponent)。在一个实施方式中，所述异重标记物组件是同位素标记物组件，其不被包含在所述标记试剂的同量异序标记物组件之内。做为选择，异重标记物组件:故包含在标记试剂的同量异序标记物的报告基团和/或平衡基团之内。在本发明的标记试剂的一个实施方式中，所述蛋白质/肽反应基团与蛋白质或多肽中的半胱氨酸残基反应。本发明的特定的实施方式提供了如上所述的标记试剂，进一步包含亲和标签，其任选地是可裂解的(cleavable)。在一个进一步的特定实施方式中，所述亲和标签是生物素，或由其衍生的分子。本发明的一个进一步的方面提供了同时分析不同的样品中包含官能团的一种或多种多肽的存在的方法，其包括标记步骤，其中每种样品用才艮据本发明的一组差异化双标记试剂中的一种来标记，所述标记试剂具有相同的或基本上相同的化学结构并包含异重的和同量异序的标记物組件。该标记步骤通过容许标记试剂的蛋白质反应基团与样品中一种或多种多肽或由其产生的肽(作为例如蛋白水解裂解的结果)的官能团反应来确保。根据本发明的这个方面的方法的进一步的步骤包括，但不限于(2)集中不同的样品来获得多肽样品混合物，(3)从所述多肽样品混合物选择性分离双标记的多肽或肽，和(4)通过质谱法分析分离的标记的多肽或肽的相对出现(relativeoccurrence)。本发明的方法中使用的这组标记试剂一般包括异重和同量异序标记物组件的独特的组合。根据一个实施方式，异重标记组件是同位素标记组件。根据一个特定的实施方式，在以上描述的方法中使用的标记试剂包含亲和标签。根据一个实施方式，本发明的方法进一步在步骤(a)之后包括裂解步骤，从而所述样品中的蛋白质或多肽被裂解成肽。在一个特定的实施方式中，这种裂解用胰蛋白酶进行。根据本发明的这个方面的一个特定的实施方式，步骤c)包括根据标记的多肽或肽上存在的亲和标签选择性地分离所述多肽或肽。在这种方法的一个特定的实施方式中，所述样品中多肽或肽上存在的、与标记试剂的蛋白质反应基团反应的官能团是硫醇(thiol)。根据这种方法的另一个实施方式，所述样品中多肽或肽上存在的、与标记试剂的蛋白质反应基团反应的官能团作为另一种官能团的修饰结果存在。因此本发明的方法任选地包括另外的修饰步骤，其中样品中的多肽或肽被修饰，以获得适合于与在此描述的一组标记试剂的蛋白质反应基团反应的官能团。根据本发明的这个方面的方法的一个实施方式，步骤(c)另外地或可选择地包含通过电泳或层析从这些集中的多肽中分离标记的多肽或肽级分的步骤。根据本发明的这个方面的方法的一个实施方式，步骤(d)包含用MS测定步骤(c)中获得的分离的标记的多肽或肽级分中不同质量的相对数量的步骤。任选地，在本发明的这个方面的方法中，步骤(d)进一步包括使这种分离的标记的多肽级分经历碰撞诱导的解离(CID)并测定其中不同的同量异序标记的多肽的相对数量的步骤。在特定的实施方式中，不同的同量异序标记的多肽的相对数量通过测定CID之后从同量异序标记物释放的报告基团的相对数量来测定。根据一个实施方式，本发明的这个方面的方法进一步包括测定这种多肽的序列的步骤。本发明的一个进一步的方面涉及用本发明的第一方面描述的具有同量异序和异重标记物组件的标记试剂来标记多肽样品的方法，包括使这种标记试剂与样品中多肽上的官能团反应的步骤。本发明的一个进一步的方面涉及如上所述的方法的用途，用于鉴定在不同的生物或实验蛋白质样品中差异化表达的蛋白质，例如，对照个体和不同疾病状况、不同疾病阶段、患有或怀疑患有相同疾病的不同受试者的一种或多种蛋白质样品等等。本发明的再进一步的一个方面提供了来自不同的样品的多肽或肽的混合物，其中来自特定样品的每种多肽或肽包含标记物，所述标记物包含同位素标记物组件和同量异序标记物组件，所述标记物已经通过所述多肽或肽中的官能团与所述多肽或肽连接。在一个实施方式中，其上已经连接了标记物的本发明混合物的多肽或肽的官能团是选自由N-末端上或赖氨酸上的伯胺、天冬氨酸、谷氨酸或C-末端上的羧基基团、以及半胱氨酸上的硫醇基团组成的组的官能团。在一个特定的实施方式中，这种肽的混合物是来自蛋白质样品的胰蛋白酶消化的生物蛋白质的胰蛋白酶肽(trypticpeptides)的混合物。在一个特定的实施方式中，在本发明这个方面的混合物中的肽或多肽上存在的不同标记物的数量至少是4。本发明的一个进一步的方面提供了包含四种或更多种标记试剂的试剂盒，所述标记试剂包含同量异序标记物组件、异重标记物组件和蛋白质/肽反应基团，其中这种试剂盒中的每种标记试剂具有相同的或基本上相同的化学结构以及其中每种标记试剂包含所述异重和同量异序标记物组件的独特的组合。在一个实施方式中，这种试剂盒中的所述标记试剂包含亲和标签。本发明的一个进一步的方面提供了在这些多肽或肽的集中的混合物之内，测定具有相同氨基酸序列的不同样品的单独的多肽或肽的相对数量的方法，其中，在集中之前，来自不同样品的每种多肽或肽用一组差异化双标记试剂中的一种来标记，其中使用的这一组差异化双标记试剂具有相同的或基本上相同的化学结构并带有同位素和同量异序标记物组件，每种标记试剂包含不同的同位素和同量异序标记物组件的独特组合，包括步骤a)任选地，通过液相色谱分离所有标记的多肽或肽，以获得包含具有相同氨基酸序列的所述单独的多肽或肽的分离的级分b)通过第一MS将步骤(a)中获得的多肽或肽的分离的级分分离成进一步的各自具有不同质量的多肽或肽的级分，并测定具有不同质量的每种级分的相对数量，c)使步骤(b)中获得的肽级分在一定条件下进行第二MS,在所述条件下其中所述同量异序标记物组件(和任选地所述多肽或肽)被碎裂(fragmented),并测定每种碎裂的同量异序标记物组件的数量，d)从步骤(c)中测定的每种同量异序标记物组件的相对数量，确定步骤(b)中获得的多肽或肽级分内单独的肽的相对数量，和e)从步骤(b)中测定的具有不同质量的每种多肽或肽级分的相对数量以及从步骤(d)中获得的肽级分内单独的肽的相对数量，计算所述集中的混合物中具有相同氨基酸序列的每种标记的单独的多肽的相对数量。本发明的一个再进一步的方面涉及用于蛋白质样品的多通道标记和分析的设备(IOO),包括至少两个样品源(IOI)、标记单元(103)和各自包含标记试剂的相应的标记物源(104),所述标记试剂包含异重标记物组件、蛋白/肽反应基团和包含报告基团(RG)和平衡基团(BG)的同量异序标记物组件，并进一步包括分离单元(107)、质谱仪单元(108)和数据分析单元(109)。在一个特定的实施方式中，这种设备进一步包括选自由样品制备单元(102)、蛋白质裂解单元(105)和亲和纯化单元(106)构成的组的一种或多种元件。从以下详细说明，结合附图，本发明的上述和其他特征、特点和优点将变得明显；附图通过举例的方式说明了本发明的原理。给出这种描述仅是为了举例说明，而不是限制本发明的范围。以下引用的参考图是指附图。附图1显示了利用可裂解的ICAT试剂用于蛋白分布(proteinprofiles)的定量分析的蛋白质组学流程图(取自Li"a/.(2003)Mo/.Ce/.Proteom.2,1198-1204)。附图2显示了现有技术的可裂解ICAT试剂的示意性结构。附图3显示了iTRAQ标记物(A)和用它标记的肽(B)的示范性的结构。标记物由质量范围为从114到117Da的报告基团和质量范围为从31到28Da的平衡基团组成。附图4根据本发明的一个特定的实施方式显示了标记物，从而同位素标记物组件^皮导入同量异序标记物组件之内，即，通过用石危(附图4B)替换平衡基团中的氧原子(附图4A)。在附图4C中，同位素标记物组件被导入在同量异序标记物组件的报告基团的哌嗪基团的丙基侧链上。的非限制性实例组。附图6展现了根据本发明的特定的实施方式，利用包含同位素和同量异序标记物组件的标记试剂的多个样品的同时分析。附图7显示了根据本发明的一个特定的实施方式，用于8种蛋白质样品的多通道分析的设备(IOO),包括至少两个样品源(IOI)、样品制备单元(102)、具有标记试剂源(104)的标记单元(103)、蛋白质裂解单元(105)、亲和纯化单元(106)(例如，抗生物素蛋白亲和层析系统)、包含两个连续连接的分离系统(1107)和(2107)的分离单元(107)、质谱仪单元(108),以及与读出系统(110)连接的控制和分析电路及数据分析单元(109)。在不同的附图中，相同的附图标记是指相同的或类似的元件。具体实施例方式将针对特定的实施方式和参考某些附图描述本发明，但是本发明并不受此限制而仅由权利要求限制。权利要求中的任何附图标记应不被看做限制范围。描述的附图仅是示意性的而非限制性的。在附图中，为了说明性的目的，某些元件的大小可以被夸大并且没有按比例描绘。当术语"包括，，在本说明书和权利要求中使用时，它不排除其他要素或步骤。在使用不定冠词或冠词时当涉及单数名词例如"a"、或"an"、"the"时，这包括该名词的复数，除非另有其它特别声明。此外，在说明书中和在权利要求中,术语第一、第二、第三等等，是用于区分相似的要素，而不必然描述次序或时间顺序。要理解的是，这样使用的术语在合适的状况下是可互换的，在此描述的本发明的实施方式能够以不同于在此描述或说明的顺序的其他顺序来操作。提供以下术语或定义仅仅用来帮助理解本发明。这些定义不应当被认为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围的范围。如在此使用的那样，术语"多肽"或"蛋白质"是指经由肽键连接的多个天然的或修饰的氨基酸。多肽的长度可以从2个到数千个氨基酸变化(因而该术语还包括通常称作寡肽的物质)。包括在这个范围内的是多肽，其包含一个或多个氨基酸，所述氨基酸通过体内转译后<奮饰(posttranslationalmodifications)例如糖基化、石痒酸化(phosphorylation)等等被修饰，和/或包含一个或多个氨基酸，所述氨基酸已经被蛋白质修饰剂(例如，烷基化剂或乙酰化剂)体外修饰。在此使用的术语"多肽片段，，或"肽"被用于指在蛋白质或多肽的裂解之后获得的氨基酸序列。多肽片段或肽不受大小或性质的限制。术语"内部(internal)"、"氨基末端"和"羧基末端"当涉及肽时，在此使用是指肽在蛋白质或多肽中的相应位置。例如，在蛋白NH2-Xi-K-X2-R-X3-K-X4-COOH(其中X!、X2、乂3和乂4是没有赖氨酸(K)或精氨酸(R)的长度不重要的肽序列(peptidesequencesofindifferentlength))的胰蛋白酶裂解中，氨基末端肽是NH2-X广K-COOH,内部肽是NH2-X2-R-COOH和NH2-X3-K-COOH，和羧基末端肽是NH2-X4-COOH。在此使用的术语"蛋白质裂解"涉及多肽中两个氨基酸之间的肽键的水解。这包括化学水解或酶水解。此使用的术语"碎裂(fmgmentation)"是指破坏一个或多个化学键和随后释放分子的一个或多个部分，如通过例如在串联质谱法(MS)或MS/MS分析中的碰撞诱导的解离(CID)实现。在某些实施方式中，所述键是肽键，但不限于此。在此使用的术语"标记物"是指化合物，其共价连接到肽或多肽并且基于它的特定性质，它是在质谱仪上可检测到的。在标记物可共价连接到肽或多肽的情况下，这通过蛋白质/肽反应基团(PRG)来保证。根据本发明，一种标记物可以包含超过一种"标记物组件(labelcomponent)",即，超过一个基于其特定的性质可差异化地检测到的组件。一般地，术语"标记物"将用于指多肽或肽上存在的分子，术语"标记试剂"用于指与蛋白质或肽反应之前的、未结合的标记物(或用于保证蛋白质或肽上标记物存在的化合物的组合)，即，仍然包含游离的蛋白质/肽反应基团。在此使用的术语"双标记物"和"双标记试剂"是指包含异重(例如，同位素)和同量异序标记物组件两者的标记物或试剂。因此，术语"双标记的"当涉及肽或蛋白质时是指在所述肽或蛋白上包含两种标记物组件的标记物的存在。在此使用的术语"同位素标记物"是指包含原子的一种或多种同位素的标记物。在此使用的术语"异重标记物组件"是指一组分子，其具有基本上相同的结构并且在电泳和层析中表现出同样的行为，但是在一个或多个原子上不同以在质量上产生差异，其可以用作标记物(的一部分)。因而，包含一组异重标记物组件的一组标记试剂或标记物将在质量上具有不同。当一个或多个原子的不同相应于标记物组件包含相同原子的不同的同位素的事实时，指的是"同位素标记物组件"。在此使用的术语"同位素标记物组件"是指一组分子，其具有基本上相同的结构并且在电泳和层析中具有同样的行为，但是在一个或多个同位素上不同以在质量上产生差异，其可以用作标记物(的部分)。各自用包含标记物组件的标记物标记的相同的肽可以在MS中相互区分，其中所述标记物组件具有相同的或基本上相同的化学式，但是基于相同原子的不同同位素(在数量上或类型上)的存在而在质量上不同。在此使用的术语"同量异序标记物组件"是指一组分子，其具有相同的结构和相同的质量，其在碎裂时释放具有相同结构的特定碎片，由于所述同量异序标记物组件内同位素的差异化分布，所述特定碎片在所述组的不同同量异序标记物组件之间在质量上不同。同量异序标记物组件一般地包含报告基团(RG)和平衡基团(BG),其在碎裂时分离并且其显示同位素的差异化分布。一组同量异序标记物组件的"组合的质量"是指该组同量异序标记物组件的报告基团和平衡基团的总质量。术语"报告基团(RG)"是指同量异序标记物组件的在CID时产生碎片离子的部分，作为一个或多个同位素的差异化出现的结果，其在一组同量异序标记物组件内在质量上分别不同。例如，一组同量异序标记物组件内不同的报告基团的特征在于在所述报告基团中12c/13c和/或160/180的差异化出现。在释放报告基团时产生的典型碎片被用于定量用包含同量异序标记物组件的标记物标记的多肽或肽。一般地，报告基团的碎片离子在MS语的低质量区域出现，在这里一般发现不了其他碎片离子。在此使用的术语"平衡基团(BG)"是指同量异序标记物组件的一.部分，其含有特定补偿数量的同位素，以确保所述报告基团和平衡基团的组合质量对于不同同量异序标记物组件是恒定的。在CID时平衡基团可以从标记物上释放或可以不从标记物上释方文。在此使用的术语"官能团，，是指氨基酸上的化学官能，其可以用于与化学化合物结合(一般地，共价结合)。官能团可以存在于氨基酸的侧链上，或多肽或肽的氨基末端或羧基末端上。该术语涵盖天然存在于肽或多肽上的官能团和通过例如使用蛋白修饰试剂的化学反应导入的那些。在此使用的术语"蛋白质/肽反应基团(PRG)"是指化合物(例如，标记试剂)上的化学官能，其能够与蛋白质或肽的氨基酸上的官能团反应，引起这种化合物与氨基酸的结合(非共价的或共价的)。本发明涉及标记试剂，包含同位素和同量异序标记物组件，用于不同蛋白质样品的比较，从而容许产生更大数量的差异化的标记物，用于一个集中的多肽或肽混合物中不同来源的相似的肽的区分。使用本发明的差异化标记试剂，此外可以鉴定集中的样品中蛋白质或肽的存在和相对数量。因此，本发明的方法和工具在其中对比分析令人感兴趣的一组样品的分析中是特别令人感兴趣的。这样的一组样品可以是，但不限于，在不同时间点采集的来自患者的样品、来自疾病的不同临床变型的样品、来自不同患者的样品等等。本发明因而提供了用于鉴定疾病发展的标志物、用于鉴别诊断、和此外用于生物化学或生理分析中的多通道分析的方法和工具。本发明的方法和工具涉及蛋白质样品的分析。在此使用的术语"样品，，不是意图必然地包括或排除在实施本发明的方法之前的任何加工步骤。样品可以是粗的未加工的样品、提取的蛋白质级分、纯化的蛋白质级分等等。如以上所指出的，蛋白质存在于所述样品中。根据一个实施方式，所述蛋白质样品通过丰量蛋白质的免疫耗竭(immunodepletionofabundantproteins)来预先力口工。适合于用本发明的标记试剂和方法分析的蛋白质样品包括病毒、原核生物、细菌、真核生物、真菌、酵母、植物、无脊推动物、脊推动物、哺乳动物和人类来源的样品。样品的制备取决于所研究的生物体、组织或器官而不同，但是标准方法通常是可获得的并且是本领域技术人员已知的。对于哺乳动物和人蛋白质样品，它涵盖培养的细胞、激光微解剖的细胞、身体组织、体液或其他感兴趣的相关样品的分离。对于样品中蛋白质的分级，细胞裂解(lysis)是细胞分级和蛋白质纯化中的第一步骤。许多技术可用于破坏细胞，包括基于物理、酶和洗涤剂的方法。历史上，物理裂解是所选择的用于细胞破坏的方法；(匀质化、渗透裂解、超声细胞破坏)；然而，它通常需要昂贵的、笨重的设备，并且由于仪器中的变化性(例如，松散装配的与紧密装配的匀质化钵锤的比较)而涉及有时难以重复的方案。近年来，洗涤剂基裂解由于容易使用、低成本和高效的方案变得非常受欢迎的。哺乳动物细胞具有质膜，一种形成分隔细胞内含物和细胞外环境的屏障的蛋白-脂质双分子层(protein-lipidbilayer)。构成质膜的脂质是两亲性的，具有亲水性和疏水性部分，其自发地締合来形成闭合的双分子片层。膜蛋白包埋在所述脂质双分子层中，通过跨越疏水核心的一个或多个结构域(domains)保持就位。此外，外周蛋白(peripheralprotein)通过与整合月莫蛋白(integralmembraneprotein)或与才及性月旨质质内容物的性质根据细胞类型而变化。明显地，选择用于破坏细胞的技术，无论是基于物理的还是基于洗涤剂的，都必需考虑被检查的细胞或组织的来源，以及在破坏它们的外层方面的固有的容易度或难度。此外，所述方法必需与要加工的材料的数量和预期的下游应用相适合。在特定的实施方式中，蛋白质提取还包括来源于不同区室的细胞蛋白质(例如，细胞外蛋白、膜蛋白、细胞胞浆蛋白(cytosolicproteins)、核蛋白(nuclearproteins)、线粒体蛋白(mitochondrialproteins))的预分级。其他预分级方法根据物理性质例如等电点、电荷和分子量来分离蛋白质。根据一个特定的实施方式，利用合适的试剂(例如，盐酸胍盐(guanidiniumchloride)、尿素、酸(例如，0.1%trifluoricacid)、碱(例如，50%吡咬)和离子或非离子洗涂剂)在标记或裂解之前预处理所述样品，以便使蛋白质变性以实现优化试剂或蛋白酶接近。此外，如下文将详述的，取决于标记试剂中蛋白质反应基团的类型，本发明的方法设想在本发明的标记方法之前，所述官能团被不可逆或可逆地用蛋白质修饰试剂来修饰。实例是封闭的氨基末端的释放、胱氨酸向半胱氨酸的还原、封闭半胱氨酸的官能硫醇基团、将赖氨酸的胺基团乙酰化，等等。因而本发明的方法任选地包括样品的预处理，其可以在包含上文列出的一种或多种样品制备方法的预处理步骤中进行。因此，适合于本发明的方法的设备任选地包含样品制备单元，其包含适合于样品制备的一个或多个设备，例如超声处理设备，层析系统(亲和、凝胶过滤)，超滤单元，离心机，具有緩冲液、酶、洗涤剂等的输送系统的控制温度的反应小瓶。根据本发明，提供了工具和方法，其容许仅用一个标记步骤而实现多标记。根据本发明，这通过将适合于MS中差异检测的两种类型的标记物组件组合到一种标记试剂中，从而实现基于标记物组件的组合的一组差异化标记试剂来实现。根据一个实施方式，本发明的标记试剂包含一个来自一组同量异序(相同质量)标记物组件的标记物组件，和一个来自一组异重(不同质量)标记物组件的标记物组件。根据本发明，所述标记试剂的异重标记物组件是质量上相互不同的组件，作为其结果，包含它们的标记试剂将在质量上具有不同。因此，这些组件为它们所结合的肽/蛋白质带来不同的质量。尽管如此，本发明的异重标记物组件对它们所结合的肽或蛋白质的层析或电泳行为具有基本上相同的影响。根据一个实施方式，所述异重标记物组件是这样的组件，其具有基本上相同的化学结构，但是其中一个原子被另一个原子以所述标记物的结构被最低限度地改变的方式取代。因此，用包含这种异重标记物组件的一组标记试剂标记相同的肽将产生在质量上具有轻微的(预定)差异(其因而可以在MS中被鉴定)，但是其在MS分析之前的例如层析或电泳行为方面没有不同的肽。根据一个可选择的实施方式，本发明的标记试剂的异重标记物组件是同位素标记物组件，即，通过差异化的同位素组成确保一组的不同试剂之间质量上的差异。因此，在这个实施方式中，本发明的标记试剂包括同位素标记物组件、同量异序标记物组件和蛋白质反应基团。任选地，所述标记试剂进一步包含亲和标签。一般地，所述同位素标记物组件和所述同量异序标记物组件构成标记试剂的两个独立的部分。然而，如以下描述的那样，同位素标记物组件也可以^^皮包括在同量异序标记物组件之内。在本发明的标记试剂中不同的同位素和同量异序标记物组件的组合容许在一个组中有更多数量的差异化标记试剂，即，用于样品的差异化标记，从而在样品集中之后，可以鉴定样品的来源。例如，当不同的同位素标记物组件的数目是2、同量异序标记物试剂的数目是4时，总共可以产生2x4=8种标记物组件组合，因而可以产生8种差异化标记试剂。在这个实例中，标记试剂组将包含4种标记试剂的2个小组，其中这2个小组在质量上相互不同(由于差异化同位素标记)，而在每个小组内，4种标记试剂将是同量异序的，即，具有相同的质量，但是在MS/MS中产生具有不同质量的报告基团。因此，用这组标记试剂标记的不同来源的相同的肽可以被鉴定为，首先在MS中，相应于同位素标记的肽的两个小组的两个峰，其当在MS/MS中进一步分析，将各自进一步产生4个峰，相应于同量异序标记物组件的不同的报告基团。根据一个实施方式，在本发明的组合的同位素/同量异序标记试剂中使用的同位素标记物组件包括这样的结构，其中在所述同位素标记物组件中的一个或多个原子被稳定的同位素替代，以产生具有相同化学式的，但是其根据它们在质量上的差异是同位素可区别的一种或多种化合物。例如，同位素标记物组件中的氪、氮、氧或>5危原子的任何一个或多个都可以用它们的同位素稳定的同位素2H、13C、15N、170、"0或"S分别替换。例如，氢用氘替代，或碳"C用"C替代。利用多于一个的上述同位素，可以产生2、3、4、5、6、7、8或更高数量的同位素标记物组件，各自具有相同的结构但是具有不同的分子量。如以上所指出的，这些标记物组件之间的分子量的差异，在每种标记试剂在不同样品中的相同多肽上结合时，反映在由此产生的多肽或肽的所得到的分子量上。可以通过一个或多个同位素的差异化导入而可以作为同位素标记物组件的基团的实例包括但不限于醚、聚醚、醚二胺、聚醚二胺、二胺、酰胺、聚酰胺、聚硫醚、二硫化物、甲硅烷基醚、烷基或烯基链(直链、支链或具有环状的部分)、芳基、二芳基或烷基-芳基基团。在特定的实施方式中，在本发明的标记试剂的同位素组件中存在的芳基基团含有一个或多个杂原子(例如，N、O或S原子)。根据一个特定的实施方式，所述标记试剂的同位素标记物组件是这样的-它在(MS)11分析期间不经历类似肽的碎裂。为了促进电离(ionization),同位素标记物组件，更特别地是其中的同位素基团，可以含有这样的基团或部分，例如酸性或碱性基团，例如，COOH、S03H、伯、仲或叔氨基、氮-杂环、醚，或这些基团的组合。在特定的实施方式中，所述同位素标记物组件含有具有永久电荷的基团，例如，磷镥基团、季铵基团、锍基团、螯合的金属离子、四烷基或四芳基硼酸盐(tetralkylortetrarylborate)或稳定的负碳离子(carbanions)。根据一个实施方式，本发明的标记试剂的同位素标记物组件的结构相应于通式-BLxL(CH2)n-[X2-(CH2V]x-X3-(CH2)p-X4-B2-其中國X1、X2、X3和X4相互独立地选自O、S、NH、NR、NRR'+、CO、COO、COS、S國S、SO、S02、CO國NR'、CS画NR'、Si画O、芳基或二芳基基团。(R是烷基、烯基、炔基、烷氧基或芳基基团，R'是氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基或芳基基团)。在特定的实施方式中，X^X4不存在，但一般存在X^X"的至少一个。-n、m、p和q是值为从0到约100的整数。在特定的实施方式中，n、m、p或q之一不是0,x也是从0到约100的整数，其中n+xm+p+q的和低于约100,在更特定的实施方式中，低于约20;以及-8〗和B卩相互独立地是任选的部分，其有助于标记试剂中的其他部分(例如，亲和标签，或如下所述的蛋白/肽反应基团)与同位素标记物组件的结合，或防止那些连接体(linkers)从同位素标记物组件的非期望的裂解，并且，选自例如COO、CO、CO-NR'、CS-NR',以及任选地单独地或与其他基团组合含有一个或多个CH2基团，例如(CH2)q-CONR'、(CH2)q國CS陽NR'或(CH2)q,在特定的实施方式中，具有如上所述的结构的同位素标记物组件的CH2基团的一个或多个，任选地被小(d-C6)烷基、烯基或烷氧基、20芳基基团取代，或被促进电离的官能团取代，例如，酸性或碱性基团，或带有永久正或负电荷的基团。在特定的实施方式中，在连接体中连接CH2基团的一个或多个单键被双键或三键替换。在特定的实施方式中，R和R'烷基、烯基、炔基或烷氧基是小的，具有1到约6个碳原子。根据一个特定的实施方式，本发明的同位素标记物组件由一个或两个原子组成，其被掺入标记试剂的另一部分的侧链中或是所述侧链，最特别地是所述同量异序标记物组件。以下将更详细地描述这个实施方式。本发明的标记试剂，除了以上描述的异重或同位素标记物组件之外，进一步包含同量异序标记物组件。根据一个实施方式，所述同量异序标记物组件包括报告基团(RP)和平衡基团(BG)，其中报告基团的质量对于每个同量异序标记物组件(在一组标记试剂之内)是特定的，并且不同的同量异序标记物组件的报告基团和平衡基团的总质量保持恒定。根据一个特定的实施方式，所述同量异序标记物组件的一般结构可由通式RP-X'-BG-Y'-代表，其中报告基团(RP)是同量异序标记物组件的末端部分，一般也是标记试剂的末端部分(见下文)。X'和Y'都代表键或连接。根据一个可选择的实施方式，所述报告基团是在同量异序标记物组件的内部，所述标记试剂内的同量异序标记物组件的一般结构可由通式-X'-RP-X'-BG-Y'-表示。同量异序标记的概念在附图3中举例说明。附图3A提供了同量异序标记物组件的实例。在这个实施方式中，同量异序标记物组件由基于N-甲基哌溱的报告基团和其是羰基的质量平衡基团组成。在附图3B中，同量异序标记物组件通过是NHS酯的肽-反应基团直接结合到肽。虽然报告基团的质量对于组内的每个同量异序标记物组件是特定的，但是不同的同量异序标记物组件的报告基团和平衡基团的总质量保持恒定。根据一个特定的实施方式，一组标记试剂的不同的同量异序标记物组件中报告基团的差异质量，如所示出的那样通过使用13C、"N和180原子的差异化同位素富集来实现，以避免涉及氘替换的富集所观察到的层析分离问题。鉴于不同的同量异序标记物组件的相同的结构，21在环中富集的中心(centers)的数量和位置对于层析或MS行为没有影响。因而同量异序标记物组件可以通过酰胺键直接结合到肽或同位素基团。在附图3中，同量异序标记物组件的侧面连接有蛋白质反应基团，其是胺特异性反应基团。这种标记试剂的胺特异性反应基团与肽反应之后，标记物就变得经由酰胺键与胺官能团(N-末端或赖氨酸的胺基团)连接。这些酰胺键当经历CID时以与主链肽键类似的方式碎裂。来碎裂肽的其他适合的方法包括CAD(碰撞激活的解离)、ETD(电子传递解离)、ECD(电子俘获解离)、IRMPD(红外线多光子解离)和BIRD(黑体红外线辐射离解)。在经历CID时在酰胺键的碎裂之后，平衡(羰基)部分丢失(中性丢失)，而电荷被报告基团碎片保留。在附图3A中，括号中的数字表明分子的每个部分中富集的中心的数量。附图3的部分B说明了使用包含四种不同的报告基团质量的四种同量异序组合的标记。各自用多通道组中的一个成员标记的四种相同肽的混合物在MS中表现为单一的、不可分辨的前体离子(相同的m/z)。在CID之后，四种报告基团离子表现为不同的质量(114-117Da)。所有其他的序列情报性碎片离子(b-,y-,等等)保持同量异序，并且它们的单度的离子电流信号(信号强度)是加和的。肽的相对浓度因而可以从相应的报告离子的相对强度推出。当使用本发明的标记试剂时，因此在MS/MS阶段进行定量，而不是在MS中。如以上所指出的，同量异序标记物组件的报告基团RP是具有可以被测定的独特质量(或质量与电荷比)的基团。因此，一组同量异序标记物组件(或相应的标记试剂)的每个报告基团具有独特的质量。在特定的实施方式中，一组同量异序标记物组件的每个报告基团包含一个或多个重原子同位素以实现独特的质量。举例来说，碳(12〇、13C和14C)、氮("N和"N)、氧(160和180)或氢(氬、氛和氚)的同位素可以用于制备不同的报告基团。适用于报告基团中的稳定"重"原子同位素的实例包括"C、15N、180和氖。这些不是限制性的，因为其他轻和重原子同位素也适合于掺入报告基团中。适合用于制备包含轻和重原子同位素的报告基团的基础起始材料可以从各种商业的来源，例如CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec获得。根据一个实施方式，报告基团质量范围是从w/z114.1到117.1,而平衡基团质量范围是从28到31Da,从而对于四种试剂的每一种组合质量保持恒定(145.1Da)。根据本发明，本发明的标记试剂的同量异序标记物组件的独特报告基团被用于鉴定和定量不同样品中的肽。在一个特定的实施方式中，所述独特报告基团作为样品的一种或多种多肽上的标记物的部分保持存在。这样，关于报告基团的信息与关于样品的标记的多肽的信息关联起来。做为选择，然而，如在上文描述的实例中，在其鉴定之前，报告基团被从标记的多肽上除去。因而，在测定报告物(reporter)的时候，报告基团不必物理连接到(多)肽。实际上，根据这个实施方式，报告物的独特质量是，例如，在串联的质量分析器的第二质量分析中测定的，在标记的(多)肽的离子被碎裂以产生(多)肽的子碎片离子和可检测的报告基团之后。特定的报告基团被用于鉴定特定(多)肽所来源的样品。进一步的，测定的独特报告基团的量，相对于其他报告基团的数量或相对于校准标准(例如，用特定报告基团标记的多肽)，任选地被用于确定一个或多个所述样品中多肽的相对或绝对数量(通常表示为浓度和/或量)。因此，在用于标记每个特定样品的每种标记试剂的同量异序组件中存在的报告基团提供了不同类型的信息，例如，特定样品中一种或多种多肽的数量。报告基团包含固定的电荷，或者能够被电离。因此，包含同量异序标记物组件的标记试剂被用于标记盐或两性离子形式的反应性多肽。报告物的电离便于它在质谱仪中的测定。因此，在特定的实施方式中，所述报告基团被测定为离子，有时称为"标志离子(signatureion)"。当电离后，报告物包含一个或多个净正电荷或负电荷。举例来说，报告基团包含一个或多个碱性氮原子(正电荷)或一个或多个可离子化的酸性基团例如羧酸基团、磺酸基团或磷酸基团(负电荷)。包括碱性氮的报告基团的非限制性的实例包括取代的或未取代的吗啉、旅咬或旅。秦。在特定的实施方式中，报告基团是5、6或7元杂环，包含用取代的或未取代的乙酸部分N-烷基化的环氮原子，多肽通过N-烷基乙酸部分的羰基碳连接到其上，其中每种不同的同量异序标记物包含一个或多个重原子同位素。这种杂环是被取代的或未取代的。杂环是脂肪族或芳香族的。杂环部分的可能的取代基包括烷基、烷氧基和芳基基团。取代基包括被保护的或未被保护的基团，例如，胺、羟基或硫醇基团，适合于将多肽连接到支持物(support)。在特定的实施方式中，所述杂环包含另外的杂原子，例如一个或多个氮、氧或硫原子。在特定的实施方式中，选择所述报告基团，从而它在用于多肽的分析例如电泳或层析的典型条件下基本上不发生副碎裂(sub-fmgment)。在其他特定的实施方式中，选择报告基团，从而它在解离能量的条件下基本上不发生副碎裂，其中所述解离能量被施加以在质谱仪中引起标记的多肽的至少一部分选定的离子的键X'和Y'碎裂。任选地，选择报告基团，使得报告基团的最后的碎片利用MS分析在背景噪声之上难以或不可能检测。在特定的实施方式中，报告基团的质量被有意地选择，从而与要测定的多肽的质量或多肽的任意预期碎片的质量相比是不同的。例如，选择报告物的质量，以与任何天然存在的氨基酸或肽、或其预期的碎片相比是不同的。这便于多肽鉴别，因为取决于多肽，具有同样的一致质量的样品的任何可能组分的缺乏，为任何分析结果都增加了置信度。在本发明的标记试剂的特定实施方式中，所述同量异序标记物组件的报告基团是非聚合的小分子。在进一步特定的实施方式中，报告物的质量是低于250道尔顿。这种小分子在第二质量分析中容易测定，没有第一质量分析中具有相同的一致质量的样品的其他组分。在这方面，第二质量分析一般地在串联质谱仪中、对在第一质量分析中测定的选定离子实施。由于特定的质量电荷比的离子被从第一质量分析中特别地选择出来以进行可能的碎裂和进一步的质量分析，所以来自第一质量分析的未选择的离子不被带向笫二质量分析并因而不会污染第二质量分析的谱系。此外，质谱仪的敏感性和检测器的线性度(对于定量来说)在这种低质量范围上是非常稳固的(robust)。另外，质谱仪技术的当前状态在这个质量范围内容许低于一个道尔顿的基线质量分辨率。在本发明的标记试剂的同量异序标记物组件中，平衡基团(BG)将报告基团连接到同位素标记物组件上或蛋白质反应基团上。在特定的实施方式中，选择平衡基团以当键X'和Y'被碎裂时产生中性物种(即，当键X'和Y'碎裂时经历中性损失)。在特定的实施方式中，所述平衡基团是非常小的部分，例如羰基或硫代羰基基团。例如，平衡基团包含至少一个重原子同位素并包含式_CH2-CO-CH2-、CH2-CS-CH2-、ch2-CNH-ch2-或CH2-CHRLcH2-,其中W是相同的或不同的，并且是任选地含有杂原子的包含一到八个碳原子的烷基或取代的或未取代的芳基基团，其中所述烷基和芳基基团的碳原子独立地包含连接的氢、氘和/或氟原子。在特定的实施方式中，所述平衡基团是更大的部分。举例来说，所述平衡基团是聚合物或生物聚合物。在特定的实施方式中，所述平衡基团被设计成当经历解离能量水平时发生副碎裂，包括副碎裂来借此只产生平衡基团的中性碎片。一般地，在本发明的标记试剂中同量异序标记物组件的平衡基团包含一个或多个重原子同位素，从而它的质量补偿报告基团之间的质量差异，以获得该组中每个同量异序标记物组件具有相同的质量。报告基团/平衡基团组合的集合质量(即，作为一个整体的质量)对于每种同量异序标记物组件是相同的，因而来自不同的样品、并用包含同量异序标记物组件的才艮据本发明的一组不同标记试剂来标记的相同的多肽或肽的质量将是相同的。用包含相同的同位素标记物组件、^旦不同的同量异序标记物组件的相同组的标记试剂标记的相同的肽或多肽是等重体(isobars),即，具有相同的重量。因此，在质谱仪中如果从集中的样品混合物的初始质量分析选择具有特定的质量电荷比的离子，那么这种选择的离子含有来自所述集中的样品混合物中那些样品的相同的多肽，其是用包含相同的同位素标记物的标记试剂标记的，其比例相应于样品混合物中它们各自的浓度和/或数量。由于平衡基团用作同量异序标记物组件中报告物的质量平衡，所以报告基团/平衡基团组合的集合质量对于一个组的或试剂盒的所有标记试剂都是相同的，平衡(和报告)基团中的原子数量越多，可以产生的不同的同分异构/同量异序标记物组件的可能数量就越大，即，可以获得的与同位素标记物组件的组合数目越大，导致了一组之内或试剂盒之内提高的标记试剂数目。一般地，报告基团不是限制性因素，平衡基团包含的原子的数量越大，则存在的潜在报告/平衡基团组合的数目越大，因为同位素至多可以代替平衡基团中的任何位置，从而产生平4軒基团部分的一组同分异构体或等重体，其中平衡基团部分被用于补偿报告物部分的不同质量，从而产生一组报告/平衡基团同分异构体或等重体。这样的标记试剂组分的各种组特别适合于相同和/或不同样品中多肽的多通道分析。可以用于产生根据本发明的同位素/同量异序标记试剂的组合的不同的同量异序标记物组件的总数是两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多。由于本发明的双标记试剂包含同量异序和同位素(或异重)标记物组件的不同组合，一组中的标记试剂的总数将由组内不同的标记物组件的数目的乘积来决定。同位素标记物组件的数目通常是有限的，一般是2，因而导致一组内双标记试剂的总数是同量异序标记物组件的数目的两倍。同量异序标记物组件的多样性由报告基团和平衡基团部分的原子数目、能够代替轻同位素的重原子同位素、以及其中可以合成同位素的各种合成配制(syntheticconfigurations)来决定。如所提及的那样，许多同位素富集的基础起始材料可以容易地从生产商例如CambridgeIsotopeLaboratories和Isotec获得。这种同位素富集的基础起始材料被用于合成过程，所述合成过程用来生产同量异序的和同分异构的标记物组件的组，或用来生产同位素富集的起始材料，所述起始材料被用在用于生产同量异序的和同分异构的标记物组件的组的合成过程中。根据本发明的同量异序标记物组件的制备至少部分地相应于在WO2004070352的实施例中公开的同量异序标记试剂的制备。在本发明的组合的同量异序/同位素标记试剂中，同量异序标记物组件的报告基团和平衡基团通过称为X'和Y'的键相互连接并任选地连接到同位素标记物组件和/或蛋白质/肽反应基团，其中X'是报告基团的原子与平衡基团的原子之间的键，Y'是平衡基团的原子与同位素标记物组件和/或标记试剂的蛋白质/肽反应基团的原子之间的键。在特定的实施方式中，当经历解离能量水平时，各种同量异序标记试剂的键X'和Y'被解离。因此，在本发明的方法的特定的实施方式中，调整质谱仪中的解离能量水平，从而键X'和Y'在同量异序标记的多肽或肽的选定离子的至少一部分中被离解。当报告基团位于标记试剂的末尾时，键X'的碎裂从多肽上释放报告基团，从而报告物独立于所述肽或多肽是可检测的。当平衡基团通过键Y'连接到多肽或肽时，键Y'的碎裂将报告基团/平衡基团组合从多肽或肽上释放，或将平衡基团从所述多肽上释放，取决于键X'是否已经被碎裂。同量异序标记物的报告基团一般作为本发明的双标记试剂的末端部分存在。在这种情况下，只需要破坏报告基团和平衡基团之间的一个键(X')来释放报告物。然而在特定的实施方式中，报告基团是本发明的双标记试剂中的内部分子，从而侧面键(flankingbonds)是这样的-它们容许在CID之后从标记试剂释放报告基团。按照相同的方式，在本发明的双标记试剂的特定实施方式中同量异序标记物组件的分布被设想相应于同量异序标记试剂的经典设计，从而报告基团和平衡基团相互邻近地设置。本发明的双标记试剂的可选择的实施方式包括通过双标记试剂的其他部分相互分离的报告物和平衡基团，例如，通过同位素标记物组件。然而在所有的实施方式中，平衡基团的质量都补偿报告基团的质量。在特定的实施方式中，键Y'比键X'更不稳定。在其他特定的实施方式中，键X'可以比键Y'更不稳定。在又其他的特定实施方式中，键X'和Y'具有相同的相对不稳定性。在特定的实施方式中，键X'和Y'的相对不稳定性是关于酰胺(肽)键来调整的。键X'、键Y'、或键X'和Y'两者，与典型的酰胺(肽)键相比，在这样的情况下是更不稳定的、等同不稳定的或更稳定的。举例来说，在解离能量的条件下，与Z-Pro二聚体或Z-Asp二聚体的肽键相比，键X'和/或键Y'较少倾向于碎裂，其中Z是任何天然氨基酸，Pro和Asp分别是脯氨酸和天冬氨酸。在某些实施方式中，键X'和Y'将在与典型的酰胺键大约相同的解离能量水平下断裂。在某些实施方式中，与典型的酰胺键相比，键X'和Y'将在更高的解离能量水平下断裂。在其他特定的实施方式中，选择键X'和Y',从而键Y'的碎裂诱导键X'的碎裂，反之亦然。这样，键X'和Y'基本上同时碎裂，从而在笫二质量分析中，没有实质数量的多肽或肽、或其子碎片离子包含部分标记物。实质数量的多肽是指在MS/MS镨中测定的、低于25°/0、甚至低于10%的部分标记的多肽。由于在笫二质量分析(MS/MS)谱中多肽的标记的和未标记的碎片之间可以有清楚的界限，所以这个特征简化了基于子碎片离子谱的计算机辅助分析的多肽鉴定。此外，在某些实施方式中，由于多肽的碎片离子是用报告/平衡基团部分完全标记的或是未标记的(但不是部分标记)，因此只有;f艮少的或没有由跨断裂的键的同位素分布所引起的子碎片离子质量的分散，例如，当同位素存在于在27第二质量分析中通常测定的部分标记的多肽的单个不稳定键的每一侧时就是这种情况。本发明的标记试剂和要标记的蛋白质或肽之间的反应由蛋白质/肽反应基团的存在来确保。标记试剂上的蛋白质/肽反应基团(PRG)是与某些蛋白质或肽官能团选择性反应的基团，或是感兴趣的酶的底物(substrate)。适合的蛋白质/肽反应基团和它们与之反应的官能团的实例在以下提供-硫醇反应基团与半胱氨酸的側链反应。硫醇反应基团包括环氧化物、a-卣素酰基基团、腈、磺化的烷基或芳基硫醇、卣代烷、芳基酰胺和马来酰亚胺类。特定的实例是碘乙酰胺或其衍生物。-氨基-反应基团与赖氨酸的侧链的s胺基团反应，或与在多肽的N-末端处的胺反应。氨基反应基团结合蛋白质中的氨基，包括磺酰卣、异氰酸酯、异硫氰酸酯、活性酯，包括四氟苯基酯、五氟苯基酯、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基酯、2-硝基苯基酯、4-硝基苯基酯、2,4-二硝基苯基酯和2,4-二卤代苯基酯、酰基卤、和酸酐和混合酸酐。此外，氨基反应基团包括醛或酮，在存在或不存在NaBEU或NaCNBH3的情况下。-羧酸反应基团与天冬氨酸和谷氨酸的侧链反应，或与多肽的C-末端反应。羧酸反应基团包括胺或醇，在存在偶联剂例如二环己基碳二亚胺、或三氟乙酸2,3,5,6-四氟苯基酯的情况下，以及在存在或不存在偶联催化剂例如4-二曱基氨基吡啶的情况下；和过渡金属-二胺络合物，包括Cu(II)菲咯啉。-咪唑类反应基团与组氨酸反应。-酯反应基团包括胺，例如，其与高丝氨酸内酯反应。曱疏氨酸在CNBr裂解期间转化成高丝氨酸内酯。画石岸酸酯反应基团(phosphatereactivegroup)与石奔酸化的氨基酸例如磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸反应。磷酸酯反应基团包括螯合的金属，其中金属是例如Fe(III)或Ga(III),螯合到例如次氮基三乙酸(nitrilotriacetiacacid)或亚氨基二乙酸。这些试剂与磷酸化的氨基酸反应(例如，磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸)。画醛或酮反应基团包括胺加NaBH4或NaCNBH3，或首先用高碘酸盐处理碳水化合物之后产生醛或酮的这些试剂。-羟基反应基团与丝氨酸和苏氨酸反应。羟基反应基团包括三苯甲基卣化物或曱硅烷基卣化物反应部分，其是被取代的或未被取代的。本发明的双标记物通过标记试剂的蛋白质/肽反应基团与所述蛋白质或肽内存在的官能团之间的相互作用连接到蛋白质或肽。这种官能团可以由于存在于样品中而预先存在于多肽中，或可以在其上产生，任选在所述多肽的分离之后。例如，羧酸基团可以用水溶性的碳二亚胺(例如，l-(3-二曱基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；EDC)修饰从而来获得与亲核试剂例如胺基团反应的亲电子基团。使用EDC的标记试剂的羧酸基团的活化可以在存在胺的情况下进行。与NH2-CH2-CH2-NH2组合利用碳二亚胺类容许将羧基基团转变成胺基团。与NH2-CH2-CH2-SH组合利用EDC确保了羧基基团向硫醇基团的转变。适合于修饰多肽或在多肽上引入官能团的其他化合物的非限制性列表包括2-氨基乙基-2'-氨基乙疏醇-磺酸盐(2画Aminoethyl-2'-aminoethanethiol國sulfonate),其是将石危醇基团转化成还原剂可裂解的胺基团的硫醇反应性胺化试剂(thiol-reactiveaminationreagent);氨基乙基-8试剂，其将游离硫醇转化成伯胺基团；将硫醇基团修饰成为羧基基团的BMPA;MSA,其是具有潜在的羧基基团的胺反应性的(它将胺转变成被保护的羧基。羧基在磷酸盐緩冲液中在pH9.5被去屏蔽(unmasked));与伯胺反应来添加被保护的硫醇的SATA;羟胺HCl(HydroxylamineHC1),其是对于解封闭SATA和SATP修饰的蛋白质来产生游离>5危醇高度有效的试剂，以及Traut，s试剂，其是在pH7-10下与伯胺反应来引入硫醇基团的水溶性试剂。这些试剂可以获自例如PierceChemicals(IL,USA)。还设想的是，通过除去保护基团在肽或多肽中产生一个或多个官能团。因此，在特定的实施方式中，多肽中的官能团被改变或添加。在特定的实施方式中，添加的官能团是在蛋白质中不天然出现的基团。在本发明的情境中适合的双标记试剂的其他实施方式中，PRG基团实际上是特定的蛋白质修饰酶的底物。这种酶可以是体内翻译后修饰中涉及的酶。这些酶中的某些与疾病状态或出生缺陷相关。关于这些的实例是酸性磷酸酶(acidphosphatase)、碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、淀粉酶、血管紧张素转化酶(angiotensinconvertingenzyme)、天冬氨酸转氨酶、肌酸激酶、Y-谷氨酰转移酶、脂肪酶、乳酸脱氪酶和葡萄4唐-6-石寿酸酉旨脱氛酵(glucose-6-phosphatedehydrogenase)、蛋白酵和酉旨酶。根据本发明的标记试剂的特定的实施方式，所述同位素标记物组件和所述同量异序标记物组件构成标记试剂的不同部分，由4建分隔。根据这些实施方式的适合的同位素和同量异序标记物组件如上所述。然而，为了简化试剂的制造，特别是同位素的掺入，同位素标记物组件的同位素可以掺入标记试剂的另一个部分之中或之上，更特别的，掺入同量异序标记物组件之中或之上，在其报告基团中或平衡基团中。根据一个特定的实施方式，同量异序基团的平衡基团具有结构-C-CO-C-(参见附图3)(例如商业上可获得的同量异序标记物)，或更大的基团，例如上文所描述的那些，例如-CH2-CHR^CH2-,其中W是相同的或不同的，并且是包含一到八个碳原子的烷基，其包含同位素标记物组件，其任选地是杂原子，或取代的或未取代的芳基基团，其中所述烷基和芳基基团的碳原子独立地包含连接的氢、氘和/或氟原子。为了使同量异序标记物组件的平衡基团也起同位素标记物组件的作用，这种-CHb-CHR1-CHb-基团一方面带有所需数量的同位素来提供与报告基团的平衡，另一方面含有所需数量的同位素替换以在一个组中产生不同标记试剂之间的质量差。做为选择，单独的标记试剂之间的质量差通过用其他原子改变标记试剂中的一个或多个原子来获得，从而确保标记试剂的化学结构和物理化学特征被最小地改变，来确保在MS之前，即在电泳或层析期间，不考虑连接的标记物，差异化标记的相同的肽的基本上相同的行为。举例来说，设想一组8种标记试剂，其中一组4种标记试剂具有同量异序标记物组件，包含氧，如附图3中描绘的那样。在另一组4个标记试剂中，同量异序标记物组件中的氧原子被硫替换，参见附图4,以和附图3中所示相同的方式通过用34S替换32S来获得平衡。这种改变对同量异序标记物组件质量的影响在表2中说明。30表2:通过同量异序标记物的平衡基团结构的改变产生质量差异。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>通过用硫替换标记物中的单个碳获得的双标记的肽之间的轻微的化学差异将仅改变这样的肽在分离系统如液相层析上的行为到有限的程度。碳和硫的质量之间的差异容许根据它们的质量分离两组标记的肽。对于这两个组的每一个，将在MS/MS中照常产生不同的报告基团。在本发明的另一个实施方式中，差异化标记试剂之间的质量差异通过在同量异序标记物组件的报告基团中掺入另外的同位素来获得。在附图3中描绘的同量异序标记物组件中，另外的氘原子可以掺入甲基-哌溱基团中，来产生附图3的标记物的同位素标记物。然而，当设想利用具有3种或更多不同质量的标记试剂组的更高的多通道化时，曱基哌嗪基团变得太小而不能携带所有这些额外的同位素。因而，作为实例，标记试剂被提供有丙基哌。秦基团(参见附图4C),其中掺入不同的氘和13C同位素。表3显示了具有丙基哌"秦基团的一组8个标记试剂的报告和平衡基团的质量，其中质量差通过在丙基侧链中掺入两个"C和两个2！1同位素来获得。表3:通过同量异序标记物的报告基团的改变产生质量差异。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>如表3中呈现的标记物的这种设计具有的优点是，报告基团的质量对于集中的样品中每种标记的肽都是独特的，并充当了内部对照。类似地，如上文对平衡基团所阐述的那样，单独的标记试剂之间的质量差异也可以通过用另一个原子替换报告基团中的原子来获得，只要结构和物理化学性质的改变是最小限度的。概括起来，通过在常规同量异序标记物组件的报告基团和/或平衡基团之内提供同位素标记物组件，不需要在标记试剂中设计独立的部分来用于掺入同位素。在特定的实施方式中，本发明的双标记试剂包含亲和标签(A),其容许选择性地分离已经与标记试剂反应的、即已被标记的那些多肽。虽然亲和标签原则上可以存在于试剂上的任何位置，但它一般位于不影响报告基团在CID后的释放的位置。在特定的实施方式中，亲和标签位于同位素标记物组件的侧链上。虽然亲和标签可以是大体积的，但它们可以用可裂解基团结合到标记试剂。一般地，在片企测之前亲和标签被从多肽上的标记物上除去，仅留下标记物上的疤痕。如以上所指出的，在本发明的双标记试剂中亲和标签的存在，容许标记的肽或多肽的选择性结合，结合为共价地或非共价地并具有对捕获试剂(CR)的高亲和力。一般地，亲和标签与捕获试剂的结合是强的，从而它对使用多种溶液的任一种或组合的大量的和/或多次的洗涤具有抗性，这确保了除去没有特异性结合到捕获试剂上的肽或多肽。一般地，亲和标签不经历MS分析期间的类似肽的碎裂。通过亲和标签与CR结合的肽或多肽的去除可以通过添加如下所述的置换配体(displacingligand,DL)、或通过改变温度或溶剂条件来实现。根据一个特定的实施方式，设想的是，为了进一步降低用于分析的样品的复杂度，设想了在本发明的方法和工具的情境中双标记的蛋白质或肽的提取。为了在这些实施方式的情境中使用，亲和标签的性质不是关键的，只要它容许选择性结合到捕获试剂(CR)和任选地从其上去除，而不影响与亲和标签结合的肽或多肽。因此，亲和标签(A)和捕获试剂(CR)对的非限制性实例包括-d-生物素或结构上修饰的基于生物素的试剂，包括d-亚氨基生物素，其结合到抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白(streptavidin)(例如链霉抗生物素蛋白-琼脂糖、寡聚-抗生物素蛋白-琼脂糖，或单体-抗生物素蛋白-琼脂糖)-1,2-二醇，例如1,2-二羟基乙烷(HO-CH2-CH2-OH),和其他1,2-二羟基烷烃，包括环烷烃的那些，例如，1，2-二羟基环己烷，其结合到烷基或芳基硼酸或硼酸酯，例如苯基-B(OH)2或己基-B(0乙基)2(例如，经由烷基或芳基基团附着到支持物例如琼脂糖)-结合到麦芽糖结合蛋白的麦芽糖；或其他的糖/糖结合蛋白对，或更一般地，服从上述的亲和标签标准的任何配体/配体结合蛋白对。-半抗原，例如，二硝基苯基基团，其结合到相应的抗半抗原抗体，例如，抗二硝基苯基-IgG;-结合到过渡金属的配体，例如，寡聚组氨酸(所谓的6His-标签)将结合Ni(II),在特定的实施方式中过渡金属CR以树脂结合的螯合过渡金属的形式使用，例如，氮基三乙酸螯合的Ni(II)或亚氨基二乙酸螯合的Ni(II);-结合到谷胱甘肽-S-转移酶的谷胱甘肽。在本发明的特定的实施方式中，双标记的肽或多肽的亲和纯化在MS分析之前进行。因此，由于结合的肽或多肽需要进一步的分析，所以需要从捕获试剂上除去，或亲和标签从肽上解离。这可以以不同的方法实现。在特定的实施方式中，亲和标签是可从标记试剂上裂解的，使试剂的同量异序和异重(同位素)标记物组件保持完整。如以上所指出的，亲和标签在本发明的标记试剂上的位置不是关键的。因而，亲和标签可以通过化学上或酶学上可裂解的键结合到标记试剂中的同位素或同量异序标记物组件上。在特定的实施方式中，亲和标签通过可裂解的键(例如，但不限于，酸不稳定的、硫醇不稳定的、碱不稳定的、高碘酸不稳定的或羟胺不稳定的键)连接到双标记试剂。在进一步的特定实施方式中，亲和标签和标记试剂之间的键也可以是通过化学、热或光化反应可裂解的。适合的光可裂解基团是1-(2-硝基苯基)-乙基。热不稳定键是例如，双链核酸、核酸与肽核酸的双链、或双链的肽核酸链，其将在加热时解离。可裂解的基团还包括具有二硫键的那些，酸或碱不稳定基团，尤其包括，二芳基甲基或三甲基芳基甲基基团，甲硅烷基醚，氨基曱酸酯(carbamates),氧酯(oxyesters),疏酯(thiesters),疏逐酸酯(thionoesters)和oc-氟化的酰胺和酯。可酶裂解的基团是例如，蛋白酶敏感的酰胺或酯、P-内酰胺酶敏感的P-内酰胺类似物，以及核酸酶可裂解的或糖香酶可裂解的键。才艮据这个实施方式，亲和标签可以通过用适合的试剂处理标记的蛋白质或肽来除去。对于其它原因，例如，来避免肽的分析中，例如MS中的干扰，亲和标签的除去也是希望的。一般地，在标记的肽或多肽的亲和分离之后裂解掉亲和标签。做为选择，亲和标签可以通过不可裂解的键结合到本发明的标记试剂。为了确保可以回收亲和纯化的肽，使用可以从捕获试剂上解离的亲和标签。在特定的实施方式中，使用生物素和基于生物素的亲和标签。特别感兴趣的是在结构上修饰的生物素，例如，d-亚氨基生物素，其将在与ESI-MS分析相容的溶剂条件下，例如，含有10-20%有机溶剂的烯酸，从抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白柱上洗脱。已经建立的是，d-亚氨基生物素标签化的化合物将在低于pH4的溶剂中洗脱。另外地或作为选择，置换配体(DL)被用于从捕获试剂(CR)替换亲和标签(A)(和与之结合的肽或蛋白质)。当用DL洗脱时，这种DL的至少一部分将存在于包含感兴趣的肽的洗脱液中。在特定的实施方式中，本发明的方法可以包括利用DL,其是在MS分析期间不经历类似肽的碎裂的分子，并且它在样品中的存在不显著抑制标签化的肽、底物或反应产物缀合物的电离。特别地，可以选择置换配体从而它本身在质谱分析期间被最小限度地电离并且由DL簇组成的离子的形成是最小的。适合的置换配体(DL)的性质取决于所采用的A和CR。一般地，选择DL来在合理的时间尺度上从CR替换A,最多在它添加的一周内，但更优选在几分钟或至多一小时之内。与含有A的标签化的化合物对CR的亲和力相比，DL对CR的亲和力应当是可比4交的或更强的。此外，DL应当可溶于在含有亲和标签A的标签化的化合物从CR洗脱期间所使用的溶剂中。在特定的实施方式中，DL对应于游离的亲和标签A,或A的衍生物或结构修饰物。置换配体的实例因而包括d-生物素或d-生物素书t生物。构成本发明的标记试剂的部分的同位素(IT)和同量异序(IB)标记物组件、蛋白质反应基团(PRG)和任选的亲和标签(A)可以以不同的可能的构造设置。可能的组合的非限制性列表在附图5中示出。此处的要求是，标记试剂的PRG可以与多肽上的官能团反应，和同量异序标记物组件的报告基团可以在CID时释放。不同的部分，除了在侧面连接报告基团的那些之外，之间的键可上述的同位素标记物组件的化学结构，或其中所标明的基团Bl或B2可以用于连接标记试剂的不同部分。在本发明的另一个方面中，提供了方法和分析，其中利用本发明的双标记试剂差异化标记样品，来容许用MS同时分析。因此，本发明提供了同时分析不同的样品中包含官能团的一种或多种多肽的存在的方法。本发明的方法包括标记步骤，其中通过容许标记试剂与样品中一种或多种多肽或从其产生的肽的官能团反应，用一組差异化双标记试剂的一种来标记每种样品。如在上文中详细描述的，这一组差异化双标记试剂具有相同的或基本上相同的化学结构并带有同位素和同量异序标记物组件。每种标记试剂包含同位素和同量异序标记物组件的独特组合。在标记之后的步骤中，对于每种样品，标记的肽;陂分离和分析。理想地，在本发明的情境中设想的分析方法中，标记步骤靶向样品中几乎每一个蛋白质，以获得样品中蛋白质组(proteome)的最大的覆盖度。35同时，当考虑每个单独的蛋白质时，在该蛋白质中官能团的数量理想地是低的，以降低分析的复杂度(来自样品中这种蛋白质的要分析的肽的数目仅是一种或是有限的数目)。半胱氨酸通常被用作用于标记的官能团，因为半胱氨酸标记提供了最大覆盖度(标记样品中的每个蛋白质)和最小复杂度(标记样品中每个蛋白质仅一次或有限的次数)之间的折衷。半胱氨酸在Genbank中所有蛋白质的约85%中存在，并且在多肽序列中平均以2%的频率出现(每50个氨基酸中一个)。此外，用半胱氨酸反应性试剂标记不修饰蛋白质的其他部分，而标记在赖氨酸和氨基末端上出现的胺基团或者标记在天冬氨酸、谷氨酸和羧基末端上出现的羧基基团则通常是这样的。根据本发明的方法的一个实施方式，因而通过半胱氨酸官能团进行标记。在一个特定的实施方式中，在标记步骤之前，样品净皮还原以确保在样品蛋白质中的半胱氨酸上可用的硫醇官能团的存在。此外，半胱氨酸出现在给定的酶消化物的C-末端肽或N-末端肽中的概率，随着这种酶在蛋白质中的识别位点的数目而降低。这个数目通常随多肽的长度而成比例地提高。因而，其中半胱氨酸被用作标记试剂的官能团的标记方法非常适合于测定样品中蛋白质的相对表达水平。根据一个特定的实施方式，如以上所指出的，本发明的方法包括在标记步骤之前或之后的蛋白质变为肽的裂解步骤。通常进行这一步骤来容许分析较小的肽，而不是全长的蛋白质。在高处理量系统例如LC中，与蛋白质相比，更容易分离肽，并且在MS/MS中更容易解释来自肽的序列数据。用于蛋白质裂解的适合的化学物质包括溴化氰、BNPS曱基吲哚(BNPSskatole)(2-(2'-硝基苯基磺酰基)-3-曱基-3-溴假吲哚)、曱酸、羟胺、碘苯甲酸、NTCB+Ni(2硝基5氰硫基(thiocyano)苯曱酸)。适合的蛋白水解酶包括Asp-N内肽酶、半胱氨酸蛋白酶(caspase)l、2、3、4、5、6、7、8、9或10、糜蛋白酶；梭菌蛋白酶、肠激酶、因子Xa、谷氨酰内月太酶(glutamylendopeptidase)、GranzymeB、LysC赖氨酰内月大酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、脯氨酸内肽酶、蛋白酶K、葡萄球菌的肽酶I、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶。取决于蛋白质样品的类型，进行化学裂解和酶裂解的组合，或进行双酶消化。尽管有各种酶和化学物质，胰蛋白酶仍然是具有最高特异性(赖氨酸和精氨酸)和效率的酶。在脊推动物中，在蛋白质中赖氨酸以7.4%的频率存在，精氨酸以4.2。/o的频率存在。因而，胰蛋白酶消化对于未修饰的蛋白质产生具有9个氨基酸的平均长度的肽，而当赖氨酸被修饰到不再有胰蛋白酶的底物的程度时，产生具有25个氨基酸的平均长度的肽。这样的肽非常适合于层析和MS技术。根据本发明的方法的一个特定实施方式，蛋白质的裂解在标记之后进行。通过仅分离在官能团上带有标记物的那些肽，这容许降低样品的复杂度。根据一个特定的实施方式，用胰蛋白酶消化标记的蛋白质。根据一个更特定的实施方式，在进行胰蛋白酶消化之前，标记的蛋白质用乙酰化试剂进行处理来修饰赖氨酸的侧链。结果，多肽的氨基末端将同样地;陂乙酰化。根据另一个特定的实施方式，标记的蛋白质用赖氨酸特异性蛋白酶来消化。作为结果，从这种消化获得的所有的肽将在它们的氨基末端处和在羧基末端赖氨酸的侧链处具有胺基团(除了可能具有另一个羧基末端氨基酸的羧基末端肽之外)。在标记步骤中被双标记的、但是不包含蛋白质裂解位点的蛋白质可以作为裂解的肽原样地参予剩余的过程。根据本发明的方法的特定的实施方式，使用的标记试剂包含亲和标签，所述方法包括双标记样品中存在的蛋白质、裂解双标记的蛋白质以及根据肽上的标记物中存在的亲和标签来分离双标记的肽的步骤。这种亲和分离容许降低样品的复杂度用于进一步的分析。当进行蛋白质裂解时，不包含官能团并因而不被标记的那些肽被除去。本发明的方法包括集中两种或更多种样品的步骤，所述样品是在第一和第二标记步骤中被差异化地标记的。通过集中不同的样品，获得多肽样品混合物。这容许在分析中即刻比较不同的样品。当本发明的方法中使用的蛋白质样品是复杂的时，集中的样品将经历一种或多种肽分离技术，以从多肽样品混合物中选择性地分离具有相同的氨基酸序列的双标记的多肽或肽。根据本发明，在一组标记试剂之内组合的同量异序/同位素标记物37的化学结构是相同的，或是基本上相同的，从而在被不同地标记的相同的肽之间，在(多维)层析技术中的性质方面其不会产生显著差异。容许将复杂的蛋白质或肽样品分离成两种或更多种、直到多种级分(在分离双标记的肽的情境中)的适合的分离技术是本领域技术人员已知的，包括但不限于等电聚焦(isoelectricfocusing)、SDSPAGE、2-维凝胶电泳、尺寸排阻层折、离子交换层析、反相HPLC、亲和层析，等等。当样品由更大的肽(例如，Mr3000和100,000之间)组成时，可以使用2DGE。对于从例如蛋白水解消化获得的肽样品，2DLC方法更适合于分离，并且自动化和处理量显著更好。已经描述了通过液相层析分离蛋白质/肽消化物的几种技术，反相(RP)-HPLC,和2-维液相层析。毛细管电泳(CE)也是适合于分离肽的方法。2D-LC—般利用离子交换柱(通常，强阳离子交换，SCX),在线与反相柱连接，以一系列的循环来运行。在每个循环中，盐浓度在离子交换柱中提高，以根据肽的离子电荷将它们洗脱到反相系统中。在此，肽根据疏水性被分离，通过例如，CH3CN梯度。许多参数影响可以被LC-MS显示的分辨能力和随后的蛋白质数量。通常，设置笫一维分离技术(SCX)和笫二维RP-HPLC分离方法之间的"在线，，构造用于样品分级。离子交换层析可以通过利用不断提高的盐浓度的分步洗脱进行、或通过盐梯度进行。一般地，SCX在存在例如最高达30%乙腈的情况下进行，以最小化SCX层析期间的疏水相互作用。在实施在例如C18柱上的反相层析之前，除去有机溶剂例如乙腈，或通过例如蒸发来强烈地降低。因而，适合于进行本发明的方法的设备任选地含有或连接到一个或多个适合的分离仪器，例如电泳仪器、层析仪器，例如但不限于毛细管电泳(CE)仪器、反相(RP)-HPLC仪器，和/或多维液相层析仪器，等等。本发明提供了用于不同样品中蛋白质的同时鉴定(通过MS/MS)和/或定量(通过MS或MS/MS)的工具和方法。更特别地，本发明的方法涉及通过质谱法、随后通过肽的鉴定来分析分离的双标记的多肽或肽的相对发生率(relativeoccurrence)。因而，用于实施本发明的方法的设备包括一个或多个质谱仪。通过谱测定法进行的质量测量通过将被分析物电离成气相来进行。典型质谱仪由3个组件构成，从感兴趣的分子产生离子的离子源、测定电离的分子的质荷比(m/z)的质量分析器、以及对每个单独的m/z值对离子的数量进行记录并计数的检测器。MS谱中的每个特征由两个值定义，m/z以及对离子数量的测量，所述离子到达仪器的检测器。谱仪中用于质量分析的蛋白或肽的电离通常通过电喷雾电离(ESI)或基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)来进行。在ESI过程期间，被分析物被直接电离出溶液，因而ESI常常直接连接到液体层析分离工具(例如，反相HPLC)上。MALDI经由激光脉冲来蒸发与小有机分子混合的干燥样品，所述小有机分子吸收激光能量，如苯丙烯酸，来使得该过程更有效。质量分析器是质谱仪的关键组件；重要的参数是敏感性、分辨率和质量精确性。当前在蛋白质组学中使用五种基本类型的质量分析器。这些包括离子阱、飞行时间(TOF)、四极、Orbitrap和傅里叶变换离子回旋加速(FTICR-MS)分析器。串联的MS或MS/MS可以以时间(离子阱)和以位置(所有杂化仪器，例如LTQ-FTICR、LTQ-Orbitrap、Q-TOF、TOF-TOF、三级四极和杂化三级四极/线性离子阱(QTRAP))进行。如在此详述的，已经预先从差异化标记的样品的库中分离的多肽或肽在质谱仪上产生的谱，含有具有在不同的同位素标记物组件之间的特征质量差异的一组峰(如果在样品之一中如果其中出现这种多肽的蛋白质根本没有被表达，峰的数量将更少)。这些峰的每一个都通过串联MS进行进一步分析，来释放同量异序标记物组件的报告基团，用于不同地标记的肽的鉴定和进一步的定量。根据多肽的Mr,单独的肽的氨基酸组成或氨基酸序列，肽的身份被测定。以下通过许多标记方案来说明本发明的方法。如上文中详述的和以下在不同的说明性标记方案中进一步的阐明的，肽的碎裂和亲和标签的使用对于本发明的所有实施方式都不是必需的。以下标记方案(参见附图6)公开了利用具有蛋白质反应基团(PRG)的本发明的双标记试剂标记8种蛋白质样品的实施方式，所述蛋白质反应基团是半胱氨酸反应基团。在预加工步骤中，样品被还原来确保半胱氨酸上可使用的硫醇官39能团的存在，并且被乙酰化来封闭赖氨酸的侧链的胺。标记方案的不同步骤包括-8种蛋白质样品各自用一组双标记试剂中的一种来标记，其中每种标记试剂具有同位素和同量异序标记物的独特组合，和所述标记试剂是生物素标签化的并且包含半胱氨酸反应基团。-在标记之后，在这个阶段所有的样品已经被集中，并作为一个反应混合物来处理，其降低了由于对单独样品的操作而引起的变动。-用胰蛋白酶来消化如此获得的半胱氨酸标记的样品。-为了降低进一步分析的肽的数量，利用(链酶)抗生物素蛋白亲和技术通过生物素亲和标签来只分离双标记的肽。在亲和步骤之后，现在每个肽具有带有同位素和同量异序标记物组件的标记物。因此，每个肽在经由MS进行分析时都是情报性的。所述方法进一步包括步骤，其中-集中的肽通过例如液相层析来分离。在此，相同的、但是来源于尽4在来自不同样品的4个肽上存在同;立素;同量异;标记物组7牛的不同组合，但这将不会影响它们的洗脱，因为每个标记物组中的不同标记物具有相同的化学式或基本上相同的化学式。-通过MS来分析每个分离的肽级分，其应当产生两个信号，具有不同的质量，对应于"轻，，或"重"同位素标记物组件的存在。此后，具有不同同位素的每个肽被进一步碎裂，借此从每个肽上存在的同量异序标记物组件释放报告基团。报告物的相对数量表示用该报告物标记的肽的相对数量。MS数据被进一步用于测定肽的序列和鉴定其所来源的蛋白质。在本文的实施例1中显示了测定肽混合物中每种标记的肽的相对数量的理论实例。上文说明的本发明的方法，其利用具有2种不同同位素标记物组件和4种不同的同量异序标记物组件的组合的一组标记试剂，容许复杂度最高达8的不同蛋白质样品的多通道化。当使用另外的同量异序和/或同位素标记物组件时，这容许提高的多通道化。通过不同的同位素标记物组件的数量乘以不同的同量异序标记物组件的数量的乘积来确定多通道性(multiplexicity)。以上描述的示范性的标记方案适合于，例如，利用内部肽测定在不同的样品中单独的蛋白质之间表达水平的差异。取决于特定的应用，设想了不同的可选择的方案。以上列出的最常规的方法利用在肽的侧链上的标记。一般地，在侧链上的标记在半胱氨酸上进行。然而如上所述，在蛋白质数据库中约15%的蛋白质没有半胱氨酸，并且将不会被标记。在蛋白质中不存在半胱氨酸的概率随着蛋白质长度降低而提高。对于在除了半胱氨酸之外的氨基酸侧链上进行标记，这也是同样成立的。蛋白质越短，在氨基酸的侧链上标记的概率就越小。为了研究低Mr蛋白质，其中蛋白质/肽反应基团与是伯胺或羧基基团的官能团具有相互作用的本发明的双标记试剂和方法是特别令人感兴趣的。实际上，这些基团总是存在于每个蛋白质中，分别在氨基末端和羧基末端。根据一个特定的实施方式，本发明的方法包括利用凝胶过滤层析或尺寸排阻方法(透析或超滤)将样品分级为一个或多个低Mr级分的步骤。此后，样品的低Mr蛋白质级分被标记而不进行进一步的蛋白质裂解，因为这些蛋白质样品的有限大小使得它们直接适合于液相层析技术。在本发明的方法的这个实施方式中，不必使用亲和标签，因为低Mr级分中的每个蛋白质都浮皮标记。在另一个实施方式中，本发明方法的试剂被用于特异性地标记蛋白质的N-末端或C-末端肽。对于N-末端肽的分离，蛋白质上的胺基团(赖氨酸和N-末端)首先被修饰(例如，烷基化或乙酰化)。Asp和Glu的侧链也^皮修饰。此后，蛋白质被裂解(例如，用胰蛋白酶)，从而所有的肽，除了N-末端肽之外，都获得了新的可用的反应性胺基团。这个基团与蛋白质反应性亲和标签(例如，NHS-生物素)反应。此后，利用亲和层析分离内部和C-末端肽。现在其余的N-末端肽在它的C-末端与具有羧基反应基团的标记试剂反应。对于这种过程，不需要标记试剂上的亲和标签，因为感兴趣的肽实际上早已经预先被亲和纯化。仍然可以设想使用标记试剂上的标签以及随后的亲和纯化，来确保只有被适当地标记的肽经历进一步的分析。在这种方法中，在裂解之前Asp和Glu的修饰避免了氨基酸侧链的标记，但是对于这种过程不是必需的。可以实施类似的方法用于C-末端肽的分离，其中羧基基团被修饰，并且在裂解时产生的肽与亲和标签反应，所述亲和标签带有对羧基基团具有反应性的基团。标记试剂因而包含蛋白质/肽反应基团，其对裂解时产生的新的N-末端是反应性的。蛋白质的N-末端或C-末端肽的标记具有一些优点。首先，样品中的所有蛋白质都被检测，而在氨基酸的侧链处的标记将忽略那些其中不出现特定官能的蛋白质。其次，甚至具有封闭的N-末端的蛋白质也将被检测。利用这种方法，所有的氨基末端都被封闭，或在体内，或通过所述标记方法。另一个根据本发明的方法的示例性标记方案是被认为特别适合于例如研究样品中蛋白质的蛋白水解加工(所谓的降解组学)的方案。对于具有N-末端序列1-9的假定蛋白质，差异化N-末端加工的实例在表1中示出，其中氨基酸4和9是精氨酸。当不加工蛋白质时，所有八种差异化标记的N-末端肽在层析后作为一个级分洗脱，在MS中被分离到包含不同的同位素标记物的不同级分中，并且在MS/MS中这些的每一个进一步产生来自同量异序标记物组件的一组不同的报告基团。在以下表l中所列的情况中，加工的蛋白质的N-末端肽的标记产生4种不同的N-末端肽，其在高性能层析系统例如反相HPLC层析上将在不同的位置洗脱。因而，当这些肽具有相同的同位素标记物但是携带不同的同量异序标记物时，这样的肽级分甚至可以在MS上表现为单个峰。表1:差异化N-末端加工样品序列力口工N-末端胰蛋白酶肽1123(4R)5678(9R)..无123(4R)2123(4R)5678(9R)..无123(4R)3123(4R)5678(9R)..123(4R)4123(4R)5678(9R)..123(4R)123(4R)5678(9R)..23(4R)6123(4R)5678(9R)..23(4R)7123(4R)5678(9R)..123(4R)5678(9R)8123(4R)5678(9R)..123(4R)5678(9R)42尽管如此对于每个样品，不考虑加工程度，对于其所来源的蛋白质的某些部分测定了N-末端肽。在本发明的一般方法中(即，其中官能团的性质不由样品的性质或期望的结果来决定)，在多肽上要被修饰的官能团的选择可以受不同因素的影响，例如-可用的标记试剂上存在的蛋白质反应基团的类型-可用的标记试剂中亲和标签的存在或不存在。本发明的方法可用于生物标志物的检测，例如，在疾病的情境中。取决于样品，通过MS和MS/MS分析大量的肽。这种数量可以高达数百或甚至超过一千。对于它们中的许多而言，不考虑样品的来源，相同的肽的差异化标记的版本之间的相对数量将是恒定的。然而，对于与特定样品所代表的疾病状况相关的有限数量的肽，将观察到显著差异。这些肽本身的分析使得可以测定所述肽所来源的蛋白质。当对于来自同一蛋白质的不同肽观察到检测出相同的表达水平时，这种分析将甚至更为可靠。本发明的另一个方面涉及用于蛋白质样品的多通道分析的设备(100),包括至少两个样品源(IOI)、具有相应的标记物源(104)的标记单元(103)、分离单元(107)、质谱仪单元(108)、以及控制电路和数据分析单元(109)。在特定的实施方式中，分离单元(107)包含两个连续连接的分离系统(1107)和(2107),其中，所述第一分离系统(1107)是例如2D凝胶电泳系统或阳离子交换层析系统和分离系统，所述第二分离系统(2107)—般是HPLC反相系统。质谱仪元件108是MS/MS谱仪，其分离同位素形式并且其中一旦进行CID,同量异序标记物的报告基团就被差异地测出，以及其中可以进行从头开始的肽测序。MS/MS分析可以利用2个基础上不同的仪器来进行。在第一类型的仪器中，其中进行MS/MS分析的离子阱是在其中进行MS的同一离子阱，但是MS/MS是以时间进行(阱被填满，除了感兴趣的离子之外所有离子被喷出，进行CID，并扫描碎片离子)。第二类型的仪器，杂化仪器(三级四极、q-tof、ltq-ftms、ltq-orbitrap)以位置分开MS/MS。例如亲本选择在第一质量分析器中进行，碎片在第二质量分析器中扫描。所述设备可以进一步包含许多可选择的元件，例如样品制备单元(102),其中，例如，发生样品溶解(lysis)和免疫耗尽，蛋白质裂解单元(105)和亲和纯化单元(106)来选择性地分离带有亲和标签的标记的多肽(例如，生物素-抗生物素蛋白亲和纯化)。用于加入本发明的设备中的适合的设备如质谱仪单元和分离单元在以上已经描述。可以理解的是，本发明的标记方法可用于蛋白质组学、蛋白质表达分布(proteinexpressionprofiling)、生物标志物发现和革巴点发现。本发明的方法的高度多通道性容许在一个单一实验中分析许多不同的条件。所述方法对于研究获自不同疾病状态的样品的表达分布是特别有用的。被分析的样品来自以下的一个或多个健康的人、患有良性病症(benigndisorder)的人、患有恶性病症(malignantdisorder)的人(緩和的或侵略性的)、来自响应于或不响应于治疗的人、来自患有在身体的不同部分显现的病症的人、来自治疗之前、期间和之后的人、来自接受不同的治疗方法的人、和来自具有一种或多种病症症状不然就健康的人。在本发明的情境中考虑的病症包括细菌或病毒感染，免疫学病症、心血管病症和癌症。体现本发明的系统和方法的其他方案对于本领域技术人员而言将是明显的。要理解的是，虽然对于根据本发明的设备已经在此讨论了优选的实施方式、特定的结构和构造以及材料，但是可以进行形式和细节上的各种变化或修改而不背离本发明的范围和精神。实施例实施例1:利用同位素和同量异序标记的单独的肽的相对表达水平的测定利用包含同量异序和同位素标记物组件的独特组合的标记试剂，通过不同的同量异序和同位素标记组合，可以测定标记的肽的混合物中单独的肽的相对量。这通过以下理论实施例来例示。用同位素标记物a或b以及同量异序标记物A、B、C和D的组合根据表4中的方案标记内部肽8种样品(l到8)。表4:混合物中标记的多肽的相对浓度的测定肽12345678同位素标记物aabbbb同量异序标记物ABCDABCD集中的样品laA,2aB,3aC,4aD,5bA,6bB，7bC,8bD第一分离MSlaA,2aB,3aC,4aD5bA,6bB,7bC,8bD比例同位素标记物23第二分离MS/MSlaA2aB3aC4aD5bA,6bB,7bC,8bD比例同量异序标记物19371865单独的比例1/20x2/5=0.029/20x2/5=0.183/20x2/5=0.067/20x2/5=0.141/20x3/5=0.038/20x3/5=0.246/20x3/5=0.185/20x3/5=0.15标准化的19371.51297.5此后，所有的样品被集中并经历层析，其中不考虑肽上的特定同位素/同量异序标记物组件组合，标记的肽的行为方式相同。肽的差异化标记的版本作为一个级分洗脱。将级分施加到MS上，其中它将分离为具有重同位素的级分和具有轻同位素的级分。对于这两个级分，可以计算相对量。在表4中，测量到比具有a同位素的肽多50%的具有b同位素的肽。随后，具有不同的同位素标记物的两个肽级分被碎裂，其容许测定具有给定的同位素标记物的每个肽级分之内同量异序肽的相对比例(表4中给出的理论比例)。4权利要求1.用于多肽的质谱分析的一组标记试剂，每种标记试剂包含-异重标记物组件，-蛋白质/肽反应基团，和-包含报告基团(RP)和平衡基团(BG)的同量异序标记物组件。2.根据权利要求1的一组标记试剂，其中所述异重标记物组件是同位素标记物组件。3.根据权利要求1的一组标记试剂，其中所述异重标记物组件被包含在所述同量异序标记物的所述报告基团和/或所述平衡基团之内。4.根据权利要求1的一组标记试剂，其中所述蛋白质/肽反应基团与蛋白质或多肽中的半胱氨酸反应。5.根据权利要求1的一组标记试剂，其中每种标记试剂进一步包含亲和标签。6.根据权利要求5的一组标记试剂，其中所述亲和标签是可裂解的。7.根据权利要求5的试剂，其中所述亲和标签是生物素。8.—种用于同时分析不同的样品中包含官能团的一种或多种多肽的存在的方法，其包括步骤a)标记步骤，其中每种样品被一组差异化双标记试剂中的一种标记，所述标记是通过容许所述标记试剂与所述样品中一种或多种多肽或从其产生的肽的官能团反应而进行的；其中所述一组差异化双标记试剂具有相同的或基本上相同的化学结构，并且包含异重和同量异序标记物组件，和其中每种标记试剂包含异重和同量异序标记物组件的独特组合，b)集中所述不同的样品来获得多肽样品混合物，c)/人所述多肽样品混合物中选才,性地分离所述双标记的多肽或肽；和d)通过质谱法分析所述分离的标记的多肽或肽的相对出现。9.根据权利要求8的方法，其中所述异重标记组件是同位素标记组件。10.才艮据权利要求8的方法，其中所述一组标记试剂的标记试剂包含亲和标签。11.根据权利要求8的方法，其进一步包括在步骤(a)之后将所述蛋白质裂解成肽的步骤。12.根据权利要求ll的方法，其中所述裂解用胰蛋白酶进行。13.根据权利要求8的方法，其中在步骤c)中，根据在所述标记的多肽或肽上存在的亲和标签选择性地分离所述多肽或肽。14.根据权利要求8的方法，其中所述官能团是硫醇。15.根据权利要求8的方法，其中所述多肽或从其产生的肽的官能团作为另一个官能团的修饰结果存在。16.权利要求8的方法，其中步骤(c)包括通过电泳或层析从所述集中的多肽中分离标记的多肽或肽级分的步骤。17.权利要求8的方法，其中步骤(d)包括用MS测定步骤(c)中获得的所述分离的标记的多肽或肽级分中不同质量的相对数量的步骤。18.权利要求17的方法，其中步骤(d)进一步包括使所述分离的标记的多肽级分经历碰撞诱导的解离(CID)并测定其中不同的同量异序标记的多肽的相对数量的步骤。19.权利要求18的方法，其中不同的同量异序标记的多肽的相对数量通过测定CID之后从所述同量异序标记物释放的报告基团的相对数量来测定。20.权利要求19的方法，进一步包括测定所述多肽的序列的步骤。21.—种用根据权利要求1的具有同量异序和异重标记物组件的标记试剂标记多肽样品的方法，包括使所述标记试剂与所述样品中所述多肽上的官能团反应的步骤。22.根据权利要求8到21的任一项的方法用于鉴定蛋白质的用途，所述蛋白质在对照蛋白质样品和一种或多种实-睑或疾病蛋白质样品之间被差异化表达。23.—种多肽或肽的混合物，所述多肽或肽各自包含含有同位素标记物组件和同量异序标记物组件的标记物，所述标记物已经通过所述多肽或肽中的官能团与所述多肽或肽连接。24.权利要求23的多肽或肽的混合物，其中所述官能团选自由以下构成的组誦N國末端或赖氨酸上的伯胺，-天冬氨酸、谷氨酸或C-末端上的羧基基团，和-半胱氨酸上的硫醇基团。25.根据权利要求23的肽的混合物，包含是蛋白质的胰蛋白酶肽的肽。26.根据权利要求23的混合物，其中所述多肽或肽上存在的不同标记物的数目至少是4。27.—种包含四种或更多种标记试剂的试剂盒，每种标记试剂包含同量异序标记物组件、异重标记物组件和蛋白质/肽反应基团，其中所述试剂盒中每种标记试剂具有相同的或基本上相同的化学结构，并且其中所述试剂盒内每种标记试剂包括所述异重和所述同量异序标记物组件的独特组合。28.根据权利要求27的试剂盒，其中所述标记试剂包含亲和标签。29.—种测定单独的多肽或肽的集中混合物中具有相同氨基酸序列的单独的多肽或肽的相对数量的方法，其中在集中之前，每种单独的多肽或肽已经用一组差异化双标记试剂中的一种进行标记，其中所述一组差异化双标记试剂具有相同的或基本上相同的化学结构并带有同位素和同量异序标记物组件，每种标记试剂包含不同的同位素和同量异序标记物组件的独特组合，包括步骤a)任选地，通过液相色谱分离所述多肽或肽，以便获得包含所述具有相同氨基酸序列的单独的多肽或肽的分离的级分，b)通过第一MS将所述集中的混合物或步骤(a)中获得的分离的多肽级分中的肽或多肽分离成具有不同质量的进一步的多肽或肽的级分，并测定具有不同质量的每种肽级分的相对数量，c)使步骤(b)中获得的所述肽级分在一定条件下进行第二MS，在所述条件下其中所述单独的多肽的同量异序标记物组件被碎裂，并测定所述肽级分内单独的肽的每种碎裂的同量异序标记物组件的数量，d)从步骤(c)中测定的每种同量异序标记物组件的数量，确定步骤(b)中获得的肽级分内单独的肽的相对数量，e)从步骤(b)中测定的具有不同质量的每种级分的相对数量以及从步骤(d)中确定的单独的肽的相对数量，计算所述集中的混合物中具有相同氨基酸序列的每种单独的多肽的相对数量。30.—种用于蛋白质样品的多通道标记和分析的设备(100)，包括至少两个样品源(101)、标记单元(103)和相应的各自包含标记试剂的标记物源(104)，所述标记试剂包含-异重标记物组件，-蛋白质/肽反应基团，和-包含报告基团(RP)和平衡基团(BG)的同量异序标记物组件，以及进一步包含分离单元(107),质谱仪单元(108)和数据分析单元间。31.根据权利要求30的设备，进一步包括选自由样品制备单元(102)、蛋白质裂解单元(105)和亲和纯化单元(106)构成的组中的一种或多种元件。全文摘要本发明描述了适合于差异化标记不同的蛋白质样品的、具有同位素和同量异序标记物组件的双标记试剂。在单独的蛋白质样品的标记之后，集中所有样品。来自集中的样品的肽被分离，并通过质谱法分析，用于测定每种差异化双标记的多肽的相对浓度。文档编号G01N33/68GK101542291SQ200780040967公开日2009年9月23日申请日期2007年10月23日优先权日2006年11月2日发明者R·霍夫曼申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司