专利名称：：一种分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法
技术领域：
：本发明涉及一种分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法，特别涉及一种采用GC-MS联用技术分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法。
背景技术：
：香加皮(户en》/oca^e^w)又名北五加皮、杠柳皮，为萝摩科植物杠柳Pe—/oca^/訓Bge的干燥根皮。香加皮味辛、苦、温；有毒，归肝、肾、心经，可祛风湿、强筋骨，用于治疗风湿痹痛、腰膝酸软、心悸气短、下肢浮肿。现代临床用于治疗风湿性关节炎、乳腺癌等；用其总皂苷治疗慢性充血性心力衰竭效果显著(邓士贤，王德成，王懋德，等.滇杠柳苷的强心作用[J].ActaPharmaceuticaSinica(药学学报)，1964，11(2):75.HedejiI,XuJP.PregnaneGlycosidefromanAntitumourFractionofPeriplocasepium.Phytochemistry,1988,27(4):1173.)。香加皮的主要化学成分包括皂苷类、强心甙类以及香气成分。活性试验表明根皮甲醇提取物中C21甾体类化合物和强心苷类成分有显著抗小鼠腹水癌作用(张援虎，王锋鹏.杠柳属植物化学成分研究进展[J].NaturalProductResearchandDevelopment(天然产物研究与开发)，2003，15(2):157-161.KaoruU，NaomiS,"StudiesonDifferentiationInducers.V.SteroidGlycosidesfromPeriplocaeRadicisCortex[J].Chem.Pharm.Bull.1995,43(9):1565-1568.)。史清华等人采用试管预试和圆形滤纸层析预试法，初步判定香加皮根皮中含有脂肪酸类化学成分(史清华，马养民，等.杠柳根皮化学成分及杀虫活性的初步研究[J].西北农业学报，2005,14(6):141-144.)。目前，国内、外均尚未见有关其脂肪酸成分提取及分析的报道。脂肪酸类化合物具有抗血小板凝集、降血脂及镇静作用。研究证明，高级不饱和脂肪酸具有增强人体免疫力、降血脂、抗动脉粥样硬化和抗血栓形成等功效(MuYM，YanassT，efa/.SaturatedFFAs,palmiticacidandstearicacid,inducedapoptosisinhumangranulosecells[J].Endocrinologyl.2001,142:3590-3597.)。为全面阐明香加皮的药用价值，本发明采用GC-MS联用技术对香加皮脂肪酸成分进行了分析，为香加皮的开发与研究提供了科学依据。
发明内容本发明提供了一种分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法，该方法包含以下步骤(a)从香加皮中提取脂肪酸；(b)对脂肪酸进行甲酯化得脂肪酸甲酯；(c)用GC-MS联用方法检测脂肪酸甲酯；其中，上述步骤(c)中GC-MS联用的色谱条件是色谱柱为石英毛细管色谱柱；载气为高纯氦气；进样口温度为23027(TC，最好为25(TC;分流比为8:112:1，最好为10:1;流速为0.81.2mlvmin"，最好为l.OmL.min陽1。其中，上述步骤(c)中GC-MS联用的质谱条件是:离子源为EI离子源；四极杆温度为120170°C，最好为150°C;传输线温度为270310'C，最好为29(TC;倍增管电压为18002200V，最好为2000V;GC-MS接口温度为21025(TC，最好为23(TC。上述石英毛细管色谱柱优选为DB-17石英毛细管色谱柱，其规格最好为30mx0.25mm;测定过程中可以采用以下方式程序升温初始温度130170°C，最好为15(TC，以36。C'min"(最好为5"C'min")升温至230270°C，最好为25(TC，停留38min，最好为5min。上述离子源电离能量可以为70eV;离子源温度可以为270280°C。上述步骤(a)中提取脂肪酸的方法可以包括香加皮药材粉碎，用沸程为609(TC石油醚回流提取610h，最好为8h，过滤后减压浓縮，挥干溶剂得脂肪酸提取物。上述步骤(b)中脂肪酸甲酯化的方法可以包括取适量脂肪酸样品，加入2%氢氧化钠一甲醇溶液，置60。C水浴加热1530min，再加入三氟化硼一乙醚溶液反应5min后，精密加入正己烷，保持5min，反应液冷却至室温后，加入饱和氯化钠适量，振摇15min，静置分层，取上清液即得甲酯化的脂肪酸溶液。本发明提供的GC-MS联用技术分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法为全面阐明香加皮的药用价值以及为香加皮的开发与研究提供了科学依据。应该理解，上述色谱条件为典型条件，实际应用中根据所使用仪器的不同特点，可以对各参数做出适当的调整，以期获得最佳的效果。图1表示香加皮中脂肪酸甲酯的总离子色谱图。具体实施例方式为了更加清楚地对本发明进行说明，以下通过具体实施例对本发明的具体实施方式进行更为详细地说明。但是应该理解，以下所述具体实施例仅用于对本发明进行示例性说明，而非用于对本发明进行任何性质的限定，其中所用材料、试剂、仪器及操作条件等仅为代表性的，其并不限于所列举的情况。所属
技术领域：
的技术人员通过阅读以下说明可以对本发明做出不脱离本发明权利要求所限定的保护范围的改动和改进，这些改动和改进也处于本发明所要求保护的范围内。1仪器、材料与试剂1.1仪器GC-MS联用仪(SfflMADZU6010NGCSystem/SfflMADZU601ONMSSystem);AGBP210S电子天平(德国satorious公司)。1.2药材与试剂香加皮，购自沈阳市药材公司，由沈阳药科大学中药系孙启时教授鉴定为正品。所用试剂均为分析纯试剂。2实验部分2.1脂肪酸提取香加皮药材100g，粉碎后用石油醚(6090°C)回流提取8h，过滤后减压浓縮，挥干溶剂得脂肪酸。2.2样品甲酯化取2滴脂肪酸样品，加入2%氢氧化钠一甲醇溶液2mL置6(TC水浴15min,再加入2mL三氟化硼一乙醚溶液反应5min。精密加入2mL正己垸，再保持5min，反应液冷却至室温后，加入饱和氯化钠适量，振摇15min，静置分层，取上层清液备用。2.3GC-MS分析条件2.3.1色谱条件载气高纯氦气；DB-17石英毛细管柱(30mx0.25mm)分流比10:1;进样口温度250°C;程序升温初始温度15(TC，以5'Omin"升温至25(TC，停留5min;进样量lpL;流速l.OmL'min-l。2.3.2质谱条件EI离子源；电离能量70eV;离子源温度280°C;四极杆温度150°C;传输线温度290°C;倍增管电压2000V;扫描质量范围30450amu;GC-MS接口温度230°C。3分析鉴定结果取甲酯化的脂肪酸样品溶液，注入气质联用仪分析，各峰经质谱分析与标准谱库核对和已知化合物对照法，确认18种脂肪酸。GC-MS分析香加皮中脂肪酸甲酯的总离子色谱图如图l所示。其定性、定量结果见下表l。表l香加皮中得到确认的脂肪酸及其含量峰号保留时间化合物分子式分子量质量分数/%<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>611.74未鉴定出2.151712.02未鉴定出0.946813.40十六烷酸(棕榈酸)C16H320225638.18913.579-十六碳烯酸(棕榈烯酸)G16H30O22543.4591013.72十六碳一烯酸G16H30O22551.9911115.18十七烷酸C17H34022700.8581217.22十八烷酸(硬脂酸)G18H36O22841.4481317.409-十八碳烯酸(油酸)G18H34O22827.0211417.518-十八碳烯酸C18H34022822.4871517.929,12-十八碳二烯酸(亚油酸)C18H320228032.671618.549,12,15-十八碳三烯酸(o-亚麻酸)G18H30O22783.7731719.07二十垸酸(花生酸)C20H40O23120.1541821.52二十碳四烯酸C20H32O23040.1411921.69二十二烷酸C22H44O23400.2922022.03二十二碳四烯酸C22H36023320.172在所鉴定的脂肪酸成分中，棕榈酸(38.18%)含量最高，其次是亚油酸(32.67%)，这2种酸占总量的70.85%，不饱和脂肪酸(即9-十六碳烯酸(棕榈烯酸)、十六碳一烯酸、9-十八碳烯酸(油酸)、8-十八碳烯酸、9,12-十八碳二烯酸(亚油酸)、9，12，15-十八碳三烯酸(o-亚麻酸)、二十烷酸(花生酸)、二十碳四烯酸、二十二碳四烯酸)占总量的51.71%，其中单不饱和脂肪酸(即9-十六碳烯酸(棕榈烯酸)、十六碳一烯酸、9-十八碳烯酸(油酸)、8-十八碳烯酸)占14.96%，多不饱和脂肪酸(即9，12-十八碳二烯酸(亚油酸)、9,12,15-十八碳三烯酸(a-亚麻酸)、二十碳四烯酸、二十二碳四烯酸)占36.76%。实施例二1仪器、材料与试剂1.1仪器GC-MS联用仪(SHIMADZU6010NGCSystem/SHIMADZU601ONMSSystem);AGBP21OS电子天平(德国satorious公司)。1.2药材与试剂香加皮，购自沈阳市药材公司，由沈阳药科大学中药系孙启时教授鉴定为正品。所用试剂均为分析纯试剂。2实验部分2.1脂肪酸提取香加皮药材100g，粉碎后用石油醚(60°C90°C)回流提取6h，过滤后减压浓縮，挥干溶剂得脂肪酸。2.2样品甲酯化取2滴脂肪酸样品，加入2%氢氧化钠一甲醇溶液2mL置6(TC水浴15min,再加入2mL三氟化硼一乙醚溶液反应5min。精密加入2mL正己烷，再保持5min，反应液冷却至室温后，加入饱和氯化钠适量，振摇15min，静置分层，取上层清液备用。2.3GC-MS分析条件2.3.1色谱条件载气高纯氦气；DB-17石英毛细管柱(30mx0.25mm)分流比8:1;进样口温度230°C;程序升温初始温度13(TC,以6。Omin"升温至23(TC，停留3min;进样量lpL;流速0.8mLmin國1。2.3.2质谱条件EI离子源；电离能量70eV;离子源温度270°C;四极杆温度120°C;传输线温度310°C;倍增管电压1800V;扫描质量范围30450amu;GC-MS接口温度210°C。3分析鉴定取甲酯化的脂肪酸样品溶液，注入气质联用仪分析，各峰经质谱分析与标准谱库核对和已知化合物对照法，确认脂肪酸。实施例三1仪器、材料与试剂1.1仪器GC-MS联用仪(SHIMADZU6010NGCSystem/SHIMADZU60IONMSSystem);AGBP210S电子天平(德国satorious公司)。1.2药材与试剂香加皮，购自沈阳市药材公司，由沈阳药科大学中药系孙启时教授鉴定为正品。所用试剂均为分析纯试剂。2实验部分2.1脂肪酸提取香加皮药材100g，粉碎后用石油醚(60°C％°C)回流提取10h，过滤后减压浓縮，挥干溶剂得脂肪酸。2.2样品甲酯化取2滴脂肪酸样品，加入2%氢氧化钠一甲醇溶液2mL置60。C水浴15min，再加入2mL三氟化硼一乙醚溶液反应5min。精密加入2mL正己烷，再保持5min，反应液冷却至室温后，加入饱和氯化钠适量，振摇15min，静置分层，取上层清液备用。2.3GC-MS分析条件2.3.1色谱条件载气高纯氦气；DB-17石英毛细管柱(30mx0.25mm)分流比12:1;进样口温度270°C;程序升温初始温度17(TC，以3。C'min"升温至27(TC，停留6min;进样量l|iL;流速1.2mL'mirT1。2.3.2质谱条件EI离子源；电离能量70eV;离子源温度270°C;四极杆温度170°C;传输线温度270°C;倍增管电压2200V;扫描质量范围30450amu;GC-MS接口温度250°C。3分析鉴定取甲酯化的脂肪酸样品溶液，注入气质联用仪分析，各峰经质谱分析与标准谱库核对和已知化合物对照法，确认脂肪酸。10权利要求1.一种分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法，包括下列步骤(a)从香加皮中提取脂肪酸；(b)对脂肪酸进行甲酯化得脂肪酸甲酯；(c)用GC-MS联用方法检测脂肪酸甲酯；其中，上述步骤(c)中GC-MS联用的色谱条件是色谱柱为石英毛细管色谱柱；载气为高纯氦气；进样口温度为230～270℃；分流比为8:1～12:1；流速为0.8～1.2mL·min-1；其中，上述步骤(c)中GC-MS联用的质谱条件是离子源为EI离子源；四极杆温度为120～170℃；传输线温度为270～310℃；倍增管电压为1800～2200V；GC-MS接口温度为210～250℃。2.根据权利要求1所述的分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法，其特征在于GC-MS联用的色谱条件中进样口温度为25(TC;分流比为10:1;流速为l.OmL'min";GC-MS联用的质谱条件中四极杆温度为150°C;传输线温度为290°C;倍增管电压为2000V;GC-MS接口温度为230。C。3.根据权利要求1或2所述的分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法，其特征在于所述石英毛细管色谱柱为DB-17石英毛细管色谱柱，其规格为30mx0.25mm。4.根据权利要求1或2所述的分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法,其特征在于所述色谱条件采用以下方式程序升温初始温度130170°C，以36。C.min"升温至230270°C，停留38min。5.根据权利要求4所述的分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法，其特征在于所述色谱条件采用以下方式程序升温:初始温度150°C，以5'。min—1升温至25(TC,停留5min。6.根据权利要求1或2所述的分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法，其特征在于所述离子源电离能量为70eV;离子源温度为270280°C。7.根据权利要求1或2所述的分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法，其特征在于所述步骤(a)中提取脂肪酸的方法包括香加皮药材粉碎，用沸程为609(TC石油醚回流提取610h，过滤后减压浓縮，挥干溶剂得脂肪酸提取物。8.根据权利要求7所述的分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法，其特征在于所述步骤(a)中提取脂肪酸的方法包括香加皮药材粉碎，用沸程为609(TC石油醚回流提取8h，过滤后减压浓縮，挥干溶剂得脂肪酸提取物。9.根据权利要求1或2所述的分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法，其特征在于所述步骤(b)中脂肪酸甲酯化的方法包括取适量脂肪酸样品，加入2%氢氧化钠一甲醇溶液，置6(TC水浴加热1530min，再加入三氟化硼一乙醚溶液反应5min后，精密加入正己院，保持5min,反应液冷却至室温后，加入饱和氯化钠适量，振摇15min，静置分层，取上清液即得甲酯化的脂肪酸溶液。全文摘要本发明提供一种分析香加皮中脂肪酸化学成分的方法，该方法包含以下步骤(a)从香加皮中提取脂肪酸；(b)对脂肪酸进行甲酯化；(c)用GC-MS联用方法检测甲酯化的脂肪酸；其中，GC-MS联用的色谱条件是色谱柱为石英毛细管色谱柱；载气为高纯氦气；进样口温度为230～270℃；分流比为8∶1～12∶1；流速为0.8～1.2mL·min<sup>-1</sup>；质谱条件是离子源为EI离子源；四极杆温度为120～170℃；传输线温度为270～310℃；倍增管电压为1800～2200V；GC-MS接口温度为210～250℃。本发明的方法经方法学验证准确可靠，可用于香加皮中脂肪酸化学成分的分析。文档编号G01N30/00GK101498702SQ20081000640公开日2009年8月5日申请日期2008年2月2日优先权日2008年2月2日发明者玲佟,周水平,莉李,毕开顺,洁马,钧高申请人:天津天士力制药股份有限公司