专利名称：一种精子染色质扩散实验检测精子dna碎片的方法
技术领域：
本发明涉及医学临床上使用的试剂，是一种精子染色质扩散实验检测精子 DNA碎片的方法。
背景技术：
目前，世界许多国家都在研究精子成熟过程中因受内外环境影响形成 DNA碎片出现的DNA完整性异常，从而引起的精子形态和功能异常。由于在 男性不育检测中DNA的完整性是精液的常规检测，也是评估男性不育的主要 指标，因此，如何检测精子DNA完整性是生殖医学领域研究的重要课题之一。 国外比较领先的检测方法为精子染色质扩散试验，其英文名为sperm chromatin dispersion,简称SCD，其商品化的试验盒已推广使用。SCD检测方 法具有较多优点，例如简单、快速、准确、分辨率高等，但是，由于试剂盒 包含知识产权，因此该试剂盒价格昂贵，受此限制，目前在我国尚未推广应用， 并且，这种试剂盒中的精子核蛋白裂解液采用聚乙二醇辛基苯基醚，十二垸基 碘酸钠等成份，这些成份均为化学试剂，其异味、刺激性及腐蚀性较大，并具 有毒性成份，污染环境等。
发明内容
本发明的目的是，提供一种精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片的方 法，使它具有造价低、无腐蚀，无毒，操作简便，易于推广的优点。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现 一种精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片的方法，其步骤如下① 精确配制精子裂解液精子裂解液为每100毫升蒸馏水中含三羟甲基氨基甲垸4.844克、氯化钠 11.7克、二硫苏糖醇1.86克、皂角提取物8.12克及乙二胺四乙酸二钠盐12.32 克，PH值为7.5;② 将裂解液置入4'C保存2周，使用前L5小时取出，置入22'C室温内；③ 将精液稀释至5—10X10Vml，在室温37°(:下将0.31111的精液稀释，加 入0.7毫升的1%低熔点琼脂糖内，混匀；④ 取稀释精液50微升置入用0.65%琼脂糖处理好的载玻片上，盖上22X 22mm盖玻片，放置在冰箱内5分钟，冰箱内温度为4'C;⑤ 冰箱内取出后将盖玻片移走，将载玻片水平浸入0.08摩尔盐酸(HC1) 中变性7分钟取出；⑥ 步骤⑤中取走的载玻片再水平浸入步骤①中所述的精子裂解液中20分钟；⑦ 将步骤(D中的载玻片缓冲液冲洗5分钟，缓冲液中各物质及含量为三 羟甲基氨基甲垸10.78克/升，硼酸5.5克/升及乙二胺四乙酸二钠盐0.58克/升；@用70%、卯％、 100%乙醇各2分钟脱水；(D用瑞氏法或姬姆萨一瑞氏法或天蓝法染精子，在光学显微镜下观察分析 精子DAN碎片。本发明的方法,为我国推广应用SCD方法检测精子DNA完整性提供了重 要的基础。本发明所述方法中采用的裂解液用皂角或桔梗提取物替代了化学试 剂，从而减少了化学试剂的应用，减少污染、无刺激性、无腐蚀、无毒，并使裂解液制造成本大幅降低，易于推广应用。本发明裂解液为精子染色质扩散实 验试剂盒的裂解液，试验结果表明采用本发明所述的裂解液用SCD方法检测精子DNA完整性的效果与国外同类试剂盒的检测效果完整性一致。SCD试 验后经染色能够在光学显微镜下清晰的观察保留尾巴的单个精子DNA的完整 性，根据晕环的大小，能够准确判定精子DNA是否有碎片，从而对男性生育 力进行准确评估。本发明所述方法可由附图l、 2、 3、 4、 5、 6、 7中清楚得出正常精子没 有DNA碎片，具有大大的晕环或中等晕环，如附图l、 2所示，存在DNA碎 片的精子没有晕环形成或有很小的晕环，或没有晕环且着色很淡，呈退化迹象， 如附图3、 4、 5所示。上述试验进一步表明，本发明方法能够准确判定精子 DNA是否具有完整性。上述试验结果还可具体描述为计数500个精子，观 察精子晕环大小，根据晕环与精子头部横径的比例，粗分为大、中、小和无晕 环4个等级，大和中晕环表示精子DNA完整无碎片，小和无晕环表示精子DNA 断裂为碎片。小晕环以《精子头直径四分之一为判断标准，中晕环>精子头直 径四分之一而《精子头直径三分之二，大环晕>精子头直径三分之二。本发明方法中的裂解液所含的皂角或桔梗提取物不使蛋白变性，丝毫不破 坏精子尾部。本发明方法中所述的裂解液实现了精子DNA检测简单、快赵、 准确、廉价、分辨率高的目的。本发明的方法还具有操作简便、准确性好，分 辨率高及成本低等优点。本发明的方法以试剂盒商品推广应用，试剂盒包括1、 DNA变性染液；2、 精子核蛋白裂解液；DNA变性染液为公知技术。
附图1是呈现大晕环的正常精子；附图2是呈现中晕环的正常精子；附图 3是呈现极小晕环的有DNA碎片的异常精子；附图4是没有晕环的有DNA碎 片的异常精子；附图5是没有晕环且退化的精子；附图3、 4、 5所示均为有 DNA碎片的异常精子；附图6是有三个正常精子和一个异常精子的图片；附 图7是有两个正常精子和三个异常精子的图片。上述图片均为采用本发明方法进行检验的结果。
具体实施方式
本发明所述的一种精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片的方法，其步 骤如下① 精确配制精子裂解液精子裂解液为每100亳升蒸馏水中含三羟甲基氨基甲烷4.844克、氯化钠 11.7克、二硫苏糖醇1.86克、皂角或桔梗提取物8.12克及乙二胺四乙酸二钠 盐12.32克，PH值为7，5;② 将裂解液置入4'C保存2周，使用前1.5小时取出，置入22'C室温内；③ 将精液稀释至5—10X106/1111，在室温37'C下将(Uml的精液稀释，加 入0.7毫升的1V。低熔点琼脂糖内，混匀；④ 取稀释精液50微升置入用0.65%琼脂糖处理好的载玻片上，盖上22 X 22mm盖玻片，放置在冰箱内5分钟，冰箱内温度为4'C;(D冰箱内取出后将盖玻片移走，将载玻片水平浸入0.08摩尔盐酸(HC1) 中变性7分钟取出；⑥ 步骤⑤中取走的载玻片再水平浸入步骤①中所述的精子裂解液中20分
钟；
⑦ 将步骤⑥中的载玻片缓冲液冲洗5分钟，缓冲液中的各物质及含量为 三羟甲基氨基甲烷10.78克/升、硼酸5.5克/升及乙二胺四乙酸二钠盐0.58克/ 升；
@用70%、 90%、 100%乙醇各2分钟脱水；
(D用瑞氏法或姬姆萨一瑞氏法或天蓝法染精子，在光学显微镜下观察分析 精子DAN碎片。
权利要求
1、一种精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片的方法，其特征在于其步骤如下①精确配制精子裂解液精子裂解液为每100毫升蒸馏水中含三羟甲基氨基甲烷4.844克、氯化钠11.7克、二硫苏糖醇1.86克、皂角提取物8.12克及乙二胺四乙酸二钠盐12.32克，PH值为7.5；②将裂解液置入4℃保存2周，使用前1.5小时取出，置入22℃室温内；③将精液稀释至5-10×106/ml，在室温37℃下将0.3ml的精液稀释，加入0.7毫升的1％低熔点琼脂糖内，混匀；④取稀释精液50微升置入用0.65％琼脂糖处理好的载玻片上，盖上22×22mm盖玻片，放置在冰箱内5分钟，冰箱内温度为4℃；⑤冰箱内取出后将盖玻片移走，将载玻片水平浸入0.08摩尔盐酸(HCl)中变性7分钟取出；⑥步骤⑤中取走的载玻片再水平浸入步骤①中所述的精子裂解液中20分钟；⑦将步骤⑥中的载玻片缓冲液冲洗5分钟，缓冲液中各物质及含量为三羟甲基氨基甲烷10.78克/升，硼酸5.5克/升及乙二胺四乙酸二钠盐0.58克/升；⑧用70％、90％、100％乙醇各2分钟脱水；⑨用瑞氏法或姬姆萨-瑞氏法或天蓝法染精子，在光学显微镜下观察分析精子DAN碎片。
全文摘要
本发明公开了一种精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片的方法，其步骤如下①精确配制精子裂解液；②将裂解液置入4℃保存2周，使用前1.5小时取出，置入22℃室温内；③将精液稀释至5-10×10<sup>6</sup>/ml；④取稀释精液50微升放置在冰箱内5分钟，冰箱内温度为4℃；⑤冰箱内取出后将盖玻片移走，将载玻片水平浸入盐酸中变性7分钟取出；⑥步骤⑤中取走的载玻片再水平浸入步骤①中所述的精子裂解液中20分钟；⑦将步骤⑥中的载玻片缓冲液冲洗5分钟；⑧用乙醇各2分钟脱水；⑨用瑞氏法或姬姆萨-瑞氏法或天蓝法染精子，在光学显微镜下观察分析精子DAN碎片。本发明方法实现了精子DNA检测简单、快速、准确、廉价、分辨率高的目的。
文档编号G01N1/30GK101319251SQ20081001650
公开日2008年12月10日 申请日期2008年5月28日 优先权日2008年5月28日
发明者张丽红, 王磊光, 毅 邱 申请人:山东省计划生育科学技术研究所