专利名称：糖尿病遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体糖尿病遗传易感性的试剂盒， 通过同时检测与糖尿病密切相关的脂联素基因(ADIP0Q)、白介素6基因(IL-6)、脂蛋A脂酶基因(LPL)、 维生素D受体基因(VDR)上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体糖尿病遗传易感性。
背景技术：
糖尿病是由于胰岛素分泌不足或相对不足以及发生胰岛素抵抗，引起糖、蛋白质、脂肪、水和电解质 等一系列代谢紊乱的疾病。临床以高血糖为主要标志，通常表现为"三多一少"，即多食、多尿、多饮、 体重减轻。病情严重时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。
糖尿病虽不直接致命，但久病可引起多个系统损害。常见并发症有肺结核、化脓性皮肤病、高脂血症、 动脉粥样硬化、冠心病、肾病、白内障、眼底视网膜病变及神经病变，许多并发症不仅会严重影响生活质 量，还有较高的致死率。目前我国糖尿病爆发性流行的形势十分严峻，由于大众生活水平的提高，很多人 不注意保持良好生活习惯，饮食无度，使得近年来糖尿病发病率迅速攀升。据人S'日报报道，我国糖尿病 发病率约5%，患者人数居世界第二位。
ADIPOQ基因主要在脂肪组织中表达，编码一种在结构上与胶原X和VI以及补体Clq类似的蛋白质， 进入血液循环。当携带风险基因型时，ADIPOQ基因表达量可能会降低，引起血浆脂联素浓度偏低，脂肪 酸氧化减少，影响机体的胰岛素敏感性。同时，骨骼肌胰岛素受体酪氨酸磷酸化作用减弱，易导致全身胰 岛素敏感性下降，产生胰岛素抵抗，使糖尿病的风险增加。
IL-6基因编码的白介素6是细胞因子家族中的成员，作为一种前炎性细胞因子，它可由多种细胞产丰， 基础状态下血浆中IL-6水平主要来自脂肪组织分泌，作为一种自分泌、旁分泌和内分泌激素刺激肝细胞生
成多种急性时相的蛋白质调节机体免疫，参与体内的脂肪、葡萄糖等能量代谢，诱导胰岛素抵抗，破坏e
胰岛细胞，在糖尿病发生发展中起着重要作用。因此，当IL-6过量表达时，会引起胰岛素抵抗，从而诱发 糖尿病。当携带风险基因型时，白细胞介素6表达增加，影响脂肪代谢，干扰胰岛素信号传导系统，降低 胰岛素敏感性，引起胰岛素抵抗，导致糖尿病发生风险增加。
,LPL基因主要在心脏、肌肉和脂肪组织中表达，其编码的脂蛋白脂酶能够催化极低密度脂蛋白或者低 密度脂蛋白的水解，参与脂质代谢的通路。该基因的变异在严重的情况下可以导致I型高脂蛋白血症，而 较轻程度下则引起体内脂蛋白代谢紊乱，从而干扰胰岛素的作用，引发糖尿病。当'携带风险基因型时，脂 蛋白脂酶活性偏低，血脂整体升高，乳糜微粒和极低密度脂蛋白水平升高，低密度脂蛋白和高密度脂蛋白 水平降低，易引起体内脂蛋白代谢紊乱，从而诱发糖尿病。
VDR编码维生素D3的核激素受体，不仅分布在肠、骨、肾，还分布于甲状旁腺、胰岛细胞、造血干 细胞、活化的淋巴细胞等。该蛋白与维生素.D结合，对基因表达进行调节，主要通过一系列代谢反应通路， 包括免疫反应和肿瘤激活通路，具有调控维生素D生理活性的作用。该基因的突变会导致维生素D活性
的下降，减弱细胞免疫应答能力，削弱胰岛e细胞的再生和修复能力，使胰岛素分泌下降，诱发糖尿病， 当出现风险基因型时，维生素D的活性作用降低，对胰岛e细胞的保护作用降低，胰岛素分泌量下降，易
引发糖尿病。
发明内容
基于脂联素基因(ADIP0Q)、白介素6基因(IL-6)、脂蛋白脂酶基因(LPL)、维生素D受体基因(VDR) 上的4个SNP位点多态性可用来评估个体糖尿病遗传易感性的基础上，本发明提供一种检测个体糖尿病遗 传易感性的试剂盒。
该试剂盒包括
检测ADIPOQ基因上Glyl5Gly SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测IL-6基因上G-572C SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测LPL基因上PvuII SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；检测VDR基因上Fokl SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)。 本试剂盒中所述的引物对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，并可用常螺,的合成技术进行合成。 本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，'特异性荧光探针对可用 常规的探针合成技术进行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括
10 X荧光定量PCR反应缓冲液4^1，
25mM dNTP混合液0.4^1,
25mM MgC12溶液2. 4^1，
5units/jil Taq DNA聚合酶0. 01^1，
20幽特异性引物对每条引物各0.225nl,
IOMM特异性荧光探针对每条探针各0.25^,
去离子水21.3^1。 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，分别进行4次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为 总体积1(^1,包含浓度为20ng/jxl的DNA模板2^1、 lpl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. lpl 25mM dNTP. 混合液、0.6nl 25mM MgCl2溶液、0.025^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20-的有义引物和反义引物 各0.225^1、 KHiM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25^1，去离子水5.325^1。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为5(TC、 2分钟，95'C、 IO分钟，进行60个循环的95'C、 30秒， 60'C、 l分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤4:基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.应用检测试剂盒进行个体糖尿病遗传易感性检测的服务 步骤l: DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的ADIPOQ基因上Glyl5GlySNP位点、IL-6基因上 G-572C SNP位点、LPL基因上PvuII SNP位点和VDR基因上Fokl SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定 这4个SNP位点的基因型。步骤3:个体糖尿病遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体糖尿病遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被 检测者糖尿病遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体糖尿病遗传易感性分析报告单。
权利要求
1.一种检测个体糖尿病遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测脂联素基因(ADIPOQ)上Gly15Gly SNP位点、白介素6基因(IL-6)上G-572C SNP位点、脂蛋白脂酶基因(LPL)上PvuII SNP位点、维生素D受体基因(VDR)上FokI SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括10 X荧光定量PCR反应 缓冲液糾，25mMdNTP混合液0.糾，25mMMgC12溶液2. 4W， 5unitsAa Taq DMA聚合酶0.01W， 20141 特异性引物对每条引物各0.225W， IOMM特异性荧光探针对每条探针各0.25W，去离子水21.3W。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
全文摘要
本发明公开了一种检测糖尿病遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测脂联素基因(ADIPOQ)、白介素6基因(IL-6)、脂蛋白脂酶基因(LPL)、维生素D受体基因(VDR)上的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与糖尿病遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体糖尿病遗传风险。
文档编号G01N21/64GK101608222SQ20081003926
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司