专利名称：转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用环介导織广增(LAMP)技术与纳米硫电化学DNA传/im^TO检测转基因夕卜源基m~~§ 素^^ (nptii)的方法，即转基因植物中新霉素磷^^m因的传 背景技术磷^^,eomycinPhosphotransferase II， NPTII)基因;i^今植tlJi^^化中鹏最为广泛的选擀祝。縫因编码新霉素磷,移K ^Si:g:-3,-磷,移嫩3111]110浙0)*3'*31)11011^隱11)，其编码^M^SIf^C^教aminoglycoside angibk)tics)如卡那霉素(kanamycin^Km)、新霉素 (neomycin)、 G418纖酸化而失活。卡那霉籍ftM^^m能与植物细胞赠柳離体中的核 糖体30S小亚凝蹈合，影响70S趟^;^I的形成，干扰Bli录体^f立体的蛋白质合成，从而导雜 物细胞死亡。NPTII基因在转基因玉米、转基因番茄、转基因马铃薯、转基因油菜中广g用，中国国 家标准中把可以NPTII基因作为转基因检测的^S因。ii^现有^1ti仿法都^S于PCR mt荧光pcr的，没有4顿环介导^mr增^^测NFrn基因的，也没有W^顿环介导^^增技术与纳米标己电化学DNA传KS;^ffl检测NPTn基因附艮导，且现有^^法#4检 ^*高、耗时长 点o发明内容本发明的目的^lt糊米硫化铅被己电化学DNA传iife术与环介导^a扩增糊检测NPTII基因 的方法，以划艮现有技术 点，从而为转基因产品的检测^ft简单灵敏的方法。本发明的顿原理为(1) ^^设it"^且可以iR5脾巴DNA六个不同序列的两个内弓嫩(上游内引 物和下游内弓卿)和两个外弓嫩(上嫩卜引物和下嫩卜弓嫩)，内引t^含耙DNA的!BC链和反义练(2)其中一个内引牧rt先和耙DNA杂交，te的^S换DNA合 具^^度 换活性的DNA聚 娜的参与下由^t外引物启动，释放出单链DNA，荆乍为由杂效鹏的另一端的一个内引物和一个外 引物启动的DNA合^t反，产生一个原始的茎环DNA; (3)内弓嫩以原始執DNAf^，启动链 置换DNA的合成，产生一个原始的新DNA和一愤的由两倍茎诚的執DNA; (4)在離斜牛 下，内引物以茎环DNA为模阪，iiaSB^^成多^tWlEDNASfiJ^鹏茎环DNA，在一小时内 该循环a^r使耙DNA累积到l(f拷贝。扩增的^J与纳^^立子标己DNA徽电化学传li^相结合， a3l电极表面的^T杂交和高灵i^的电化^l!啶，从而^"增^的多少转化为电信号的测定结果。本发明的检测^a^括以下步骤首5feafi^介导^r增得到扩ms^物-新霉素磷^^sis因的双链目标序列、離m^链目标序列^7K浴中热J ^^链目标序列后錢电极表面自组装固定，艮p得到新霄素憐^t移,因的目标序列《,电极、然后将纟|^^硫化铅对来源 霉素磷酸转移 因的探针靜U进行丰新己得到^Hfl^f序列，将该^E^f"序列与目标序列《,电丰肚的目标序列进行^ 杂交并进行同位棘阳极溶出法的电化翔啶，且环介导^^扩增鹏中有(i)环介导^r增鹏瓶包括lOxlheimopol ^Ri^爰冲液、300—500nmoI/LdNTP、 2—4證ol/L硫,、0.8—1.2 pmol上游5内引物、0.8—1.2jimol/L下游内引物、0.2—0.3pmol/L上齢卜弓l物、0.2—03 nmol/L下微卜引物和l一 1.5 mol/L甜菜碱，1 U/pLUNG酶；其中lOxThetmopol SiMi冲液含有200 mmol /LpH8.8的三羟基甲基氨 基甲烷一盐酸、10Ommol/l氯化钾、100mmol/l硫,、20mmoI/l硫M^和1X曲j顿x-100; 其中，上游内引物5-CTGATAGCGGTCCGCCACACGGAAAATGGCCGCTnTCTG-3 、下游内引物5隱ACATAGCGTrGGCTACCCGTGAGCGATACCGTAAAGCACGAG墨3、 上齢卜弓l物5-TGCTTGCCGAATArCATGGT-3 、 下齡卜弓慨5"CGATAGAAGGCGATGCGC-3;(2) BstDNA聚銻8U/nL 。上述的dNTP内的四种I^t糖M的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:l:l:l。 战环介导離扩增(LAMP)鹏液每管23 nL的劇赵5^J: 2.5 pL lOxTh画pol鹏劍液、 1.0 nL 1Ommol/L dNTP (四种脱ft^糖核酸的混彌)、1.020 pmol/L上游内引物(FIP)、 1.0 pL 20 Mmol/L下游内引物(BIP)、 0.25^L20nmol/L上微卜弓嫩(F3)、 0.25ML20Mmol/L下微卜弓卿(B3)、 0.5pL100mmol/LMgSO4、 12.5^2^4甜|^口4&細20 (灭菌双蒸水)。(3) 纳米硫化铅(PbS)撒序列硫液，其制备方法如下将8.0-13.0 mL驢乙働瞎iJ 50.0mL浓度为02"0.5mmol/l的石B^IS (Pb(NO3)2)溶液中混合均匀， 用0.4^0.6 mol/L Sft化钠(NaOH)溶液调节混合液的pHit^勺为7,通氮气麟20-45min后，在to i^^和氮气f跌下向战混合液中缓慢滴加1.2-1.6 mmo]/L的硫化钠(NAS)溶液30.0mL。滴加完毕后， ^^20"30h,混合,fttfe^f色，即可得到纳米PbS溶胶。取5.0mL纳米PbS溶麟心纯化， 水te分散于2.0raL水中，加入100mL40."0.0mmol/L乙教3-二甲基氨S^二鹏MS (EDC)、 100 nL 40.,.0 mmoI/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS )及0.1 mmol/L ssDNA探针序列 (5'-CTCCGCGGCGAGCTAA-3')，室温下Jtft 15-20 h，该鹏鹏10000 r/minT^心2(M0 min，用 磷膨爰冲溶液(PBS)洗涤多次，再分散于PBS溶液中，f薛晗有丰斜己^f麻啲纳米PbS-^^序列 标己液，于-2°0下保剤寺用。(4) NPTII基因单链目标序列錢电极表面的固定 将金电极在^!R比为3:7的30n双tt7j^口浓,阶混合溶液中力口热5min，以除去有tT^质；然后将谈金电鹏0.05nm的三割仁铝(Al2Oj)悬浊Wfc，鶴依次在翻、乙醇、二次蒸馏水中超声洗 漆Mmin，般电极表面^)t滑镜面，然JggA8.(M4.0mmol/L織乙酸溶液中，室温下^^碟10-15 h，取出后用大*7乂浸泡冲洗，艮隙至喊基乙酸自组SM,的金电极(SAM/Au);将NPTII基因的扩 增，双链目标序列在IOO 'C7jC浴中煮沸10溯，然后在冰浴中'^I7賴时薛IJNPTII基因单链目标摔 歹lj;将SAM/Au电极ftA含4.0"6.0腿ol/L乙S(3-二甲基氨l^)^二Wa離(EDC)禾n8,0mmol/L N-^^珀M安(NHS)的PBS溶液中活化30min，然后ftX含有NPTlI基因单链目标序列的PBS缓 冲液(pH7.4)中，25T保存12h，取出电卞版用缝PBS冲冼除去未固定的NFni基因单链目标序 歹!)，就可以得到固魏NPTII基因单链目标序列制,电极(ssDNA/SAM/Au)。(5) 上逝斷布电极上固定的>^11基因单链目标序列与纳米？&3- Mf序列标己液中的标己^^序 列的杂顿进行电化翔J定将固定了^11基因单链目标序列糊,电丰^^内米？68- W"序列iHB液中，40T水浴中反应 30-50min，自鋭糊，取出后用含0.1%十二^i^, SDS的磷,冲溶液(PBS)浸泡并鹏电极， 除去未杂交的标己微序列；用150ML1.0mol/LHNO3溶解金电极表面的纳米硫化铅(PbS) "min， 将所ff^^至3mL醋,(NaOAoHOAc)缓冲溶液中(pH=4.7，含1.8xl()4mol/LHg^)。以玻碳电 极为工作电极，NaOAoHOAc为电解质，細同位,阳极溶出法测定释放出的Pb2、子，以七.84V处 的阳极溶出峰为测量信号，电化学工作站的^^[如下伤麥、时间300 s，伤3只电位-l.lV，电位增量 0.004 V，振幅0.05V，脉冲驢0.06s，采样宽度0.02s，脉冲周期0.25。娜战施检测转基因外源基因NPTII驗法，依次包括下列步戰l)-(3):(1) 待检样品DNA的提恥^顿样品核酸，提取方法不限定，只要會^^iffi^取的DNAOD260/280軎濒超iJl.6"2.0即可，浓 鹏U 10-100 ng/nL就可以。即提取待检样品DNA作为环介导#^扩增鹏6^，其中提取样品DNA 的OEbeo280在1.6"2.0范围内，lO-lOOng/^L范围内；(2) 进行NPTII基因环介导^W增:鹏A_ 23jiL LAMP ^^液的鹏管中力口入1mL待检样品,DNA，和0.5pL的UNG酶，于恒船K浴上50。C體3min，于恒温95 。C體3—5min，立即置于冰上1 —3 min;B. 在鹏管中加入lpLBstDNA聚彌；C. 于恒温60—65。C腿45—90min;D. 将離调到80—95 。C，鹏3—5min后中lhgm薛杯介导^W"增鹏的NPTlI基因双链目 标序列扩增，的双链目标序列，取出待用。(3) NPTn基因单链目标序列錢电极表面的固定 将J^M导NPTII基因双链目标序列扩增，的双链目标序列在100 。C7K浴中薪弗10溯，然后在冰浴中'^I74^P得到NPTI1基因单链目标序列(目标ssDNA)，将SAM/Au电极^A含4.0^6.0 mmol/L EDC和目标ssDNA的MES缓冲液中20-30 保存15-25 h，取出电丰鹏赠PBS冲冼5 min除去为固 定的目标ssDNA，即得到固定有目标ssDNA的修饰电极(ssDNA/SAM/Au)。(4) ，的纳米PbS"W"序列fei己液中附giamf序列与固定^hM电feJl的目标ssDNA杂交得 到纳賴射己微-目敏链腿固定了目标ssDNA的^W电卞诚JCAMf序列^HB液中，40^水浴中SiS30"50min，自然冷却，取 出后用含0.1%808的？88浸泡并冲冼电极，除去未杂交的丰莉己探针序列，即得到纳賴斜^N目标 双链DNA。(5) iH己TO"-目标观链DNA的电化^il定用150pL1.0mol/LHNO3溶解金电极表面上的^iB微-目标观链DNA上的纳米硫化铅(PbS)冬8 min，将戶屑離鹏至3mL酉t^k缓冲溶液(NaOAoHOAc)中(pH=4.7，含1.8xl()4mo]/LH^+)。以 电极为工作电极，NaOAc-HOAc为E^f质，，同位,阳极溶出法测定释放出的Pb,子，以-0.84 V处的阳极溶出峰为测量信号，i^号即为电化^^测转基因植物中新霉素磷^^l^因的依据，电 化学工作站的实^#1^口下沉积时间300s，沉积电位-UV，电位增量0.004^振幅0,05V，脉冲宽 度0.06s，采样宽度0.02s，脉冲周期0,2s。
具体实施方式
下列^M例进"^i兑明本发明，但不应当作对本发明的限制。 鄉例l按下歹鹏方制作纳米PbS-徽序歹诉斜激(i)乡脒PbS5(Wf序列的硫将11.0 mL统基乙,瞎U 50.0 mL浓度为0.4 mmol/L的Pb(NO3)2溶液中混合均匀,用0.5 mol/LNaOH 溶液调节混合液的pHf^勺为7，通氮气線30 min后，在m^TF向J^混合液中缓漫滴加1.5 mmol/L 的Na2S溶液30,0mL (氮气微)。滴加完毕后，懇 ^24 h，混合^M郝i^^色。i^^鄉恪 的PbS量子点具有良好的稳定性。取5.0mLPbS纳米溶麟'C^6化，7Kte分散于2.0mL水中，加入100 mL50.0mmol/LEDC、 100 pL 50.0 mmol/LNHS及0.1 mmoI/L^tf"序列，室温下,18h， i^g^鹏10000 r/minTM心30 min，用 PBS溶液洗涤多次，再分散于PBS溶液中，f薛糊米PbS-微序列fei己液，于-2T下保存。按照以下辦进微测(1) 样品DNA的提取GBT 19495.3-2004方S^取样品的DNA。(2) 进行转基因5^t (品系MON802)的NPTn基因环介导^UT增目A. ^^23^1^\^/5^液八的/5^管中力口入1^待检繊DNA，和0,5nLUNG酶，于度温 7jC浴上50。C腿3mJn, 95。C方爐5min，立即置于冰上1 min;B. 在ffi管中力口入1 pLBstDNA聚彌；C. 于H^7jc浴上65 。C體1小咏D. 将水浴调到80。C，鹏3min后中止Si^取出鹏管，艮P得到环介导^a扩增鹏的NPTII基 因WT增，的双链目标序列，将其^A4t:恒温待用。(3) NPTII基因单链目标序列在金电极表面的固定 将将金电极在^f只比为3:7的30。/。双^7KfP浓自的混合溶液中加热5min，以除去有lfl^质；然后将金电丰細0.05拜的^203悬浊 ^， ^ 依次在翻、乙醇、二次蒸tg7jC超声2min'《脸电极表 面)t^t^面，然后mAl0.0mmol/l驢乙e^液中，室温下ii^iS装12h，取出后用^MtK浸泡冲 洗，即得到巯基乙醇自组SJK,的金电极(SAM/Au)。将环介导^^广增鹏的NPTlI基因^r增产物的双链目标序列在ioo 。C7jc浴中^^io溯，然后在冰浴中'l^i辨卩得到NFrn基因单链目标膀U(目标ssDNA)，将SAM/Au电极MA含5.0mmol/LEDC和目标ssDNA的MES缓冲液中25^保存18 h,取出电f細娃PBS冲洗5 min除去未固定的目标ssDNA，即得到ssDNA/SAM/Au。(4) 纳米PbS"Mf序列iHB液中,射己^^序列与固定^hM电ai:的目标ssDNA杂効穀嗍米 标WN目敏链DNA:将固定了目标ssDNA飾,电fe&jCAW"序列feiB液中，40 t7K浴中鹏40min，自然冷却，取 出后用含0.1% SDS的PBS浸泡并冲洗电极，除去未杂交WiH己Mf序列，即得到纳賴^3 ^-目标 双链DNA。(5) 纳米inamt"-目标改链DNA的电化^i啶用150 pL 1.0 mol/LHNOa溶解金电极表面上固定的纳*1射己 -目fe5^链DNA上的纳彩内米PbS85min，将所^^^^至3mL醋^i冲溶液中(pH=4.7，含1.8xl04mol/LHg^)。以繊电极为工作电 极，NaOAc-HOAc为^l 质，細同位織阳极溶出法测定释放出的Pb2、5以力.84 V处的阳极溶出 峰为测量信号，谢言号即为电化^^测出转基因植物中NFrlI基因的依据，电化学工作站的实^##*口 下^OR时间300s， ^^只电位-UV,电位增量0.004 V，振幅0.05V，脉冲驗0.06s，采样宽度0.02s， 脉冲周期0,2s。織例2按下列方法进fi^内米硫化铅t斜己电化学DNA传感技术与环介导等温扩增TO检测转基因番茄 (Zeneca)夕卜鹏因NPTII:(1) LAMP鹏膝含有15ML10xTliennopol^gi^l冲液、1.0ML10mmol/LdNTP、 1.0ML20Mmol/L上游内引物(F1P)、 1.0ML20Mmol/L下游内引物(BIP)、 0.25^L20pmol/L上嫩卜引物(F3)、 0.25pL20Mmol/L下齢卜引物 (B3)、 0.5ML100訓ol/LMgSO4、 12单2moI/L甜麯、1 U4iLUNG,B4jjLddH20 (顿職水)。 其中戶腿的上游内引物、下游内引物、上微卜引物、下微卜引物同上。 ，dNTP内的四种脱ftt亥糖核酸的混^tl的质量比为dUTP:dAIP:dGTP:dCTP= 2:1:1:1。(2) ; BstDNA聚鏑8U/mL; 按照以下辦进行舰(1) 样品DNA^JI取{顿GBT 19495.3-2004方^l取样品的DNA。(2) 进行NPTlI基因环介导^r增鹏A 23mL LAMP aS液的a^管中力口入1mL待检丰鎌DNA，和0.5mL的UNG酶，亍直温水浴上50。C廳3min， 95。C體5min，立即置于冰上lmin;B. 在M^管中力口入lnLBstDNA聚娜；C. 于恒船X浴上65。C總1 h;D. 将7K浴调到80'C，鹏3min后中lh&^取出^&m管，即得至杯介导^a扩增鹏的NPTII基 因的扩增，的双链目标序列，将其駄4。C恒温待用。(3) NPTII基因在金电极表面的固定 将金电极在体积比为3:7的30y汲ft7jO]浓硫酸的混合溶液中加热5min，以除去有IH^质；然后将金电丰細0.05Mm的Al2Q3悬浊M^;， ^*依次在翻、乙醇、二^^馏7爐声2min， 4脸电极表面 ;滑镜面，然JgMAl0.0mmol/L驢乙ll^液中，室温下Wia装12h，取出后用^M7K浸泡冲冼， 即得到统基乙醇自组^^,的金电极(SAM/Au)。将环介导^W增鹏的NPTII基因的扩增产吻的 双链目标序列在100 。C7K浴中蕭弗10姚然磁冰浴中鹏糊得到贈II基因单链目标序列(目 标ssDNA)，将SAM/Au电极^A含5.0 mmol/LEDC和目标ssDNA的MES缓冲液中251保存18 h， 取出电禾鹏^PBS冲冼5 min除去未固定的目标ssDNA，艮时导到ssDNA/SAM/Au。(4) 纳米PbS，序列feia液中辦^iaW"序列与固定&i^电fei:的目标ssDNA杂交得至糊米将固定了目标ssDNA附,电tMAW"序列iHa液中，40汇7]C浴中，40min，自然冷却，取出后用含0.1% SDS的PBS浸泡并冲冼电极，除去未杂交的fei己^f序列，即得到纳*)^己 ^-目标 双链DNA。(5) ^t私己^N目标双链DNA的电化翔啶 用150pL l.Omol/LHNQj溶解金电极表面上固定的纳^iHSMI"-目标汲链DNA上的纳^l米PbS 5min，将^W^赫至3mL^^I冲溶液中(pH=4.7，含1.8xl04mo]/LHg^)。以 电极为工作电 极，NaOAoHOAc为柳质，細同位線阳极溶出法测定释放出的Pb2^子，以4.84V处的阳极溶出 峰为测量信号，谢言号即为电化^t测转基因植物中新霉素磷^^移ltt因的依据，电化学工作站的实 3^^下^f只时间300s， 、Kf只电位-l.lV,电位增量0.004 V，振幅0.05V，脉冲ffi0.06s，采样 離0.02s，脉冲周期0,2s。核苷,列表<110>山东出入境检验检疫局1t验^S技术中心<120>转基因植物中新霉素磷酸转移 因的传 ^测方法<160>4<210>1<211>40<212>DNA<213> Al序列<221> prim—bind<222>(1)."(40)<400>1ctgatagcgg tccgccacac ggaaaatggc cgcttttctg 40<210>2〈11>42<212>DNA<213> AX序列<221> prim—bind<222>(1)...(42)<400>2acatagcgtt ggctacccgt gagcgatacc gtaaagcacg ag 42<210>3 <211>20 <212>DNA <213> AI序列<221>prim_bind<222>(1》..(20)<400>3tgcttgccga atatcatggt 20<210>4 <211> 18 <212>DNA <213> AI序列 <221> prim一bind <222>(1)...(18) ,0>4cgatagaagg cgatgcgc 18<210>5<211>21《12>DNA<213> AI序列<221> prim—bind《22>(1》..(21)<400>5Agcgataccg taaagcacga g 2权利要求
1.一种转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方法，其特征在于该方法有以下步骤环介导等温扩增反应得到扩增反应物-新霉素磷酸转移酶基因的双链目标序列、以及将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在金电极表面自组装固定，即得到新霉素磷酸转移酶基因的单链目标序列修饰电极、然后将纳米硫化铅对来源于新霉素磷酸转移酶基因的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与目标序列修饰电极上的目标序列进行分子杂交并进行阳极溶出法的电化学测定，所得电化学信号即为电化学检测转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的依据，且其中环介导等温扩增反应中有(1)环介导等温扩增反应液包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱，1U/μL UNG酶；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；其中，上游内引物5-CTGATAGCGGTCCGCCACACGGAAAATGGCCGCTTTTCTG-3、下游内引物5-ACATAGCGTTGGCTACCCGTGAGCGATACCGTAAAGCACGAG-3、上游外引物5-TGCTTGCCGAATATCATGGT-3、下游外引物5-CGATAGAAGGCGATGCGC-3；(2)Bst DNA聚合酶8U/μL。
2. 如权利要求1中所述的转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方 法，其特征是上述的dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为 dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。
3. 如权利要求1中所述的转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方 法，其特征是上述的环介导等温扩增反应依次包括下列步骤(1) 待检样品DNA的提取提取待检样品DNA作为环介导等温扩增反应的模板，其中提取样品DNA的光密 度值OD260/280在1.6-2.0范围内，浓度在10-100 ng/^L之内；(2) 进行环介导等温扩增反应A. 在装有23pLLAMP反应液的反应管中加入1 上述的待检样品模板DNA， 恒温50 。C放置3 min后于于恒温95 。C放置3 — 5min，立即置于冰上l一3min;B. 在反应管中加入lpLBstDNA聚合酶；C. 于恒温60 — 65 。C放置45 — 90 min;D. 将温度调到80 — 95 °C，反应3 — 5min后中止反应得到新霉素磷酸转移酶基因 双链目标序列扩增产物的双链目标序列，取出待用。
4. 如权利要求1中所述的转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方 法，其特征是上述的得到新霉素磷酸转移酶基因双链目标序列扩增产物的双链目标序 列在水浴中热解成新霉素磷酸转移酶基因单链目标序列后在金电极表面自组装固定 的步骤将金电极在体积比为3:7的30%双氧水和浓硫酸的混合溶液中加热5 min，以除去 有机杂质；然后将其金电极用0.05pm的三氧化二铝悬浊液抛光，接着依次在丙酮、 乙醇、二次蒸馏水中超声洗涤l-4min，使金电极表面成光滑镜面，然后浸入8.0-14.0 mmol/L巯基乙酸溶液中，室温下避光组装10-15 h，取出后用大量水浸泡冲洗，即得 到巯基乙酸自组装膜修饰的金电极；然后将新霉素磷酸转移酶基因双链目标序列扩增 产物的双链目标序列在100 'C水浴中煮沸IO分钟，然后在冰浴中快速冷却得到新霉 素磷酸转移酶基因的单链目标序列；将上述巯基乙酸自组装膜修饰的金电极浸入含 4.0-6.0 mmol/L乙基(3-二甲基氨丙酸)碳二亚胺盐酸盐和8.0 mmol/L N-羟基琥珀酰亚 胺的磷酸盐缓冲溶液中活化30 min，然后浸入含有单链目标序列的pH 7.4的磷酸盐缓 冲液中，25。C保存12 h，取出电极后用大量磷酸盐缓冲溶液冲洗5min除去未固定的 新霉素磷酸转移酶基因的单链目标序列，即得到固定有新霉素磷酸转移酶基因的单链目标序列修饰电极。
5. 如权利要求1中所述的转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方 法，其特征在于上述的纳米硫化铅对来源于新霉素磷酸转移酶基因的探针序列进行标 记得到纳米硫化铅-探针序列标记液，其步骤如下将8.0-13.0 pL巯基乙酸加到50.0mL浓度为0.2-0.5 mmol/L的硝酸铅溶液中混合 均匀，用0.4-0.6 mol/L氢氧化钠溶液调节混合液的pH值约为7，通氮气除氧20- 45min 后，在磁力搅拌和氮气保护下向上述混合液中缓慢滴加1.2-1.6 mmol/L的硫化钠溶液 30.0 mL，滴加完毕后，继续搅拌20-30 h，混合液逐渐地变成棕色，即可得到纳米硫 化铅溶胶。取5.0mL纳米硫化铅溶胶离心纯化，水洗后分散于2.0mL水中，加入100 40.0-60.0 mmol/L乙基(3-二甲基氨丙酸)碳二亚胺盐酸盐、100 pL 40.0-60.0 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺及0.1 mmol/L ssDNA探针序列5'-CTCCGCGGCGAGCTAA-3'，室 温下搅拌15-20 h，该反应物在10000 r/min下离心20-40 min，用磷酸盐缓冲溶液洗涤 多次，再分散于磷酸盐溶液中得到含有标记探针序列的纳米硫化铅-探针序列标记液， 于-2 。C下保存待用。
6.如权利要求1中所述的转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方 法，其特征是上述的纳米硫化铅-探针序列标记液中的标记探针序列与单链目标序列修 饰电极上的新霉素磷酸转移酶基因的单链目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳 极溶出法的电化学测定，其步骤如下将固定有新霉素磷酸转移酶基因的单链目标序列修饰电极放入纳米硫化镉-探针 序列标记液中，40 。C水浴中反应30-50 min，自然冷却，取出后用含0.1%十二烷基硫 酸钠的磷酸缓冲溶液磷酸盐缓冲溶液浸泡并冲洗电极，除去未杂交的标记探针序列； 用150 1.0 mol/L HN03溶解金电极表面的纳米硫化铅4-8 min，将所得溶液移至3 mLpH4.7的含1.8xl()4mol/L汞离子的醋酸盐缓冲溶液中，以玻碳电极为工作电极， 醋酸盐缓冲溶液为电解质，采用同位镀汞阳极溶出法即可测定出上述溶液中的铅离 子，所得的电化学信号即为电化学检测出转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的依 据。
全文摘要
本发明涉及一种转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方法，其特征是该方法包括以下步骤环介导等温扩增得到扩增反应物-新霉素磷酸转移酶基因的双链目标序列、将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在金电极表面自组装固定，即得到新霉素磷酸转移酶基因的目标序列修饰电极、然后将纳米硫化铅对来源于新霉素磷酸转移酶基因的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与目标序列修饰电极上的目标序列进行分子杂交，并进行同位镀汞阳极溶出法的电化学测定，检测出相应的铅离子，其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且使用方便。
文档编号G01N27/327GK101260440SQ20081009398
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者刘彩霞, 伟 孙, 敏 孙, 奎 焦, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心