专利名称：：HIV-1p24抗原吖啶酯化学发光免疫分析检测方法
技术领域：
：本发明属于临床血液检测分析方法
技术领域：
，具体涉及一种用于临床和实验室检测HIV-1p24抗原的方法。该方法灵敏度高、检测范围宽、搡作简便，在新生儿HIV-1感染的诊断、HIV-1感染者病情发展的监测、耐药性监测、抗病毒治疗效果的评价等方面有重要应用。技术背景HIV-1(Humanimmunodeficiencyvirus)病毒感染人体之后,在宿主细胞和病毒中会产生一些HIV感染的标志性物质(NielT.Constantine，HollyZink.HIVtestingtechnologiesaftertwodecadesofevolution.IndianJMedRes121.2005:519-524),通过这些标志物我们可以进行病毒检验、监测病毒在体内的复制情况、了解感染后病情的发展、并实时掌握人体的免疫系统状况。病毒感染后，这些标志物随着病毒侵染过程，p24抗原作为标志物之一，在病毒诊断方面受到了人们的广泛关注。通常来讲HIV-1的核酸(RNA)检测是灵敏性和特异性的方法，但是在实际应用方面，核酸检验具有很多不便于推广的因素。核酸检测同其它检验方法相比，所需的实验费用比较昂贵，所需的实验仪器和实验条件也比较苛刻。另外，核酸检验的操作复杂，为了增加检验结果的可靠性，就要求实验操作人员有比较高的专业操作水平。同时，核酸实验整体耗时较长。而从全球艾滋病毒感染者的分布情况来看(■IDS,WHO.AIDSepidemicupdate2006.)，大部分的感染者都分布在经济不发达的地区，如非洲等，这就为HIV-l的RNA4企测在不发达地区的推广造成了不便。为了解决这一方面的问题人们在其它检验方法上估支了4艮多尝试，如全淋巴细胞计数、红细胞检测、血清白蛋白检测、p24抗原检测、抗p24抗体检测等，试图以此来替代核酸检测方法进行艾滋病的相关检测，其中HIV-1p24抗原检测方法的研究最为广泛。在新生儿HIV-l诊断、HIV-l感染者病情发展的监测、抗病毒治疗效果的检验等方面都具有4艮好的效果，并同核酸;险测方法具有4艮好的相关性，有望替代核酸才企测在广大不发达地区广泛推广。常用的HIV-1p24抗原;险测方法为酶联免疫分析法(Enzymelinkedimmuno-sorbentassay,ELISA),并多采用双抗夹心法进行检测，检测的灵敏度在3.5-10pg/ml，检测宽度在2-3个数量级。为了提高检测灵敏度，使HIV-1p24抗原检测方法能在检测灵敏性和特异性方面不断接近核酸检测的水平，在过去的二十几年时间里人们在普通ELISA基础上做了各种改进，其中最为成功的方法有ELASTELISA方法和IPCR(Immunepolymerasechainreaction)-ELISA方法等。Ledergerberetal在文献中报道，应用ELASTELISA方法(Perkin-ElmerLifeSciences,Boston,MA)进行HIV-1型p24抗原的检测，其才全测限可以达到0.5pg/ml。JanetM.Barletta应用免疫PCR方法同ELISA方法(Zeptomertrix，Buffalo,NY)结合，检测低限可以达到1000个p24抗原分子。但/人实际应用中来分析以上两种方法第一种方法所应用的》丈大体系主要是生物素-链亲和素放大系统，这种体系常会在血清样品检验中出现非特异性的反应，同时引入放大系统后操作步骤增加，反应时间也会延长，为了减少非特异性反应洗涤次数也要增加；第二种体系中引入的免疫PCR反应，在反应时间和操作步骤上增加难度之外，在核酸标记反应上也为实验体系的操作上增加了不便。化学发光免疫分析方法其原理与酶联免疫方法相似，是把化学发光物质与免疫学反应结合起来，用光反应表现被测的免疫成分浓度。即把高灵敏的光反应与特异性的免疫学反应相结合，用发光强度来对抗原、抗体等物质进行定量分析的方法。其中化学发光是伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质在进行化学反应时吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应产物从分子状态激发到电子激发态。当电子从激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级时产生辐射，多余的能量以光子的形式释放出来，这一现象称为化学发光(吴建民.临床化学自动化免疫分析.科学出版社，2000)。化学发光免疫分析方法自身具有灵敏度很高的灵敏性(C.Dodeigne,LThunus,R.Lejeime.ChemiluminescenceasDiagnosticTool.Talanta2000,51:415-439)，由于不需要外来光源，避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音，因而本底低且具有比荧光法更高的信噪比，其灵敏度比酶联免疫分析或放射性免疫分析方法高1至2个数量级;另外化学发光试剂本身也有检测线性范围宽的优点A.C.Calokerinos,N.T.Deftereos，W.R.G.Baeyens.ChemiluminescenceinDrugAssay.JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis.1995，13:1063-1071.),可达6-7个lt量级。吖啶酯类化合物作为一种常用的化学发光试剂，在化学发光免疫分析体系的研究中得到了广泛的关注。它具有灵敏度高、容易标记到蛋白、多肽和小分子上的优点。而且由于吖啶酯或吖咬磺酰胺类化合物在有11202的稀碱溶液中即能发生化学发光，无需催化过程，也不需要增强剂，从而降低了背景发光，提高了信噪比，干扰作用少，因此是化学发光免疫分析的理想的发光底物。例如，美国CibaCorning公司研制的ACS-180免疫分析试剂盒体系就是采用二曱基吖啶酯直接标记的，灵敏度可达10—15g/l。用来进行固相免疫学反应的吖啶酯类化合物可以选择4-(2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-曱基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐(AcridiniumC2NHSEster)等，目前已临床用于曱状腺功能、生殖生理、肿瘤标志物、药物监测及心血管等多个项目得到应用。但还未见有吖咬酯化学发光免疫分析检测方法用于HIV-lp24抗原4企测的才艮道。
发明内容本发明的目的在于提供一种灵敏度高、检测范围宽、简单、快捷，便于自动化的HIV-1p24抗原吖啶酯化学发光免疫分析检测方法。本发明采用双抗夹心的方法，以激发剂激发标记于抗HIV-1p24抗体上的吖咬酯发光，进行HIV-1p24抗原的定性和定量分析，具体步骤如下(1)用抗HIV-1p24抗体对固相载体进行包被；(2)处理HIV-1样品，即解离HIV-1样品，分离HIV-1p24抗原；(3)将步骤(2)中处理后的HIV-1样品和吖啶酯类化合物标记的抗HIV-1p24配对抗体加入步骤(1)中的反应体系进行免疫反应；(4)将激发剂1和激发剂2加入步骤(3)中的反应体系，进行化学发光反应；(5)检测步骤(4)中化学发光反应产生的光子数，进行定性或/和定量分析。其中，步骤(1)中的抗HIV-1p24抗体可以对各种各样的固相载体进行包被，如聚苯乙烯乳胶、聚苯乙烯塑料制品、聚氯乙烯塑料制品、脂质体、免疫磁性微珠等。步骤(2)中所述的HIV-1样品为任意来源的HIV-1p卩4抗原。任意来源是指，HIV-1艾滋病毒感染者的血液、以HIV-l病毒侵染细胞后得到的细胞培养产物、以原核生物或真核生物为表达载体根据基因工程而得到的p24重组抗原。其中，血液需要通过物理方法离心得到血清。细胞培养产物需要物理方法、化学方法和生物方法使其裂解，离心取其上清。重组抗原需要通过物理方法、化学方法和生物方法使其纯化。血液来源和细胞培养物来源的p24抗原，以游离的p24抗原分子和p24抗原及其抗体的复合物的一种或任意组合的形式存在，需要预先进行加热解离或酸性解离以使抗原从抗原抗体复合物中解离出来。步骤(2)中所述的HIV-1样品包含任意类型的HIV-1型病毒。任意类型是指M亚群和O亚群的一种或任意组合。所述的M亚群中包括A、B(B')、C、D、E、F、G、H、I和J等10个亚型。步骤(4)中所述的激发剂1为过氧化氢和硝酸的混合液，其中过氧化氢的浓度为0.05-0.1M,硝酸的浓度为0.1-0.5M;所述的激发剂2为曲拉通100和氯氧化钠的混合液，其中曲拉通100的浓度为0.1-0.5M,氢氧化钠的质量分数为2-5%;过氧化氢和氢氧化钠主要为吖啶酯类化合物提供碱性的发光环境；优选加入激发剂1,0.5-1秒钟后再加入激发剂2。本发明方法中采用吖啶酯类化合物标记配对抗体。主要通过化学反应将一种分子共价连接到另一种分子上，参与偶联反应的两种物质分别称为标记物和被标记物。化学标记的目的是使被标记物保持自身的性质(如免疫学性质)且又具有标记物的某些性质(如发光性质)。吖啶酯类化合物通过化学反应使吖啶酯通过共价键与被标记的蛋白、多肽或核酸的氣基结合。本发明所涉及的硝酸和曲拉通100为吖啶酯类化合物发光的激发剂、增强剂，使吖啶酯类化合物在激发剂的作用下瞬时即可发光，同以往酶联免疫分析反应相比大大缩短了#:作的时间。本发明所涉及的吖啶酯类化合物的激发剂以即时加样即时检测的方法进行检测，发光即可检测光子数，不需要加入终止试剂、信号放大体系等额外反应，也减少了操作步骤。普通的化学发光免疫分析方法的自动化程度已经很高，目前国内外的全自动化学发光仪已经很多，如CibaCorning公司的ACS:180、PerkinElmer公司的MulUlabelCounterVICTOR1420等。本发明方法采用的即时加入激发剂的方法对于自动化操作、减少人为操作误差、提高检测灵敏度都很有帮助。与现有技术相比较，本发明具有以下有益效果1)灵敏度较高，可达到O.5pg/ml，达到国际先进水平。2)检测范围较宽，可达到5-6个数量级，对较高浓度的样品无需稀释即可检测。3)操作简便，反应时间短，吖啶酯类化合物在激发剂作用下两秒内即可发光。4)有利于反应体系的自动化操作。图1、吖啶酯化学发光免疫分析HIV-1p24抗原的胡克效应。图2、吖啶酯化学发光免疫分析HIV-1p24抗原标准曲线拟合。以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。具体实施方式材料和试剂吖"定酉旨(AcridiniumC2NHSEster)购自Assaydesigns公司；固相载体(白色96微孔板ImmunoMaxiSorp)购自Nunc公司;包被緩冲液Na2C03-NaHC030.05MpH9.5洗涤緩沖液Na2HP04-NaH2P040.01MNaCl0.9%pH7.4封闭緩冲液Na2HP04-NaH2P040.05MNaCl0.9%BSA1%PH7.4分析緩冲液Na2HP04-NaH2P040.05MNaCl0.9%200.05%BSA0.5%pH7.0激发剂1:HN030.1MH2020.08M激发剂2:TritonX-1002%NaOH0.2MHIV-1样品HIV-1p24重组抗原(病毒所提供)；HIV-lp24抗原国家参考品(购自中国药品生物制品;险定所)包括20支HIV-lp24抗原阴性参考品，编号为Nl-N20;10支HIV-1p24抗原阳性参考品，编号为Pl-P10;IO支线性灵敏度参考品，编号为L1-L10;HIV-lp24抗原检测精密度参考品,编号为AgCV;阴性对照人血清(VironostikaHIV-1Antigen,bioMerieuxInc.,Durham,NC);阳性对照重组p24抗原(VironostikaHIV-lAntigen,bioMerieuxInc.,Durham,NC)。实施例1)用包被緩冲液将包被用抗p24抗体稀释至6pg/ml后，于白色96微孔板中，每孔加入100p1,4。C封闭16个小时；2)甩净孔中液体，将洗涤緩冲液每孔加入300pl洗涤，每次洗涤3分钟，共洗涤3次；3)每孔加入封闭緩沖液300p1,37。C恒温震荡1个小时；4)甩净孔中液体，将洗涤緩沖液每孔加入300jul洗涤，每次洗涤3分钟，共洗涤3次，晾千后4。C保存；5)分别将浓度为80、40、20、10、5pg/ml的五个阳性对照样品加入孔中，每个浓度2个复孔，每孔加入100)n1,将阴性对照样品分别加入4个孔中，每孔加入100pl，将HIV-1p24抗原国家参考品40个样品(N1-N20、PI-P10和L1-L10)各加入1孔，每孔加入lOOjil,将AgCV样品分别加入4个孔中，每孔加入100|ul，3rc恒温振荡1个小时；6)甩净孔中液体，将洗涤緩冲液每孔加入30(^1洗涤，每次洗涤3分钟，共洗涤3次；7)用分析緩冲液对吖啶酯标记的抗p24抗体进行1:200倍稀释后，每孔加入lG0iil;8)将HIV-1样品和吖啶酯标记的抗HIV-lp24抗体充分混合后，于37。C恒温振荡1个小时；9)甩净孔中液体，将洗涤緩冲液每孔加入30(^1洗涤，每次洗涤3分钟，共洗涤3次；10)将50|il激发剂1和50pl激发剂2,分别通过多功能分析仪即时力口入孔中，两试剂加入时间相隔1秒；11)加入激发剂后立即检测发光值，检测结果如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表lHIV-1p24抗原国家参考品检测结果评价标准20支HIV-1p24抗原阴性参考品不得出现阳性反应(20/20)。IO支HIV-Ip24抗原阳性参考品不得出现阴性反应(10/10)。10支线性灵敏度参考品对HIV-1p24抗原检测试剂，最低检出量不得高于1.25U/ml(至少检测出LI-L5),进行p24定量测定时，LI-L5共5个样品测定值统计分析后线性关系系数(R值)必须>0.95。精密度测定统计分析后CV《15%。结合评价标准可知本发明方法检测结果符合HIV-lp24抗原国家参考品标准的要求。相应参数的确定1、分析灵每文度将HIV-lp24重组抗原用分析緩冲液进行梯度稀释，分别得到0,0.05pg/ml,0.1pg/ml，0.2pg/ml，0.5pg/ml,1pg/ml,2pg/ml，5pg/ml,10pg/ml,20pg/ml,50pg/ml,100pg/ml，200pg/ml,500pg/ml等浓度梯度，每个浓度3个复孔，每孔加入100pU。0标准和各样品作10次批内重复测定，求每组的均值(M)、标准差(SD)和变异系数(cvy。)。反应所应用的吖。定酯标记抗体为1:1000倍稀释。激发剂1和2均为多功能分析仪即时加样、即时检测。将各浓度梯度所得(M-3SD)x值与阴性对照的(M+3SD)NC值进行比较，选取(M-3SD)X>(M+3SD)NC时的最小浓度值为该体系的检测限，经比较本发明方法的检测限为0.5pg/ml。2、检测宽度2.1胡克效应将HIV-lp24重组抗原用分析緩冲液进行梯度稀释，分别得到0,lng/ml，5ng/ml,10ng/ml，20ng/ml,50ng/ml，100ng/ml,200ng/ml，500ng/ml，lOOOng/ml,2000ng/ml，5000ng/ml等浓度梯度,每个浓度3个复孔，每孔加入10(^1。0标准和各样品4次批内重复测定，求每组的均值。反应所应用的吖啶酯标记抗体为1:100倍稀释。激发剂1和2均为多功能分析仪即时加样、即时检测。100ng/ml的浓度梯度所对应的发光值最高。当被;险测的HIV-lp24抗原浓度大于100ng/ml时，其发光值不^f旦没有升高反而急剧下降，呈明显的钩状，如图1所示。2.2检测宽度将HIV-lp24重组抗原用分析緩冲液进行梯度稀释，分别得到0，10pg/ml，20pg/ml,50pg/ml,100pg/ml,200pg/ml，500pg/ml，lng/ml，2ng/ml，5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,lOOng/ml等14个浓度的样品，每个浓度2个复孔，每孔加入10(^1。0标准和各样品作4次批内重复测定，求每组的变异系数。反应所应用的吖啶酯标记抗体为1:1000倍稀释。激发剂1和2均为多功能分析仪即时加样、即时检测。在所选的浓度范围内，各个梯度的变异系数均小于20%,故此将100ng/ml作为检测范围的上限。对于检测范围的下限，通常选取功能灵敏度，本发明方法的功能灵敏度为0.5pg/ml,由此得出本发明HIV-1p24吖。定酯化学发光免疫分析方法检验的线性范围是0.5pg/ml-100ng/ml,共6个数量级。3、标准曲线拟合将HIV-lp24重组抗原用分析緩冲液进行梯度稀释，分别得到0，0.1pg/ml,0.2pg/ml，0.5pg/ml,1pg/ml,2pg/ml,5pg/ml，10pg/ml,20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml,200pg/ml，500pg/ml，lng/ml,2ng/ml,5ng/ml,lOng/ml,20ng/ml，50ng/ml,lOOng/ml等20个浓度的样品，每个浓度4个复孔，每孔加入100nl，求每个浓度的光子数均值。反应所应用的吖啶酯标记抗体为1:1000倍稀释。激发剂1和2均为多功能分析仪即时加样，即时检测。通过曲线拟合得到曲线，如图2所示，得出拟合方程为四参数logistic曲线形式CPS/CPSmax为不同浓度p24抗原所对应的吖啶酯发光值与此次检测中最高发光值之间的比值；四个参数<3、6分别为0.9953、0.04764，c为2,934，d为1.209，W为0.9990，具有非常好得统计学意义。HIV-1p24吖啶酯化学发光免疫分析方法的功能灵敏度为0.5pg/ml，比普通的ELISA方法低1-2个数量级；分析灵敏度为0.5pg/ml;线性范围在0.5pg/ml-100ng/ml，比普通的ELISA方法高1-2个数量级。权利要求1.一种HIV-1p24抗原吖啶酯化学发光免疫分析检测方法，具体步骤如下(1)用抗HIV-1p24抗体对固相载体进行包被；(2)处理HIV-1样品；(3)将步骤(2)中处理后的HIV-1样品和吖啶酯类化合物标记的抗HIV-1p24配对抗体加入步骤(1)中的反应体系进行免疫反应；(4)将激发剂1和激发剂2加入步骤(3)中的反应体系，进行化学发光反应；(5)检测步骤(4)中化学发光反应产生的光子数，进行定性或/和定量分析。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(l)中所述的固相载体为聚苯乙烯乳胶、聚苯乙烯塑料制品、聚氯乙烯塑料制品、脂质体或免疫磁性微珠。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的HIV-1样品选自血清、血浆、HIV-1细胞培养物裂解上清或HIV-lp24重组抗原的一种或多种。4、根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的HIV-1样品包含的HIV-1型病毒为M亚群和0亚群的一种或任意组合。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的M亚群中包括A、B、B'、C、D、E、F、G、H、I和J亚型。6、根据权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的激发剂1为过氧化氢和硝酸的混合液，其中过氧化氢的浓度为0.05-0.1M，硝酸的浓度为0.1-0.5M。7、根据权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的激发剂2为曲拉通100和氢氧化钠的混合液，其中曲拉通100的浓度为0.1-0.5M，氬氧化钠的质量分数为2-5%。8、根据权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(4)中加入激发剂1，0.5-1秒钟后再加入激发剂2。全文摘要HIV-1p24抗原吖啶酯化学发光免疫分析检测方法属于临床血液检测分析方法
技术领域：
。现有HIV-1p24抗原检测方法存在灵敏度不高且操作繁琐等问题。本发明以吖啶酯类化合物标记抗HIV-1p24抗体，通过双抗夹心的方法进行p24抗原抗体间的免疫结合；以激发剂过氧化氢、硝酸、曲拉通100和氢氧化钠，激发吖啶酯类化合物进行化学发光反应；检测光子数，进行定性或/和定量分析。本发明具有与普通的ELISA检测方法具有很好的相关性，在P≤0.01情况下，相关系数为0.951；灵敏度高、检测限为0.5pg/ml，检测范围广、5-6个数量级；反应时间短，操作更为简便等优点。文档编号G01N21/76GK101281196SQ200810111678公开日2008年10月8日申请日期2008年5月16日优先权日2008年5月16日发明者娟冯,毅曾,钟儒刚,马雪梅申请人:北京工业大学