专利名称：：一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测双氟米松的方法
技术领域：
：本发明涉及一种量子点标记的双氟米松抗体定量检测双氟米松的方法，特别是公开了一种量子点标记的间接竞争免疫检测方法，属于免疫检测方法
技术领域：
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背景技术：
：双氟米松(Flumethasone,FLM)属人工合成类糖皮质激素，化学名称为6a，9a-双氟孕甾一16a—甲基一ll卩，17a，21—三羟基_1，4一二烯一3，20二酮。具有抗过敏、抗炎的作用，其具有蓄积毒性，许多国家将此药物列入禁用药物名单，尤其是牛肉制品及牛奶中不得检出。当今国际上常用的双氟米松残留的检测方法有薄层色谱(TLC)、液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些仪器分析方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材的要求也比较高，需要经过复杂的样品前处理才能进行。国外早已经开展了对糖皮质激素分析方法的研究，常用的方法为酶联免疫分析法(ELISA)或称为免疫酶定量分析法(IEMA).这类方法是将包被原包被酶标板，加入药物及抗药物抗体，再加入酶标二抗，即检测抗体，最后加入底物显色，一定时间后，用酶标仪检测某一特定波长的吸光度值，根据已知标准品含量计算样品中待测药物的浓度，此操作繁琐，费时。
发明内容本发明的目的是提供一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测双氟米松的方法，本方法是一种高灵敏度、高特异性、高准确度、操作方法简单的量子点标记的荧光免疫检测法，用于双氟米松残留的快速检测。本发明的技术方案一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测双氟米松的方法，将包被原直接包被在酶标板的微孔中，加入双氟米松标准溶液或待测样品形成抗原-抗体发光免疫复合体，用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，与标准溶液对比求出待测样品中双氟米松的浓度;(一)用变性牛血清蛋白dBSA包裹发绿光的QD650标记抗双氟米松多克隆抗体(1)BSA变性将16.5mgBSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mgNaBH4,室温下反应lh，60-80。C下加热20min,分解过量的NaBH4，BSA变性，二硫键打开成-SH,控制最终的dBSA水溶液的浓度为5X10—5M;3(2)变性BSA包裹量子点dBSA-QDs:将dBSA和量子点按摩尔比1:11:6混合，60-80。C水浴加热15min，室温下保持两天，使包裹完全；(3)变性BSA包裹量子点偶联抗体将5^1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC0.056M与5|tiL硫代N-羟基琥珀酰亚胺sulfo-NHS0.1M混合10s后，加入至25pLdBSA-QDs2X1(T5M中，变性BSA包裹的量子点活化15min，加入9.6pL抗体Ab,5X10'5M，反应中,反应物摩尔比控制为dBSA-QDs:Ab=l:l,dBSA-QDs:EDC:NHS=1:560:1000，室温下反应4h，得到量子点标记的双氟米松抗体，反应液中抗体的浓度为1.03mg/mL，用0.1%明胶的含吐温的pH7.4、0.01M磷酸盐缓冲液作抗体稀释液稀释1000倍待用；(二)抗原的包被用双氟米松与卵血清白蛋白偶连体作为包被原，用pH9.6、0.05M碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，用包被缓冲液将双氟米松包被原稀释至l-20pg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加100^iL包被液,4"C冰箱过夜，用含NaC18.5g/L、pH7.2-7.4、1Ommol/L磷酸盐缓冲液洗三次，按200laL/孔加0.1%明胶进行封闭；(三)抗原-抗体二元发光免疫复合体的形成在封闭后的酶标板孔中加入双氟米松标准溶液或待测样品50pL，稀释的量子点标记的双氟米松抗体50pL，37。C孵育lh，抗原与双氟米松药物竞争抗体，部分抗体与抗原形成抗原-抗体二元免疫复合物，用含NaC18.5g/L、pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸盐缓冲液洗三次，去掉非特异性吸附；(四)定量荧光检测用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，激发波长430nm;发射波长650nm，通过与标准溶液对比求出待测样品中双氟米松的浓度。所说的抗体是指用变性BSA包裹量子点标记的抗双氟米松的多克隆抗体；量子点是指能够发射荧光的纳米粒子，其核心部分为CdTe。所说的包被是利用常规的方法将双氟米松的包被原(药物-OVA偶联物)直接固定在酶标板微孔中。所说的抗原-抗体复合体的形成是加入双氟米松抗体后，抗原与药物竞争抗体，通过抗原与抗体的特异性结合形成抗原-抗体二元免疫复合物。所说的荧光强度的检测是用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-检测抗体二层夹心发光免疫复合物的荧光强度，通常样品中药物浓度越大，被抗体捕获的药物量越多，与包被原结合的抗体越少，则测得的荧光强度值越小。上述的待测药物为双氟米松(FLM)，相应的抗体应为特异性抗双氟米松的多克隆抗体。本发明的有益效果(1)本法操作简单，不需加显色物质就能检测待测样品中双氟米松的含量,即通过抗原-抗体免疫复合物的荧光强度，间接检测待测样品中双氟米松的浓度值，无论操作还是反应均只需一步就可完成。(2)本法用于标记抗体的量子点与传统荧光相比，发射的荧光强度更强，且荧光稳定时间长。图l用量子点标记的间接竞争荧光免疫法检测双氟米松的标准曲线。具体实施例方式实施例l(一)用变性BSA(dBSA)包裹发绿光的QD650标记抗双氟米松多克隆抗体(1)BSA变性将16.5mgBSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mgNaBH4，室温下反应lh,60-8(TC下加热20min分解过量的NaBH4，BSA变性，二硫键打开成-SH,最终的dBSA水溶液的浓度为5X10—5M。(2)变性BSA包裹量子点dBSA-QDs:将dBSA和量子点按一定的摩尔比(1:11:6)混合，60-8(TC水浴加热15min，室温下保持两天，使包裹完全。(3)变性BSA包裹量子点偶联抗体将5fiLEDC(0.056M)与5pLsulfo-NHS(0.1M)混合10s后，加入至25pLdBSA-QDs(2X1(T5M)中，变性BSA包裹的量子点活化15min，加入9.6pL抗体(Ab,5X10-5M)。反应中，dBSA-QDs:Ab=l:l,dBSA-QDs:EDC:NHS=1:560:1000，室温下反应4h，得到量子点标记的双氟米松抗体，反应液中抗体的浓度为1.03mg/mL，用0.1%明胶的含吐温的pH7.4，O.OIM磷酸盐缓冲液作抗体稀释液稀释1000倍待用；(二)抗原的包被用双氟米松与卵血清白蛋白偶连体作为包被原，用pH9.6、0.05M碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，用包被缓冲液将双氟米松包被原稀释至l-20pg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加100pL包被液，4'C冰箱过夜，用磷酸盐缓冲液(PBS,10mmol/L、pH7.2-7.4、含NaC18.5g/L)洗三次，按200|iL/孔加0.1%明胶进行封闭。(三)抗原_抗体二元发光免疫复合体的形成在封闭后的酶标板孔中加入双氟米松标准溶液或待测样品50pL，稀释的量子点标记的双氟米松抗体50pL，37'C孵育lh，抗原与双氟米松药物竞争抗体，部分抗体与抗原形成抗原-抗体二元免疫复合物，用磷酸盐缓冲液(PBS，10mmol/L、pH7.2-7.4、含NaC18.5g/L)洗三次，去掉非特异性吸附。(四)定量荧光检测量子点标记的间接竞争荧光免疫检测法的测定原理是通过检测结合到酶标板微孔上的抗原-抗体二元免疫复合物的荧光强度来实现对双氟米松的检测。可与标准曲线对比求出样品中双氟米松的浓度。结合到酶标板微孔上的量子点标记的检测抗体数量不同，产生的荧光强度不同，通常样品中药物浓度越大，被抗体捕获的药物量越多，与包被原结合的抗体越少，则测得的荧光强度值越小。标准曲线的绘制，将已知双氟米松含量的标准溶液配置成由低到高8种不同浓度(0.1ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，25ng/mL，50ng/mL，100ng/mL)，用与待测样本相同的方法，重复(二)(三)步骤的操作，领啶某种浓度的标准溶液对应的荧光强度(激发波长430nm;发射波长650nm)，以双氟米松浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，见图l。实施例2添加回收实验(1)样品的提取净化在2g鸡肉靡样本中加入10mL乙腈/水(体积比7:3)的混合溶液，涡旋混合lmin，超声波超声30min，2000Xg离心10min，吸取2.5mL上层液于干净的玻璃管中，加入4mL正己垸和lmL二氯甲烷脱脂，涡旋混合lmin使三相分离，吸取lmL中间相(对应于0.2g样品)于干净的试管中；50°C，缓慢的N2流吹干，用0.2mL标准品稀释液(含10%甲醇的含吐温-20的磷酸盐缓冲液PBST)溶解残留物，作为试样供分析。(2)在2g空白的鸡肉样本中添加双氟米松标准品液，使其浓度为lng/g、5ng/g、10ng/g、20ng/g，各浓度分别制备样品五份，按上述的前处理方法迸行提取后分析。结果见表l。可以看出，鸡肉样品中的回收率在69.4%~77.96%。该分析方法重复性良好，相对标准偏差低于6.34%。表1添加回收率的测定<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1.一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测双氟米松的方法，其特征在于将包被原直接包被在酶标板的微孔中，加入双氟米松标准溶液或待测样品形成抗原-抗体发光免疫复合体，用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，通过与标准溶液对比求出待测样品中双氟米松的浓度；(一)用变性牛血清蛋白dBSA包裹发绿光的QD650标记抗双氟米松多克隆抗体(1)BSA变性将16.5mgBSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mgNaBH4，室温下反应1h，60-80℃下加热20min，分解过量的NaBH4，BSA变性，二硫键打开成-SH，控制最终的dBSA水溶液的浓度为5×10-5M；(2)变性BSA包裹量子点dBSA-QDs将dBSA和量子点按摩尔比1∶1～1∶6混合，60-80℃水浴加热15min，室温下保持两天，使包裹完全；(3)变性BSA包裹量子点偶联抗体将5μL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC0.056M与5μL硫代N-羟基琥珀酰亚胺sulfo-NHS0.1M混合10s后，加入至25μLdBSA-QDs2×10-5M中，变性BSA包裹的量子点活化15min，加入9.6μL抗体Ab5×10-5M，反应中，反应物摩尔比控制为dBSA-QDs∶Ab＝1∶1，dBSA-QDs∶EDC∶NHS＝1∶560∶1000，室温下反应4h，得到量子点标记的双氟米松抗体，反应液中抗体的浓度为1.03mg/mL，用0.1％明胶的含吐温的pH7.4、0.01M磷酸盐缓冲液作抗体稀释液稀释1000倍待用；(二)抗原的包被用双氟米松与卵血清白蛋白偶连体作为包被原，用pH9.6、0.05M碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，用包被缓冲液将双氟米松包被原稀释至1-20μg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加100μL包被液，4℃冰箱过夜，用含NaCl8.5g/L、pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸盐缓冲液洗三次，按200μL/孔加0.1％明胶进行封闭；(三)抗原-抗体二元发光免疫复合体的形成在封闭后的酶标板孔中加入双氟米松标准溶液或待测样品50μL，稀释的量子点标记的双氟米松抗体50μL，37℃孵育1h，抗原与双氟米松药物竞争抗体，部分抗体与抗原形成抗原-抗体二元免疫复合物，用含NaCl8.5g/L、pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸盐缓冲液洗三次，去掉非特异性吸附；(四)定量荧光检测用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，激发波长430nm；发射波长650nm，通过与标准溶液对比求出待测样品中双氟米松的浓度。全文摘要一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测双氟米松的方法，属于免疫检测方法
技术领域：
。本发明用于标记抗体的量子点为QD650，将包被原直接包被在酶标板的微孔中，加入双氟米松标准溶液或待测样品形成抗原-抗体发光免疫复合体，用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，通过与标准溶液对比求出待测样品中双氟米松的浓度。本发明不需加显色物质就能检测待测样品中双氟米松的含量，即通过抗原-抗体免疫复合物的荧光强度，间接检测待测样品中双氟米松的浓度值，无论操作还是反应均只需一步就可完成；本方法用于标记抗体的量子点与传统荧光相比，发射的荧光强度更强，且荧光稳定时间长。文档编号G01N21/64GK101308147SQ20081012352公开日2008年11月19日申请日期2008年6月17日优先权日2008年6月17日发明者彭池方,胥传来,媛袁,许定花,爱边,伟陈,伟马申请人:江南大学