专利名称：一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测糖皮质激素多残留的方法
技术领域：
一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测糖皮质激素多残留的方法，属于 免疫检测方法技术领域。
背景技术：
糖皮质激素具有抗过敏、抗炎和影响糖代谢的作用，常被用于治疗家畜的 炎症反应、免疫性疾病、牛的酮病和羊妊娠毒血症等。地赛米松，倍他米松， 双氟米松还常被用作生长促进剂，增加家畜的词料摄入量从而使其达到增重的 目的。然而，经毒理学试验证明，该类药物具有至突变性、蓄积毒性，若随意 在饲料中添加该药物，蓄积的药物通过食物链进入人体，将造成巨大的危害。为 此许多国家将此类药物列入禁用药物名单。当今国际上常用的糖皮质激素残留
的检测方法有薄层色谱(TLC)、液相色谱CLC)、气相色谱(GC)、气-质联用法 (GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些仪器分析方法不仅需要昂贵的仪器 设备，对检材的要求也比较高，需要经过复杂的样品前处理才能进行。国外早 己经开展了对糖皮质激素分析方法的研究，常用的方法为酶联免疫分析法 (ELISA)或称为免疫酶定量分析法(IEMA)。这类方法是将包被原包被酶标板， 加入药物及抗药物抗体，再加入酶标二抗，即检测抗体，最后加入底物显色， 一定时间后，用酶标仪检测某一特定波长的吸光度值，根据已知标准品含量计 算样品中待测药物的浓度，此操作繁琐，费时。
发明内容
本发明的目的是提供量子点标记的间接竞争荧光免疫检测糖皮质激素多残 留的方法，该方法具有高灵敏度、高特异性、高准确度、操作简单的量子点标 记的荧光免疫检测法，用于糖皮质激素多残留的快速检测。
本发明的技术方案 一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测糖皮质激素 的方法，将包被原直接包被在酶标板的微孔中，加入糖皮质激素标准溶液或待 测样品形成抗原-抗体发光免疫复合体，用炎光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，通过与标准溶液对比求出待测样品中糖皮质 激素多残留的浓度；
(一)用变性牛血清蛋白dBSA包裹三种量子点QD545， QD5卯，QD650标 记抗地塞米松，抗倍他米松，抗双氟米松多克隆抗体
(1) BSA变性
将16.5mgBSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mg NaBH4,室温下反应lh, 60-80。C下加热20min分解过量的NaBH4， BSA变性，二硫键打开成-SH, 控制最终的dBSA水溶液的浓度为5X 10'5M;
(2) 变性BSA包裹量子点dBSA-QDs: 将dBSA和量子点镝化铬CdTe按摩尔比l : 1混合，60-80'C水浴加热15min，
室温下保持两天，使包裹完全；
(3) 变性BSA包裹量子点偶联抗体
将5^1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC 0.056M与5pL硫代N-羟基琥珀酰亚胺sulfo-NHS 0.1M混合10s后，加入至25|aL dBSA-QDs 2X 1(T5M 中，变性BSA包裹的量子点活化15min,加入12|iL三种糖皮质激素抗体中的 一种Ab， 4.0mg/mL ;反应物摩尔比控制为dBSA-QDs: Ab: EDC: sulfo-NHS=l:l:560:1000，室温下反应4h，得到量子点标记的糖皮质激素抗体， 反应液中抗体的浓度为1.0mg/mL，用0.1。/。明胶的含吐温的pH7.4、 O.OIM磷酸 盐缓冲液作抗体稀释液稀释1000倍待用；变性BSA包裹量子点分别与三种多 克隆抗体进行偶联；
(二) 抗原的包被
用三种包裹量子点的多克隆抗体分别与卵血清白蛋白进行偶联，将得到的 三种多克隆抗体-卵血清白偶联物等质量混合用作糖皮质激素偶连体作为包被 原，用pH9.6、 0.05M碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，用包被缓冲液将糖皮质激 素包被原稀释至l-20pg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加IOOjiL包被液，4 。C冰箱过夜，用含NaCl 8.5g/L、 pH 7.2-7.4、 1Ommol/L磷酸盐缓冲液洗三次， 按200(iL/孔加0.1%明胶进行封闭；
(三) 抗原-抗体二元发光免疫复合体的形成 在封闭后的酶标板孔中加入糖皮质激素标准溶液或待测样品50pL，稀释的
量子点标记的糖皮质激素抗体50pL,37"C孵育lh，抗原与糖皮质激素药物竞争 抗体，部分抗体与抗原形成抗原-抗体二元免疫复合物，用含NaC18.5g/L 、 pH 7.2-7.4、 1Ommol/L磷酸盐缓冲液洗三次，去掉非特异性吸附；
(四) 定量荧光检测 用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，
激发波长430nm;发射波长545nm， 590nm， 650nm，通过与标准溶液对比求 出祥品中糖皮质激素多残留地塞米松，倍他米松，双氟米松的浓度。
所说的抗体是指用变性BSA包裹三种量子点(545nm， 590nm， 650nm)分
别标记的抗地塞米松，抗倍他米松，抗双氟米松的多克隆抗体；量子点是指能 够发射荧光的纳米粒子，其核心部分为CdTe。
所说的包被是利用常规的方法将地塞米松，倍他米松，双氟米松的包被原(地 塞米松，倍他米松，双氟米松-OVA偶联物)直接固定在酶标板微孔中。所说的抗原-抗体复合体的形成是加入地塞米松，倍他米松，双氟米松， 三种抗原与相应的药物竞争相应的抗体，通过抗原与抗体的特异性结合形成抗 原-抗体二元免疫复合物。
所说的荧光强度的检测是用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-检测抗体 二层夹心发光免疫复合物的荧光强度，通常样品中药物浓度越大，被抗体捕获 的药物量越多，与包被原结合的抗体越少，则测得的荧光强度值越小。
上述的待测药物为地塞米松，倍他米松，双氟米松，相应的抗体应为特异 性抗地塞米松，抗倍他米松，抗双氟米松的多克隆抗体。
本发明的有益效果
(1) 本法操作简单，不需加显色物质就能检测待测糖皮质激素的含量，即 通过抗原-抗体免疫复合物的荧光强度，间接检测样品中待测糖皮质激素的浓度 值，无论操作还是反应均较背景技术少两步，只需一步就可完成。
(2) 本法用于标记抗体的量子点与传统荧光相比，发射的荧光强度更强， 且荧光稳定时间长。
图l用量子点标记的间接竞争荧光免疫法检测糖皮质激素的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
(一)用变性牛血清蛋白(dBSA)包裹三种量子点QD545, QD590, QD650 标记抗地塞米松，抗倍他米松，抗双氟米松多克隆抗体
(1) BSA变性
将16.5mg BSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mg NaBH4,室温下 反应lh, 60-8(TC下加热20min分解过量的NaBH4， BSA变性，二硫键打开成-SH, 最终的dBSA水溶液的浓度为5 X 1(T5M。
(2) 变性BSA包裹量子点(dBSA-QDs): 将dBSA和量子点镝化铬(CdTe)按摩尔比(1:1)混合，60-SCTC水浴加
热15min，室温下保持两天，使包裹完全。
(3) 变性BSA包裹量子点偶联抗体
将5pL l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC(0.056M)与5pL硫代 N-羟基琥珀酰亚胺sulfo-NHS(0.1M)混合10s后，加入至25|iL dBSA-QDs (2X 1(T5M)中，变性BSA包裹的量子点活化15min，加入12|iL糖皮质激素抗体(Ab, 4.0mg/mL)。反应物摩尔比为dBSA-QDs: Ab: EDC: sulfo-NHS=l: 1:560:1000。 室温下反应4h，得到量子点标记的糖皮质激素抗体。反应液中抗体的浓度为 1.0mg/mL，用抗体稀释液(0.1。/。明胶的含吐温的磷酸盐缓冲液pH7.4、 0.01M) 稀释1000倍待用。(二) 抗原的包被
用地塞米松，倍他米松，双氟米松与卵血清白蛋白偶连体作为包被原，用碳
酸盐缓冲液(pH9.6、 0.05M)作为包被缓冲液，用包被缓冲液将糖皮质激素包 被原稀释至l-20吗/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加100pL包被液，4"C冰 箱过夜，用磷酸盐缓冲液(PBS,10mmol/L、 pH 7.2-7.4、含NaC18.5g/L)洗三次， 按200pL/孔加0.1%明胶进行封闭。
(三) 抗原-抗体二元发光免疫复合体的形成 在封闭后的酶标板孔中加入地塞米松，倍他米松，双氟米松标准溶液或待测
样品50^L，稀释的量子点标记的糖皮质激素抗体5(VL,37"C孵育lh，抗原与糖 皮质激素药物竞争抗体，部分抗体与抗原形成抗原-抗体二元免疫复合物，用磷 酸盐缓冲液(PBS，10mmol/L， pH 7.2-7.4，含NaC18.5g/L)洗三次，去掉非特异 性吸附。
(四) 定量荧光检测 量子点标记的间接竞争荣光免疫检测法的测定原理是通过检测结合到酶标
板微孔上的抗原-抗体二元免疫复合物的荧光强度来实现对糖皮质激素的检测。 可与标准曲线对比求出样品中糖皮质激素的浓度。结合到酶标板微孔上的量于 点标记的检测抗体数量不同，产生的荧光强度不同，通常样品中药物浓度越大， 被抗体捕获的药物量越多，与包被原结合的抗体越少，则测得的荧光强度值越 小。标准曲线的绘制，将地塞米松，倍他米松，双氟米松标准溶液分别配置成由 低到高8种不同浓度(0.1ng/mL， 0.5 ng/mL， 1 ng/mL， 5 ng/mL， 10ng/mL， 25 ng/mL， 50ng/mL， 100ng/mL)，同浓度下，二种药品分别等量混和，用与待测 样本相同的方法，重复(二)(三)歩骤的操作，测定某种浓度的标准溶液对应 的荧光强度，激发波长430nm;发射波长545nm， 590nm， 650nm，以糖皮质 激素浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，见图1。 实施例2添加回收实验
(1) 样品的提取净化在2g鸡肉靡样本中加入10mL乙腈/水(7 : 3)的混 合溶液，涡旋混合lmin，超声波超声30min， 2000Xg离心10min，吸取2.5mL 上层液于干净的玻璃管中，加入4mL正己烷和lmL 二氯甲垸脱脂，涡旋混合 lmin使三相分离，吸取lmL中间相(对应于0.2g样品)于干净的试管中；50°C， 缓慢的N2流吹干，用0.2mL标准品稀释液(含10%甲醇的含吐温-20的磷酸盐 缓冲液PBST)溶解残留物，作为试样供分析。
(2) 在2g空白的鸡肉样本中添加标准品(地塞米松，倍他米松和双氟米 松三种混合物)液，使其浓度为10ng/g，各浓度分别制备样品五份，按上述的 前处理方法进行提取后分析。结果见表l。可以看出，单独检测三种药品在鸡肉 样品中的回收率在70.5 74.5该分析方法重复性良好，相对标准偏差低于4.37。同时检测三种药品在鸡肉样品中的回收率在60.12% 67.98%。该分析方法 重复性良好，相对标准偏差低于5.57%。
表1添加回收率的测定
添加药物 实测浓度(ng/mL) 回收率(％)
地塞米松(10ng/g)7.427.057.617.547.2973.82±4.37
倍他米松(10ng/g)6.77.196.937.317.1270.5±3.69
双氟米松(10ng/g)7.517.697.337.467.2674.5±3.22
混合物(地塞米松)G.33ng/g)2.272.162.352.072.1165.76±5.57
混合物(倍他米松)(3.33ng/g)1.92.082.051.942.0460.12±5.19
混合物(双氟米松)G.33ng/g)3.352.272.332.22.1867.98±3.8
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权利要求
1.一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测糖皮质激素多残留的方法，其特征在于将包被原直接包被在酶标板的微孔中，加入糖皮质激素标准溶液或待测样品形成抗原-抗体发光免疫复合体，用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，通过与标准溶液对比求出待测样品中糖皮质激素多残留的浓度；(一)用变性牛血清蛋白dBSA包裹三种量子点QD545，QD590，QD650分别标记的抗地塞米松，抗倍他米松，抗双氟米松多克隆抗体，此三种多克隆抗体即分别为下述的糖皮质激素抗体之一(1)BSA变性将16.5mg BSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mg NaBH4，室温下反应1h，60-80℃下加热20min分解过量的NaBH4，BSA变性，二硫键打开成-SH，控制最终的dBSA水溶液的浓度为5×10-5M；(2)变性BSA包裹量子点dBSA-QDs将dBSA和量子点镝化铬CdTe按摩尔比1∶1混合，60-80℃水浴加热15min，室温下保持两天，使包裹完全；(3)变性BSA包裹量子点偶联抗体将5μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC 0.056M与5μL硫代N-羟基琥珀酰亚胺sulfo-NHS 0.1M混合10s后，加入至25μL dBSA-QDs 2×10-5M中，变性BSA包裹的量子点活化15min，加入12μL三种糖皮质激素抗体中的一种Ab、4.0mg/mL；反应物摩尔比控制为dBSA-QDs∶Ab∶EDC∶sulfo-NHS＝1∶1∶560∶1000，室温下反应4h，得到量子点标记的糖皮质激素抗体，反应液中抗体的浓度为1.0mg/mL，用0.1％明胶的含吐温的pH 7.4、0.01M磷酸盐缓冲液作抗体稀释液稀释1000倍待用；变性BSA包裹量子点分别与三种多克隆抗体进行偶联；(二)抗原的包被用三种包裹量子点的多克隆抗体分别与卵血清白蛋白进行偶联，将得到的三种多克隆抗体-卵血清白偶联物等质量混合用作糖皮质激素偶连体作为包被原，用pH 9.6、0.05M碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，用包被缓冲液将糖皮质激素包被原稀释至1-20μg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加100μL包被液，4℃冰箱过夜，用含NaCl 8.5g/L、pH 7.2-7.4、10mmol/L磷酸盐缓冲液洗三次，按200μL/孔加0.1％明胶进行封闭；(三)抗原-抗体二元发光免疫复合体的形成在封闭后的酶标板孔中加入糖皮质激素标准溶液或待测样品50μL，稀释的量子点标记的糖皮质激素抗体50μL，37℃孵育1h，抗原与糖皮质激素药物竞争抗体，部分抗体与抗原形成抗原-抗体二元免疫复合物，用含NaCl 8.5g/L、pH7.2-7.4、10mmol/L磷酸盐缓冲液洗三次，去掉非特异性吸附；(四)定量荧光检测用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，激发波长430nm；发射波长545nm，590nm，650nm，通过与标准溶液对比求出祥品中糖皮质激素多残留地塞米松，倍他米松，双氟米松的浓度。
全文摘要
一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测糖皮质激素多残留的方法，属于免疫检测方法技术领域。本发明用于标记抗体的量子点分别为QD545，QD590，QD650，将包被原直接包被在酶标板的微孔中，加入糖皮质激素标准溶液或待测样品形成抗原-抗体发光免疫复合体，用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，通过与标准溶液对比求出待测样品中糖皮质激素多残留的浓度。本发明不需加显色物质就能通过抗原-抗体免疫复合物的荧光强度，间接检测待测样品中糖皮质激素多残留的浓度值，无论操作还是反应均只需一步就可完成；本方法用于标记抗体的量子点与传统荧光相比，发射的荧光强度更强，且荧光稳定时间长。
文档编号G01N33/543GK101308148SQ20081012352
公开日2008年11月19日 申请日期2008年6月17日 优先权日2008年6月17日
发明者彭池方, 徐丽广, 哲 李, 李灼坤, 胥传来, 媛 袁, 伟 陈 申请人:江南大学