专利名称：核酸分析器件以及使用其的核酸分析装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸分析器件以及使用其的核酸分析装置。
背景技术：
作为核酸分析器件，正在不断开发确定DNA或RNA的碱基序列的新技术。
现在，就通常使用的利用电泳的方法而言，预先由序列确定用的DNA片 段或RNA试样进行逆转录反应，制备出合成的cDNA片段试样，通过周知的 Sanger测序法进行双脱氧反应，然后进行电泳，计测分子量分离展开图案来进 行解析。
与此相对，近年，如非专利文献l所述，有人提出了在基板上固定DNA 等来确定其碱基序列的方法。该方法为，在基板表面1分子1分子地随机捕捉 要分析的试样DNA片段，大致1个碱基1个碱基地使其延长，通过荧光计测 来检测其结果，从而确定碱基序列。具体来讲，以下述工序作为l个循环采 用4种dNTP的衍生物(MdNTP )进行DNA聚合酶反应的工序，所述4种dNTP 的衍生物作为DNA聚合酶的底物被组入模板DNA，由于保护基的存在可停止 DNA链延伸反应，并且还具有可检测的标记；接着，用荧光等检测被组入的 MdNTP的工序；以及将MdNTP恢复到可延伸的状态的工序，通过反复该循 环，确定试样DNA的碱基序列。在本技术中，由于能够一分子一分子地确定 DNA片段的序列，因此，可以同时解析大量的片段，可以增大解析能力。另 外，本方式存在能确定每个单一DNA分子的碱基序列的可能性，因此，可能 不需要对克隆或PCR等操作的DNA进行精制、扩增，这些步骤是以往技术中 的问题，从而可以期待基因组解析好基因诊断的快速化。
非专利文献1: P.N.A.S 2003， VoL 100, pp. 3960-3964.
非专利文献2: Physical Review Letters 2006, 96, pp 113002-113005.
非专利文献3: Anal. Chem. Vol. 78, 6238-6245.
非专利文献4: Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 044017-044021. 非专利文献5: J. Coput, Theor. Nanosci. 2007, vol. 4, pp 686-691. 非专利文献6: Nanotechnology， 2006, vol. 17, pp 475-482. 非专利文献7: P.N.A.S 2006， Vol. 103， pp 19635-19640.
发明内容
发明要解决的问题
利用基板上的延伸反应解析碱基序列时，以在所述非专利文献1中公开方 式为代表，通常将单碱基延伸反应.未反应底物的洗涤 计测作为一个循环， 即，逐次反应方式。对每个单一 DNA分子解析碱基序列时，计测探针DNA 上的一分子荧光色素的荧光，所述荧光色素是通过单碱基延伸反应而被组入 DNA双链中的核苷酸所附带的，但是，在通常的荧光测定中，不能识别探针 DNA上被捕捉的荧光分子与在其附近浮游的未反应的核香酸所附带的荧光色 素。因此，每延伸一个^威基后，都必不可少地要洗涤未反应底物。由于加入该 洗涤工序，就存在如下问题需要在基板上形成复杂的流路或送液装置以及废 液处理装置；还要大量地消耗反应试剂；进一步，整个解析所需要的反应时间 也加长。
为了识别探针DNA上被捕捉的一分子荧光色素与未反应底物的荧光分 子，必须要做出这样的条件，即，只加强在探针DNA上被捕捉的焚光色素的 发光，减弱浮游的色素的发光以达到不发光或忽视的程度。
本发明的目的是识别通过碱基延伸反应而被组入DNA双链中的核苷酸所 附带的一分子荧光色素与未反应底物的荧光分子。
解决问题的方法
因此，本发明人等经过潜心研究，结果发现了以下方法通过在探针DNA 上或核酸合成酶上形成基于局域表面等离子体振子的强焚光增强场，可以识 别、计测通过单碱基延伸反应而被組入DNA双链中的核苷酸所附带的焚光色 素与浮游的色素。特别深入研究了制作出强荧光增强场的金属结构体的形状、 和在被局域化的增强场内固定探针DNA或核酸合成酶的方法，发现了使两者 并存的方法。
本发明涉及利用荧光测定来分析试样中的核酸的核酸分析器件，其通过光
照射产生局域型表面等离子体振子，并且，用于分析试样中的核酸的核酸探针 或核酸合成酶被配置于所述表面等离子体振子的产生部位。 发明效果
根据本发明，可有效地引起由表面等离子体振子所产生的荧光增强效果，
并且，可将DNA探针或核酸合成酶固定于荧光增强效果所涉及的区域，因此， 即使不除去带有荧光分子的未反应底物，也能够计测-威基延伸反应。
图1是用于说明本发明的核酸分析器件的概念的图。 图2是用于说明本发明的核酸分析器件的制造方法的一个例子的图。 图3是用于说明本发明的核酸分析器件的制造方法的一个例子的图。 图4是用于说明本发明的核酸分析器件的结构的一个例子的图。 图5是用于说明使用本发明的核酸分析器件的核酸分析装置的一个例子 的图。
图6是用于说明本发明的核酸分析器件的概念的图。
符号说明
101荧光色素
102未反应底物的荧光色素 103平滑基板 104金属结构体 105 DNA纟笨针
201, 301平滑的支持基体
202, 203， 302, 303电子射线用正性保护层
204, 206, 208, 304钛
205, 209金 207, 306 Si。2膜 305金的溅射膜
401透光性支持基体
402点阵状配置金属结构体的区域
403反应室 404温调单元
405分注单元 406阀
407， 506流路 408废液罐 501盖板 502 一企测窗 503注入口 504排出口 505器件
507， 508 YAG激光光源 509， 510 激光
511 V4板
512 二色镜 513透镜 514棱镜 515物镜
516光学滤波器
517成像透镜
518 二维CCD相机
605核酸合成酶
具体实施例方式
本实施例提供一种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中的核酸 的核酸分析器件，其特征在于，通过光照射产生局域型表面等离子体振子，并 且，具有在所述表面等离子体振子的产生部位配置有用于分析试样中的核酸的 核酸探针的金属结构体。
另外，本实施例提供一种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中 的核酸的核酸分析器件，其特征在于，制成在平滑的支持基体上、在相对于所 述支持基体表面垂直的方向上，顺序层叠金属体、绝缘层、金属体的结构，所
述绝缘层具有用于分析试样中的核酸的核酸探针。
此外，本实施例提供一种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中 的核酸的核酸分析器件，其特征在于，在平滑的支持基体上，具备含有顶点的
形状的金属结构体和由所述金属以外的材料构成薄膜层，制成所述含有顶点的 金属结构体的一部分从所述薄膜层露出、该部分以外的所述金属结构体被埋入
所述薄膜层中的结构，在所述露出的金属结构体表面具有用于分析试样中的核 酸的核酸探针。
此外，本实施例提供一种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中
的核酸的核酸分析器件，其特征在于，在平滑的支持基体上，具被含有顶点的
形状的金属结构体和由所述金属以外的材料构成薄膜层，制成所述含有顶点的 金属结构体的一部分从所述薄膜层露出、并且该部分以外的所述金属结构体被
埋入所述薄膜层中的结构，在所述露出的金属结构体表面固定用于分析试样中
的核酸的核酸探针，然后除去薄膜层，从而制作出核酸分析器件。
此外，本实施例提供一种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中 的核酸的核酸分析器件，其特征在于，具有通过光照射产生局域型表面等离子 体振子的金属结构体，用于分析试样中的核酸的核酸合成酶被配置在所述局域 型表面等离子体振子的产生部位。
此外，本实施例提供一种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中 的核酸的核酸分析器件，其特征在于，具备平滑的支持基板，在所述支持基板 上、在相对于所述支持基板表面垂直的方向上，顺序层叠金属体、绝缘层以及 金属体，在所述绝缘层具有用于分析试样中的核酸的核酸合成酶。
此外，本实施例提供一种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中 的核酸的核酸分析器件，其特征在于，具备平滑的支持基板，在所述支持基板 上，具备含有顶点的形状的金属结构体和由所述金属以外的材料构成的薄膜 层，所述金属结构体的一部分从所述薄膜层露出，在所述露出的金属结构体表 面，具有用于分析试样中的核酸的核酸合成酶。
此外，本实施例提供的前述记载的核酸分析器件的特征在于，所述结构体 是圆锥形。
此外，本实施例提供的前述记载的核酸分析器件的特征在于，所述结构体
是多面体。
此外，本实施例提供的前述记载的核酸分析器件的特征在于，作为金属， 使用从金、银、铂选出的贵金属。
此外，本实施例提供的前述记载的核酸分析器件的特征在于，将所述金属 结构体阵列状地配置于支持基体上。
此外，本实施例提供一种核酸分析装置，其特征在于，具有对试样照射光 的设备与发光检测设备，通过使核酸试样对前述记载的核酸分析器件进行杂 交，让具有荧光色素的核苷酸与核酸合成酶共存于所述器件上，在该器件上产 生核酸延伸反应，对在延伸反应中被组入核S吏链中的荧光色素进行荧光测定， 从而，取得所述核酸试样的碱基序列信息。
此外，本实施例提供一种核酸分析装置，其特征在于，具备对核酸分析
器件供给具有荧光色素的核苷酸、引物以及核酸试样的设备；对所述核酸分析 器件照射光的设备；在核酸分析器件上共存所述核苷酸、所述引物以及所述核 酸试样，利用由此产生的核酸延伸反应将荧光色素组入核酸链中，对该荧光色 素产生的荧光进行测定的发光检测设备；从而取得所述核酸试样的碱基序列信 自、
以下，参照附图来说明上述及其他的本发明的新的特征与效果。 这里，为了完全理解本发明，对特定的实施方式进行详细的说明，但本发 明不限于这里记载的内容。 实施例1
采用图1说明本实施例的器件的概念。为了识别在探针DNA上捕捉的荧 光色素101与未反应底物的荧光分子102,需要改变照射于探针DNA上被捕 捉的荧光色素101与浮游的未反应的荧光色素102的光的强度，或者只使探针 DNA上的色素101有效地产生辐射过程。实施例以后者的方案为基础，如 Physical Review Letters 2006, 96, pp 113002-113005 (非专利文献2 )中报告所 示，是基于这样的物理现象，即，局域型表面等离子体振子提高由于分子的光 吸收所产生的电子迁移与从激发单态向基态的辐射迁移这两者的概率。可以预 料到局域型表面等离子体振子的荧光增强效果为数倍至数十倍左右。该影响涉 及的范围是10nm至20nm左右，如果在固定有探针DNA的金属结构体的表
面产生局域型表面等离子体振子，则只有被探针DNA组入的色素会受到荧光 增强的良好影响，其与浮游的色素所产生的荧光强度差在数倍至数十倍以上。 产生局域型表面等离子体振子的部位以及影响涉及的范围是10nm至20nm左 右，这种程度极其局域化，因此，在这样的部位上固定探针DNA是极其困难 的，而且，关于在平滑基板上制作数万至数十万个产生这样的局域型表面等离 子体振子的部位，就本发明人等所能知道的范围来讲，至今还没有先例。本实 施例发现在产生局域型表面等离子体振子的部位上简便地固定探针DNA的方 法，并且，提供可在平滑基板103上制作数万至数十万个产生这样的局域型表 面等离子体振子的部位的方法。
对于由表面等离子体振子所产生的荧光增强现象，已知有使用Anal. Chem. Vol. 78, 6238-6245 (非专利文献3)所报告的纳米级的银的岛结构的物质，或 使用Nanotechnology， 2007, vol. 18， pp 044017-044021 (非专利文献4 )所报告 的金直径为数十纳米的球状微粒的物质。
对于一个个的探针DNA分子，将数万至数十万的具有岛状结构的块或球 状微粒配置于玻璃基板等平滑基板上是不可能的。特别是，将探针DNA分子 固定于规定的位点是不可能的。
因此，本发明人等对于可生成强有力的表面等离子体振子，并且可在表面
中使用的薄膜工艺来进行制造的结构，从而对结构进行了研究。
通过J. Comput. Theor. Nanosci. 2007， vol. 4， pp 686-691 (非专利文献5 )的 计算模拟来预测，当金纳米微粒接近时，在其间的间隙中所生成强有力的局域 表面等离子体振子。但是，使金纳米微粒接近来制成对、控制其微粒间的距离， 并将金纳米微粒对点阵状地排列于平滑基板上、并将DNA探针固定于构成对 的金微粒之间，这些操作是非常困难的。本发明人等潜心研究，结果设计出以 下结构体在金属结构体之间夹入绝缘层，通过控制该绝缘层的厚度来控制金 属结构体之间的间隔，并且，将探针DNA分子固定于该绝缘层。
插入金属结构体之间的绝缘层可以使用Si02等无机材料，也可以使用以 聚酰亚胺为代表的有机材料。哪种场合中，都可利用与金属表面的化学性质的
差别，选择适合的官能基团，将其赋予绝缘层，或者预先将所述官能基团修饰 于探针DNA分子末端，使其与金属结构体反应，从而制造想要的带有探针
DNA分子的金属结构体。绝缘层的膜厚优选为lnm至20nm左右，但并不限 于该条件。金属结构体通过利用掩模的蒸镀 溅射来制造，或者利用蒸镀 溅 射来形成薄膜后，通过干式或湿式蚀刻来制造。可以将金属、绝缘物、金属连 续地通过蒸镀'溅射进行制膜后，利用蚀刻等制成想要形状的结构体，也可以 通过掩模，用蒸镀'溅射来层叠金属、绝缘物、金属，制造出结构体。或者， 也可以用绝缘物夹住金属箔进行粘接后，将层叠物粘接于平滑基板，利用蚀刻 等进行成型，从而制造出想要的金属层叠体。金属结构体的合适的大小因照射 的光的波长而异。即，适合产生表面等离子体振子的共振频率根据金属结构体 表面的自由电子群与光的相互作用来确定。如果激发光是可见光，则金属结构 体的大小以及宽.高优选为30nm至1000nm左右，但并不限于该条件。通过 光引发的电场在金属中造成更大的反极化场(具有与光产生的外加电场相反相 位的电场)，这与强有力的局域型表面等离子体振子的形成有关，因此，作为 金属，优选具有更大负的介电常数的金属，优选金、银、铂等贵金属。
另外，作为产生强有力的表面等离子体振子的结构，已知有顶端尖锐化的 微小的针。例如，在Nanotechnology， 2006， vol. 17, pp 475-482 (非专利文献6 ) 中，通过计算模拟预测出顶端越尖就越可能产生强的表面等离子体振子。但是， 将顶端尖的金属针点阵状地排列于平滑基板，并将DNA探针固定于顶端是非 常困难的。本发明人等进行潜心研究设计出以下结构体其为使顶端尖锐化的 金属结构体，用与所述金属不同的材料覆盖所述金属结构体，使得只露出顶端，
金属顶端部固定探针DNA分子。作为使顶端尖锐化的结构体，优选圆锥形或 具有多个角的多面体，但并不限于该条件。作为覆盖所述结构体的材料，可以 应用Si02等无机材料或高分子等有机材料。作为制造方法，可以想到通过下 部宽的具有大锥度的掩模，利用蒸镀'溅射将金属制膜的方法。制造金属结构
体后，在整个面上形成Si02等无机材料或高分子等有机材料的薄膜。作为薄
膜的形成方法，应用蒸镀'溅射或利用涂布液的涂布。可以通过调控制膜的厚 度，使顶端部露出。或者，也可以形成厚到覆盖顶端部的薄膜后，通过蚀刻来
露出顶端部。为了将探针DNA分子固定于露出部，可以利用金属结构体表面
与薄膜表面的化学性质的差异。例如，金属是金而覆盖金属的膜是Si02时，
通过预先在探针DNA的末端修饰巯基，使得如果在形成Si02披覆膜后应用探 针DNA,则只在金露出部上固定探针DNA。金属结构体的合适的大小因照射 的光的波长而异。即，适于产生表面等离子体振子的共振频率是根据金属结构 体表面的自由电子群与光的相互作用而定的。如果激发光为可见光，则金属结 构体的大小与宽.高优选为30nm至1000nm左右，但并不限于该条件。另夕卜， 通过上述方法，将DNA探针固定于顶端部后，即使除去覆盖金属结构体的薄 膜，由表面等离子体振子所产生的效果也相同。覆盖金属结构体的薄膜对作为 核酸分析器件的特性产生不良影响时，优选被除去。
参照图2，对将DNA探针固定于邻近的两个金结构体之间的核酸分析器 件的制造方法进行说明。利用旋转涂布法在平滑的支持基体201上分别涂布2 种电子射线用正性保护层202、 203。作为平滑的支持基体，可以使用玻璃基 板、蓝宝石基板、树脂基板等。制成器件时，需要从与形成金属结构体的面相 对侧的背面照射激发光的场合中，最好使用透光性优异的石英基板或蓝宝石基 板。作为2种电子射线用正性保护层，例如，可以使用聚甲基丙烯酸曱酯、与 具有容易因自由基断裂而解聚的结构的高分子保护层的组合。作为后者的保护 层，在实用上优选用17(TC 200。C的加热板进行2 5分钟左右的预烘，并且， 可以用20KV的加速电压、电子射线量为20 50jiC/cm2进行描画，例如，可以 举出ZEP-520A(日本瑞翁社制造)。利用基板上的标记的位置进行定位后，实 施2次电子射线直描曝光，在各个保护层中，形成基板侧的保护层202的孔径 比保护层203的孔径大的通孔。例如，形成各自直径为300nm和250nm的通 孔。将该通孔作为锥度大的沉积用的掩模来有效利用。通孔依赖于可用并行处 理解析的核酸分子数，考虑到制造上的简便性'成品率的高低与可用并行处理 解析的核酸分子数，适于以l)im左右的间距来形成。通孔形成区域也取决于 可用并行处理解析的核酸分子数，但在很大程度上也依赖于检测装置侧的位置 精度、位置分解能。例如，以l卩tm的间距构成反应位点(金属结构体)时， 如果通孔形成区域为lmmxlmm,则能形成100万个反应位点。形成通孔后， 根据金属结构体的组成，将钛204、金205、钛206、 Si02膜207、钛208、金
209用溅射进行制膜。为了增强蓝宝石-金、金-Si02间的粘接，而优选加入钛， 也可以使用铬等其他金属。剥离2层保护层后，通过蚀刻金209使得钛208 露出。金209的蚀刻优选湿式蚀刻，蚀刻液优选石典系的蚀刻液。；魂系蚀刻液由 碘与碘化物(碘化钾或碘化铵)构成，具有如下优点液体是中性而容易操作， 根据成分浓度也容易控制蚀刻速度。作为例子，可以举出AURUM-301 (关东 化学社制造)。接着，通过干式蚀刻对钛208、 Si02膜207、钛206进行蚀刻， 使下层的金205露出。该蚀刻优选氩等离子体蚀刻。接着，再次对金进行湿式 蚀刻，直至下层的金205的宽度为100nm至500nm左右。该金205的最终大 小需要根据用于生成局域型表面等离子体振子而照射的光的波长来调节。例 如，使用500nm左右的光的场合中，宽度为50nm至500nm左右、高度为50nm 至500nm左右是有效的。最后，将DNA探针固定于Si02膜207上。固定方 法考虑了各种方法，作为例子记述了使用氨基硅烷处理的方法。通过氨基硅烷 处理，将氨基导入SiCb膜207。然后，使其与生物素-琥珀酰亚胺(Pierce公 司制造的NHS-Biotin)反应后，与链霉亲和素进行反应，接着，再与预先将生 物素修饰于末端的DNA探针210进行反应，从而，制成了在邻近的两个金结 构体之间固定有DNA探针的核酸分析器件。DNA探针的长度并无特别限制， 但如果太长或者太短，则可能会使DNA隐藏于金结构体，其与核酸试样的杂 交效率可能会变差。因此，DNA探针长度优选为20至50个碱基长度。在使 用除了金以外的银或铂的场合中，当然可以利用与上述制造方法相同的方法来 制作。
接着，参照图3,对于在金的圆锥形的顶端部固定有DNA探针的结构的 核酸分析器件的制造方法进行说明。利用旋转涂布法，将2种电子射线用正性 保护层302、 303分别涂布于平滑的支持基体301上。作为平滑的支持基体， 可以使用玻璃基板、蓝宝石基板、树脂基板等。制成器件时，在需要从与形成 有金属结构体的面相对侧的背面照射激发光的场合中，使用透光性优异的石英 基板或蓝宝石基板即可。作为2种电子射线用正性保护层，例如，可以使用聚 曱基丙烯酸曱酯、与具有容易因自由基断裂而解聚的结构的高分子保护层的组 合。作为后者的保护层，在实用上优选用170 200。C的加热板进行2 5分钟左 右的预烘，并且，可以用20KV的加速电压、电子射线量为20 5(^C/cn^进行
描画，例如，可以举出ZEP-520A(日本瑞翁社制造)。利用基板上的标记的位 置进行定位后，实施2次电子射线直描曝光，在各个保护层中，形成基板侧的 电子射线用正性保护层302的孔径比电子射线用正性保护层303的孔径大的通 孔。例如，形成各直径为300nm和100nm的通孔。将该通孔作为锥度大的沉 积用的掩模来有效利用。形成通孔后，根据金属结构体的组成，利用溅射将钛 304、金305进行制膜。从增强蓝宝石-金之间的粘接的角度考虑，优选利用钛， 也可以使用铬等其他的金属。形成的溅射膜305如图3所示，呈圆锥形。对于 调节该圆锥形的形状，改变2层保护层的各膜厚与孔径是有效的方法。剥离2 层保护层后，利用賊射将Si02膜306进行制膜。接着，通过反应性离子蚀刻 (使用CF4/02)，对SiO2膜306进行蚀刻，使金305的顶端部露出。接着，通 过羟基硅梡处理，在Si02膜306上导入鞋基，防止非特异性吸附。最后，与 在末端修饰有巯基的DNA探针307反应，从而制成在金的圆锥形顶端部固定 有DNA探针的结构的核酸分析器件。在使用除了金以外的银或铂的场合中， 当然可以利用与上述制造方法相同的方法来制作。
参照图4，对核酸分析器件优选的结构的一个例子进行说明。在透光性支 持基体401上，搭载多个以点阵状配置有金属结构体的区域402。金属结构体 相当于前面所述的金属结构体，即，在邻近的两个金结构体之间固定有DNA 探针的金属结构体，或在金的圆锥形的顶端部固定有DNA探针的结构的金属 结构体。配置间隔可以根据要解析的核酸试样、荧光^f全测装置的规格来进行适 当的设定。例如，将25mmx75mm的载玻片作为透光性支持基体401、使以1 微米间隔点阵状地配置有金属结构体的区域402为5mmx8mm时，每一区域 可以解析4000万种的核酸分子，可以将8个左右的这样的区域搭载于透光性 支持基体401 (载玻片)上。因而，例如在用于RNA的表达解析的场合中， 每一细胞表达大约40万分子的RNA，因此，可以像数字计数那样十分正确地 进行RNA的表达频率解析，在一片基板上可以进行8个左右的解析。如前所 述，为了在透光性支持基体401上设置多个反应区域，可以通过将预先设置流 路的反应室403盖在透光性支持基体401上来实现。反应室403是由为形成流 路而预先挖掘了流路407的槽的PDMS ( polydimethylsiloxane:聚二曱基硅氧 烷)等树脂基体形成的，贴合于器件上进行使用。具体来讲，是由对核酸试样、 反应酶、缓冲液、核苷酸底物等进行保存 温度管理的温调单元404,输出反 应液的分注单元405,控制液体流动的阀406，废液罐408构成的。根据需要， 配置温调才几进行温度控制。反应结束时，通过反应室403的流路供给洗涤液， 并收纳于废液罐408。 实施例2
对核酸分析装置的实施例进行说明。参照图5，对使用核酸分析器件的核 酸分析装置的优选结构的一个例子进行说明。
在本实施例中，核酸分析装置具备对核酸分析器件供给具有荧光色素的 核苷酸、核酸合成酶以及核酸试样的设备；对核酸分析器件照射光的设备；对 于通过在核酸分析器件上共存核苷、核酸合成酶以及核酸试样所产生的核酸延 伸反应而被组入核酸链中的荧光色素的荧光进行测定的发光检测设备。更具体 地讲，在反应室中设置所述器件505,所述反应室是由盖板501、检测窗502、 作为溶液交换口的注入口 503以及排出口 504构成的。作为盖板501与检测窗 502的材质，使用PDMS (聚二甲基硅氧烷)。另外，检测窗502的厚度为 0.17mm。由YAG激光光源(波长532nm,输出20mW ) 507以及YAG激光 光源(波长355nm,输出20mW ) 508振动出激光5]0与509，只将激光509 利用入/4板511制成圆偏振光，通过二色镜512 (反射波长410nm以下的光) 将所述两个激光调节至同轴后，利用透镜513进行聚光，然后，经由棱镜514 以临界角以上对器件505进行照射。根据本实施例，通过激光照射，使得存在 于器件505表面上的金属结构体中产生局域型表面等离子体振子，被结合于金 属结构体的DNA探针捕捉的靶物质的荧光体会存在于荧光增强场内。荧光体 被激光激发，其增强的荧光的一部分经由检测窗502被射出。另外，由检测窗 502射出的荧光通过物镜515 ( x60, NA1.35,动作距离0.15mm)形成平行 光束，利用光学滤波器516屏蔽掉背景光与激发光，利用成像透镜517在二维 CCD相机518上成像。
在逐次反应方式的场合中，作为带有荧光色素的核苷酸，可以使用P.N.A.S 2006, Vol. 103, pp 19635-19640 (非专利文献7)中公开的核苷酸，即，在核糖 的3'OH位置上引入3，-0-烯丙基作为保护基，并且，在嘧啶的5位的位置或 嘌呤的7位的位置上经由烯丙基结合有荧光色素的核苷酸。由于烯丙基通过光
照射或与钯接触会被切断，因此，可以同时实现色素的消光与延伸的控制。在 逐次反应中也不需要以洗涤来除去未反应的核苷酸。此外，由于不需要洗涤工 序，因此也可以以实时方式计测延伸反应。此时，所述核苷酸不需要在核糖的
3'OH位置上引入3，-0-烯丙基作为保护基，使用通过用光照射就能够断裂的官 能基团与色素结合的核苷酸即可。
如上所述，通过采用本实施例的核酸分析器件组成核酸分析装置，不用引 入洗涤工序，可以实现解析时间的缩短化、器件及分析装置的简便化，不只是 逐次反应方式，还可以以实时方式才企测石威基的延伸反应，相对于以往技术可以 实现生产能力的大幅改善。
实施例3
通常，由局域型表面等离子体振子产生的荧光增强场，即使再大也就是结 构体的直径程度，更具体讲，是20nm以下的大小。另一方面，核酸的大小在 IO个碱基长度时为3.4nm,与20nm的增强场相当的核酸为20 + 3.4x 10 — 58.8 个碱基长度。因而，在实施例l的器件中，如果不想办法使延伸的核酸成团或 扩大在荧光增强场的话，则难以确定比58个碱基长度长的碱基序列。如果读 取的碱基长度短，则将得到的序列信息与DB校对时的校对率就低。
因此，在本实施例中，与实施例1和2不同，用于分析试样中的核酸的核 酸合成酶被配置在所述表面等离子体振子的产生部位。由于可在荧光增强效果 所涉及的区域内固定核酸合成酶，因此，可以读取更长的碱基长度。以下，以 不同于实施例1和2的内容为主进行说明。
参照图6对本实施例的器件的概念进行说明。为了识别被核酸合成酶605 捕捉的荧光色素101与未反应底物的荧光分子102，需要只让核酸合成的色素 101有效地产生辐射过程。局域型表面等离子体振子的荧光增强效果涉及的范 围是10nm至20nm左右，如果在固定核酸合成酶605的金属结构体的表面产 生局域型表面等离子体振子，则只有被组入核酸合成酶605的色素受到荧光增 强的良好影响，与游离的色素相比，可带来数倍至数十倍的荧光强度的差別。 本实施例发现在产生局域型表面等离子体振子的部位上简便地固定核酸合成 酶605的方法，并且，提供一种能够在平滑的支持基板103上制作数万至数十 万个产生这种局域型表面等离子体振子的部位的方法。
在本实施例中，在金属结构体之间夹入绝缘层，通过控制该绝缘层的厚度 来控制金属结构体之间的间隔，并且，将核酸合成酶固定于该绝缘层。
插入金属结构体之间的绝缘层可以使用Si02等无机材料，也可以使用以 聚酰亚胺为代表的有机材料。哪种场合中，都可利用与金属表面的化学性质的 差别，选择适合的官能基团，将其赋予绝缘层，或者使存在于核酸合成酶内的 官能基团、或被导入进核酸合成酶的新的官能基团与金属结构体进行反应，从 而制造出想要的带有核酸合成酶的金属结构体。
另外，也可以制成使顶端尖锐化的金属结构体，用与所述金属不同的材料 覆盖所述金属结构体使得只露出顶端，利用所述金属和覆盖其的材料与核酸合 成酶的粘接性的差异，使核酸合成酶只固定于金属顶端部。
为了将核酸合成酶固定于露出部，可以利用金属结构体表面与薄膜表面的 化学性质的差异。例如，金属为金而覆盖金属的膜为Si02时，使存在于核酸 合成酶内的官能基团或导入进核酸合成酶的新的官能基团与导入进金的表面 的官能基团进行反应，从而只在金露出部上固定核酸合成酶。金属结构体的合 适的大小因照射的光的波长而异。即，适于产生表面等离子体振子的共振频率 根据金属结构体表面的自由电子群与光的相互作用而定。如果激发光为可见
光，则金属结构体的大小为，宽.高适于为30至1000nm左右，但并不限于 该条件。另外，通过上述方法，将核酸合成酶固定于顶端部后，即使除去覆盖 金属结构体的薄膜，由表面等离子体振子所产生的效果也相同。在覆盖金属结 构体的薄膜对作为核酸分析器件的特性造成不良影响时，优选将其除去。
核酸合成酶只要能延伸核酸即可，并无特别限制。作为这样的例子，例如 核酸是DNA时，可以举出各种DNA聚合酶。另一方面，核酸是RNA时，可 以举出各种RNA聚合酶。
一种在临近的两个金结构体之间固定有核酸合成酶的核酸分析器件的制 造方法，其中，在将核酸合成酶固定于Si02膜之前的步骤与实施例1相同， 因此省略对其进行说明。将核酸合成酶固定于Si02膜的方法考虑了各种方法， 作为例子，记述了使用氨基硅烷处理的方法。通过氨基硅烷处理，在Si02膜 207上导入氨基。然后，与作为双功能试剂的N-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)琥 珀酰亚胺(同仁化学研究所社制造的GMBS )进行反应后，与核酸合成酶进行
反应，从而制成在临近的两个金结构体之间固定有核酸合成酶的核酸分析器 件。关于固定核酸合成酶的方法，前述的方法不过是一个例子，还可使用的方
法有利用与其他的硝酸纤维素、聚丙烯酰胺等的物理吸附的方法；利用组氨 酸与镍离子或钴离子的特异性亲和的方法；或者利用生物素与抗生物素蛋白的 结合的方法等。另外，作为金属结构体使用银或铂时，也可以同样地制作。
接着，提供一种在金的圓锥形的顶端部固定有核酸合成酶的核酸分析器件 的制造方法，其中，在将核酸合成酶固定于金的圆锥形的顶端部之前的步骤与 实施例2相同，因此省略对其进行说明。
与实施例2同样，通过反应性离子蚀刻(使用CF4/02),对SiO2膜306进 行蚀刻，使金305的顶端部露出。接着，通过羟基硅烷处理，在Si02膜306 上导入羟基，防止非特异性吸附。然后，采用氨基烷硫醇，形成SAM (Self-Assembled monolayer:自组装单分子层)膜，在金表面上导入氨基后， 采用N- (4-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺(同仁化学研究所社制造的 GMBS)来导入能够与巯基反应的官能基团。最后，使存在于核酸合成酶307 内的巯基与所述官能基团进行反应，从而制成在金的圓锥形的顶端部固定有核 酸合成酶的结构的核酸分析器件。关于固定核酸合成酵的方法，前述的方法不 过是一个例子，还可使用的方法有利用与其他的硝酸纤维素、聚丙烯酰胺等 的物理吸附的方法；利用组氨酸与镍离子或钴离子的特异性亲和的方法；或者 利用生物素与抗生物素蛋白的结合的方法等。另外，作为金属结构体使用银或 铂时，也可以同样地制作。
另外，在本实施例中说明的核酸分析器件可以用与实施例2同等的核酸分 析装置进行分析。与实施例2的不同之处只是用核酸合成酶来取代引物，这里 省略说明。另外，此时，该装置具备对核酸分析器件供给具有荧光色素的核 苷酸、引物以及核酸试样的设备；对核酸分析器件照射光的设备；对于通过在 核酸分析器件上共存核苷、引物以及核酸试样所产生的核酸延伸反应而被组入 核酸链中的荧光色素的荧光进行测定的发光检测设备。
另外，各实施例可以进行适当的组合。
权利要求
1.一种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中的核酸的核酸分析器件，其具有通过光照射产生局域型表面等离子体振子的金属结构体，在所述局域型表面等离子体振子的产生部位配置有用于分析试样中的核酸的核酸探针。
2. —种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中的核酸的核酸分 析器件，其具备平滑的支持基体，在所述支持基体上、在相对于所述支持基体 表面垂直的方向上，顺序层叠金属体、绝缘层和金属体，所述绝缘层具有用于 分析试样中的核酸的核酸探针。
3. —种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中的核酸的核酸分 析器件，其具备平滑的支持基体，在所述支持基体上具备含有顶点的形状的金 属结构体和由所述金属以外的材料构成的薄膜层，所述金属结构体的一部分从 所述薄膜层露出，在所述露出的金属结构体表面具有用于分析试样中的核酸的 核酸探针。
4. 根据权利要求3所述的核酸分析器件，其特征在于，所述金属结构体 为圓锥形。
5. 根据权利要求3所述的核酸分析器件，其特征在于，所述金属结构体 为多面体。
6. 根据权利要求1所述的核酸分析器件，其特征在于，作为所述金属结 构体，使用从金、银或铂中选出的贵金属。
7. 根据权利要求1所述的核酸分析器件，其特征在于，所述金属结构体 以阵列状配置于所述支持基体上。
8. 使用权利要求1所述的核酸分析器件的核酸分析装置，其特征在于， 具备对核酸分析器件供给具有荧光色素的核苷酸、核酸合成酶以及核酸试样的 设备；对所述核酸分析器件照射光的设备；对该组入核酸链中的荧光色素的荧光进行测定的发光检测设备，所述焚光色素是通过核酸分析器件上共存所述核苷酸、所述核酸合成酶以及所述核酸试 样而发生的核酸延伸反应被组入核S吏链中的； 从而取得所述核酸试样的碱基序列信息。
9. 一种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中的核酸的核酸分析器件，其具有通过光照射而产生局域型表面等离子体振子的金属结构体，在 所述局域型表面等离子体振子的产生部位配置有用于分析试样中的核酸的核 酸合成酶。
10. —种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中的核酸的核酸分析器件，其具备平滑的支持基板，在所述支持基板上、在相对于所述支持基体 表面垂直的方向上，顺序层叠金属体、绝缘层和金属体，所述绝缘层具有用于 分析试样中的核酸的核酸合成酶。
11. 一种核酸分析器件，其为利用荧光测定来分析试样中的核酸的核酸分 析器件，其具备平滑的支持基板，在所述支持基板上具备含有顶点的形状的金 属结构体和由所述金属以外的材料构成薄膜层，所述金属结构体的一部分从所 述薄膜层露出，在所述露出的金属结构体表面，具有用于分析试样中的核酸的 核酸合成酶。
12. 根据权利要求11所述的核酸分析器件，其特征在于，所述金属结构 体为圆锥形。
13. 根据权利要求11所述的核酸分析器件，其特征在于，所述金属结构 体为多面体。
14. 根据权利要求9所述的核酸分析器件，其特征在于，作为所述金属结 构体，使用从金、银或铂中选出的贵金属。
15. 根据权利要求9所述的核酸分析器件，其特征在于，所述金属结构体 以阵列状配置于所述支持基板上。
16. 使用权利要求9所述的核酸分析器件的核酸分析装置，其特征在于， 具备对核酸分析器件供给具有荧光色素的核苷酸、引物以及核酸试样的设备； 对所述核酸分析器件照射光的设备；对组入核酸链中的荧光色素产生的焚光进行测定的发光检测设备，所述荧 光色素是通过在核酸分析器件上共存所述核苷酸、所述引物以及所述核酸试样而发生的核酸延伸反应被组入核S吏链中的；从而取得所述核酸试样的石威基序列信息。
全文摘要
本发明提供一种核酸分析器件以及使用其的核酸分析装置。本发明的目的是识别通过碱基延伸反应而被组入DNA双链中的核苷酸所附带的一分子荧光色素与未反应底物的荧光分子。本发明涉及利用荧光测定来分析试样中的核酸的核酸分析器件，其通过光照射产生局域型表面等离子体振子，并且，用于分析试样中的核酸的核酸探针或核酸合成酶被配置于所述表面等离子体振子的产生部位。通过本发明，利用表面等离子体振子而有效地产生荧光增强效果，并且，将DNA探针或核酸合成酶固定于荧光增强效果所涉及的区域，因此，即使不除去带有荧光分子的未反应底物，也能够计测碱基延伸反应。
文档编号G01N21/64GK101349645SQ200810133340
公开日2009年1月21日 申请日期2008年7月18日 优先权日2007年7月20日
发明者奈良原正俊, 斋藤俊郎, 高桥智 申请人:株式会社日立高新技术