专利名称：利用荧光光素酶和fmn:nadh氧化还原酶进行重金属汞定量检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测汞的方法，特别是涉及一种利用海洋发光细菌Woto6octen'w附/e/og^淑YL胞内 荧光光素酶和FMN:NADH氧化还原酶进行重金属汞定量检测的方法。
背景技术：
据本发明人通过査阅资料、文献检索所知，目前已知的海洋发光细菌只有三属，分别是弧菌属(W6n'o)， 明亮发光菌属(i^otoZwcten'鹏)，及希瓦氏菌属(幼ewa"e&)，陆地上则有异短杆菌属(Xe"wto^^)。在 有氧的自然环境下，发光细菌可产生荧光素酶(LE)，催化黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛类发生 氧化反应，而发出蓝绿色的荧光。
目前在我国应用较广的是明亮发光杆菌(尸/2oto6acto"/wTT7 /^cw; torcz/m),利用明亮发光杆菌进行环境 污染物检测的研究有所报道。而除了明亮发光杆菌以外，均没有利用其他种属的发光细菌进行环境污染物 检测的报道。本发明中涉及的菌种鳆发光杆菌(P/zotoZw"m'M附fe'ogmrfW)与明亮发光杆菌(Ptoto6。"m'鹏 P/wv/wmm附)为同属异种，在菌体形态特征、生理生化特征及16SrDNA序列上二者均有很大差异。该菌 株尸/20to6ac欣/w加/"og加决z' YL表现出稳定的发光性能，对重金属汞敏感，可以定量检测汞。
发光细菌的发光机理的研究表明，不同种类的发光细菌的发光机理是相同的，属酶促氧化反应。是由 分子氧作用，胞内荧光酶(LE)催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及八碳以上的长链脂肪醛(RCHO) 氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为450 490nm的蓝绿光。
荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶共同存在下的酶促氧化反应的原理如下
FMN:NADH氧化还原酶对FMN有特异性，在NADH存在的条件下，将FMN还原为FMNH2，为发 光酶促反应提供底物。荧光光素酶催化FMNH2和RCHO发生氧化还原反应，同吋发出蓝绿色荧光。
目前尚未有利用荧光光素酶和FMN:NADH氧化还原酶进行重金属汞定量检测的报道。
发明内容
本发明的目的是利用一株来源于海洋环境的发光细菌菌株P/wto幻她W, YL (鳆发光杆菌
YL)胞内荧光光素酶和FMN:NADH氧化还原酶进行汞的定量检测。
本发明分离纯化出一株来源于海洋环境的发光细菌YL为革兰氏阴性杆菌，被鉴定为鳆发光杆菌 (户/wtobacto7'鹏/^gMaW)。该菌株于2006年12月27日委托中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC) 保藏，保藏号为M 206139。该菌株的16S rDNA基因序列已经提交GenBank核酸序列数据库，存取号为 EF017227。
本发明通过提取发光细菌胞内荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶粗酶制剂，建立一种荧光光素酶 FMN-NADH氧化还原酶体外发光的体系，实现了荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶双酶体系在活体细 胞外的表达，通过重金属汞对双酶体系发光的抑制来测定汞的浓度。
其双酶体系特征是 '
(1) 最佳底物配比十二烷醛1004L (27raM)、 FMN-Na53叱(10mM)和NADH 200叱(0. 14mM),体系 pH 7. 0。
(2) 发光检测在微弱发光仪中进行，检测条件是设置波长474nm， lmL酶液中，快速加入各底物， 立刻进行定时跟踪测定，连续测定间隔时间为ls。
其检测体系特征是
提取发光细菌胞内产物作为荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶粗酶制剂进行重金属汞的定量测
定；
反应温度为4'C,反应时间为15min。
本发明实现了荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶在活体细胞外的表达，构建了荧光光素酶 FMN-NADH氧化还原酶体外发光体系。该体系发光性能稳定，发光强度高，底物配比简便可行，并可实 现汞的定量检测。利用本发明检测汞具有成本低、操作简便、灵敏度高等特点，能够满足汞的快速定量检 测的需要。
附图1重金属离子对荧光光素酶酶活的影响。 附图2 Hg^离子对荧光光素酶酶活的影响。
具体实施方式
实施例1酶液制备收集细胞悬浮液20mL， 4'C低温离心(5000ipm， 5min)，弃上清，加入一定量PBS (5mL)，磁力振 荡器混匀，冰上超声破碎，每个样本超声时间15s，每个间隔30s，粉碎15次，功率300W。提取得到粗 酶液。实施例2酶体系酶活测定lmL粗酶液中， 一次性快速加入底物12烷醛100|uL (27mM)、 FMN-Na53pL (10mM)， Na2S204 lOOpL (34mM)， NADH lOOpL (0,14mM)，进行酶活测定。发光检测在微弱发光仪中进行，检测条件是加入溶液或试剂后，立刻进行定时跟踪测定，连续测定 间隔时间为ls。实施例3酶体系对重金属敏感性的筛选lmL酶液中加入500nL重金属溶液，4'C放置反应15min， 一次性快速加入底物12垸醛lOOpL (27mM)、 F画-Na53fiL (10mM), Na2S2O4100nL (34mM)， NADH 100|iL (0.14mM)，进行酶活测定。 筛选酶敏感的重金属。重金属离子可与菌体蛋白质结合使之变性或与某些蛋白的巯基结合而使酶失活[13]，不同浓度的各重金属离 子对酶活的影响如图5所示，差异很大。酶对Hg^最敏感，其次是C,+、 Cd2+，当浓度为0.5ng/L时，Hg2+ 对酶的活性抑制率达到94%以上，Cr"对酶的活性抑制率为13.69%， Cc^+为3.51%。同样选取对酶活影响 最大的Hg2、进行加标回收率试验。实施例4尸./e/ogw^/H'YL荧光光素酶体系检测南美白对虾中的Hg2+① Hg+浓度抑制酶活的标准曲线酶活测定方法同实施例2，以不同浓度Hg&溶液为横坐标，酶活抑制率为纵坐标，每次测定重复3次， 做Hg&浓度抑制酶活的标准曲线。以Hg"溶液浓度为横坐标，酶活抑制率为纵坐标，得到Hg^离子对酶 活影响的标准曲线，如附图1所示，方程为y = 15.486x - 22.986， R2 = 0.9676。标准曲线的检出限为 0細5ng/L。② 酶体系检测南美白对虾中Hg^的加标回收实验及实际样品检测称取5.0g南美白对虾虾肉样品于瓷坩埚中，添加不同浓度的Hg^溶液，添加5mL浓硝酸，先小火在 可调万用电炉上炭化至无烟，移入马弗炉500'C灰化6 8h时，冷却。若个别样品灰化不彻底，则加lmL 混合酸在万能电阻炉上小火加热,反复多次直至消化完全，放冷。。样品灰化后加入5mL双蒸水混溶。4'C 下存储备用。lmL酶液中加入500pL Hg^样品溶液，4'C放置反应15min， 一次性快速加入发光体系各组分，测定 酶活抑制率。比对标准曲线，计算HgS+实际检测浓度。检测重复7次，取平均值。以不加内标的南美白对虾样品作为空白本底。通过内标逐渐递加的方法，确定酶进行Hg^检测的方法检出限(表l)。表1酶体系检测南美白对虾中Hg^的加标回收实验及实际样品检测(n=7)样品浓度(Hg/Kg)测量值(ng/Kg)回收率％RSD%0扁50細23446.8019.540.00060.00038063.3315.210扁70.00052174.4310.110扁80.00071489.258.760.0010扁38311.30.01、0.010910910.90.0250.0233993.568.4权利要求
1一种利用海洋发光细菌Photobacterium leiognathi YL菌株胞内荧光光素酶和FMN:NADH氧化还原酶进行重金属Hg定量检测的方法。其双酶体系特征是(1)最佳底物配比十二烷醛100μL(27mM)、FMN-Na53μL(10mM)和NADH 200μL(0.14mM)，体系pH 7.0。(2)发光检测在微弱发光仪中进行，检测条件是设置波长474nm，1mL酶液中，快速加入各底物，立刻进行定时跟踪测定，连续测定间隔时间为1s。其检测体系特征是提取发光细菌胞内产物作为荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶粗酶制剂进行重金属汞的定量测定；反应温度为4℃，反应时间为15min。
全文摘要
本发明的目的是利用一株来源于海洋环境的发光细菌菌株Photobacterium leiognathi YL(鳆发光杆菌YL)胞内荧光光素酶和FMN:NADH氧化还原酶进行汞的定量检测。本发明分离纯化出一株来源于海洋环境的发光细菌YL为革兰氏阴性杆菌，被鉴定为鳆发光杆菌(Photobacterium leiognathi)。该菌株于2006年12月27日委托中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏号为M 206139。该菌株的16S rDNA基因序列已经提交GenBank核酸序列数据库，存取号为EF017227。本发明通过提取发光细菌胞内荧光光素酶和FMN-NADH氧化还原酶粗酶制剂，建立一种荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶体外发光的体系，实现了荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶双酶体系在活体细胞外的表达，通过重金属汞对双酶体系发光的抑制来测定汞的浓度。本发明实现了荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶在活体细胞外的表达，构建了荧光光素酶FMN-NADH氧化还原酶体外发光体系。该体系发光性能稳定，发光强度高，底物配比简便可行，并可实现汞的定量检测。利用本发明检测汞具有成本低、操作简便、灵敏度高等特点，能够满足汞的快速定量检测的需要。
文档编号G01N21/64GK101625322SQ200810157628
公开日2010年1月13日 申请日期2008年10月6日 优先权日2008年10月6日
发明者朱兰兰, 洪 林, 梅册霞, 王亚群, 王静雪 申请人:中国海洋大学