猪圆环病毒2型抗原亚型鉴定试纸卡的制作方法

专利名称：猪圆环病毒2型抗原亚型鉴定试纸卡的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种猪圆环病毒2型(PCV2)抗原亚型鉴定试纸卡。
背景技术：
猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2， PCV2)是猪圆环病毒病(PCVD)的病原，导致猪群免 疫抑制，给养猪业造成了巨大的经济损失；是目前发现的最小的动物病毒，病毒粒子直径约 17nm，为共价闭合，环状，单股DNA病毒。在DNA水平上，已发现基因组全长分别为1768nt、 1767nt、 1766nt三种PCV2病毒。已知PCV2 0RF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，ORF2 编码PCV2免疫相关的衣壳蛋白，ORF3编码与PCV2复制无关、与致病性有关的蛋白。 1766PCV2在1059位缺失一个核苷酸G，引起ORF2 C末端密码子移位，使得1766PCV2缺失 m7PCV2的特异性抗原表位。该特征性抗原表位可作为血清学标志，用于1766PCV2、 1767PCV2 和，PCV2的抗原分型鉴定。
目前，国内外釆用的PCV2抗原和抗体检测技术主要有病毒分离培养，间接免疫荧光 (IFA)，免疫酶单层试验(IMPA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，原位杂交(ISH)，聚合酶链式反 应(PCR)等等。上述技术和方法虽然可以检测PCV2病毒，在实践中也取得一定的效果，但均 无法实现对PCV2实现抗原分型的鉴别诊断，并且存在试验操作复杂，耗时长，需要特定的 专业技能和仪器设备等，常限于实验室内进行，很难在基层普及和推广。因此，在分析鉴定 PCV2亚型抗原表位特征的基础上，研制开发适用于养殖基层的快捷、简便的PCV2鉴别诊断 和抗原分型检测器具，对诊断、监控猪群PCV2感染，有效控制PCVD的发生和危害有重要 意义。

发明内容
本发明的目的是提供一种适用于猪PCV2抗原亚型鉴定的试纸卡，在生产实践中易于
推广应用。
本发明的PCV2抗原亚型鉴定试纸卡，包括用不吸水薄片条制成的支撑层1，反应试剂 载体吸附层固定在支撑层1上，从样品端12到手柄端13的反应试剂载体吸附层依次为纤 维层2，金标纤维层3，纤维素膜层4和吸水材料层5，金标纤维层3为吸附胶体金标记的识 别PCV共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体的金标玻璃棉，纤维素膜层4为从样品端12 至手柄端13依次印制检测印迹T1 6、检测印迹T2 7、检测印迹T3 8和对照印迹C 9 的硝酸纤维素膜，试纸卡固定在塑料卡Il内，在样品端12设有加样孔10;检测印迹T1 6 为以识别1767PCV2亚型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液在纤维素膜上印制的 1767亚型条状检测印迹，检测印迹T2 7为以识别766PCV2和n67PCV2共同抗原表位的抗 衣壳蛋白单克隆抗体溶液印制的1766和1767亚型条状检测印迹，检测印迹T3 8为以识别 PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液印制条状检测印迹，对照印迹C 8为以抗小鼠IgG多克隆抗体溶液印制的条状对照印迹，上述4条印迹按序平行排列。 以上方案详述如下
PCV2抗原亚型鉴定试纸卡含有支撑层和反应试剂载体吸附层，支撑层为不吸水薄片条， 反应试剂载体吸附层粘贴于支撑层上，由样品端到手柄端依次为纤维层、金标纤维层、纤维 素膜层和吸水材料层，纤维素膜层为从样品端至手柄端依次印制检测印迹T1，检测印迹T2， 检测印迹T3和对照印迹C的硝酸纤维素膜，试纸卡固定在塑料卡内，在样品端设有加样孔。
支撑层的不吸水薄片条可用硬质塑胶片条，或不吸水的硬纸条，纤维层可用玻璃棉，吸 水材料层可用吸水纸，纤维素膜层可用硝酸纤维素膜，金标纤维层可用吸附金标蛋白玻璃棉， 简称金标玻璃棉，金标蛋白为胶体金标记的识别PCV共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体 mAbl，检测印迹T1为以识别i^PCV2型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb2溶 液在纤维素膜上印制的1767PCV2检测印迹"I "，检测印迹T2为以识别1766PCV2和1767PCV2 共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb3溶液印制的1766PCV2和1767PCV2检测印迹 "I ",检测印迹T3为以识别PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb4溶液印制 的PCV2检测印迹"I "，对照印迹C为以抗小鼠IgG多克隆抗体pAb溶液印制的对照印迹
C " I "，其组合排列为"I I I 1"。 试纸卡具有下列各项优点
(1) 特异性强，敏感性高。PCV2抗原亚型鉴定试纸卡以高亲和力单克隆抗体为基础制备 而成，抗衣壳蛋白单克隆抗体分别特异性识别PCV2共同抗原表位，以及PCV2抗原亚型特 异性抗原表位，有效区分PCV2不同抗原亚型，有高度的特异性。
(2) 操作简便快速。使用PCV2抗原亚型鉴定试纸卡检测PCV2，能有效鉴别检测不同抗 原亚型PCV2感染，在5-10分钟内即可判定检测结果。
(3) 显示检测结果形象、直观准确。PCV2抗原亚型鉴定试纸卡以红棕色"I "， " I I "， "I I I"或"I I I I"作为阴性，1768亚型，1766亚型和1767亚型PCV2检测标记，
通过PCV2抗原亚型鉴定试纸卡可鉴别检测不同抗原亚型PCV2感染，即在PCV2抗原亚型 鉴定试纸卡上显示一条棕红色"I "印迹表示在被检测样品中未检出PCV2，两条棕红色"1 I " 印迹表示被检样品1768亚型PCV2阳性，三条棕红色"III"印迹表示被检样品1766亚 型PCV2阳性，四条棕红色"I I I I"印迹表示被检样品1767亚型PCV2阳性，试纸卡无 显色印迹则表示检测失败或试纸卡失效，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现 假阴性和假阳性误判。
(4) 成本低，投资少。PCV2抗原亚型鉴定试纸卡可在检测现场完成操作，检测一步到位， 成本低廉，投资少，见效快。
本发明有益的积极效果是操作简单，普通技术人员可以操作，能满足各种需要，如疫 病诊断、疫病监测、口岸检疫、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等，易于大范围推广，具 有广阔的市场前景。


图1是PCV2抗原亚型鉴定试纸卡结构示意图。图中，l.支撑层，2.样品端的纤维层，3. 金标纤维层(金标玻璃棉)，4.纤维素膜层，5.手柄端的吸水材料层，6.检测印迹T1， 7.检测印 迹T2， 8.检测印迹T3， 9.对照印迹C， 10.加样孔，ll.塑料卡，12.样品端，13.手柄端。
图2是PCV2抗原亚型鉴定检测结果图。图中，1为PCV2阴性，2为1768亚型PCV2， 3为1766亚型PCV2, 4为1767亚型PCV2， 5为检测失败或试纸卡失效。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明进一步描述。
PCV2抗原亚型鉴定试纸卡可应用于猪PCV2感染检测并进行PCV2抗原亚型鉴定。制备 PCV2抗原亚型鉴定试纸卡，首先需制备PCV2衣壳蛋白重组蛋白，进而制备抗衣壳蛋白单克 隆抗体，筛选获得识别PCV2共同抗原表位，1767亚型特异性抗原表位，以及1766和1767 亚型共同抗原表位的单克隆抗体，其次需制备羊抗小鼠IgG多克隆抗体，分别用于制备PCV2 抗原亚型鉴定试纸卡的金标玻璃棉，PCV检测印迹T3， 1767亚型检测印迹T1， 1766和1767 亚型检测印迹T2，以及对照印迹C。
实施例l PCV2衣壳蛋白重组蛋白的制备
用基因工程技术高效表达PCV2衣壳蛋白，制备衣壳蛋白重组蛋白。根据i^PCV2分离 株HZ0201(GenBankNo.AY188355)全基因序列，分别设计PCV2衣壳蛋白特异性引物，上游 引物为pGl: 5，-GCGGATCCAATGGCATCTTCAACAC-3，，含5awHI酶切位点，下游引物pG2: 5，-CCGCTCGAGTTAAGGGTTAAGTGGG-3，，含JWioI酶切位点。以PCV2病毒DNA为模板， 扩增579bp的去核定位信号衣壳蛋白基因，反应条件为95'C预变性5min后，按95'C 30s， 58或61。C 30s， 72。C 45s进行30个循环，最后72。C再延伸10min。 PCR产物经5awHI和 Wol双酶切，分别连接到原核表达载体pGEX-4T-l的谷胱甘肽-S-转移酶基因(GST)下游 加mHI和J^oI位点间，转化五.co/ZToplO感受态细胞，涂布于含lOOpg/mL氨苄青霉素(Amp) 的LB平板，37。C培养16h，挑取单克隆菌落，碱裂解法抽提重组质粒，以PCR和双酶切鉴 定阳性克隆,经序列测定验证鉴定。经PCR和酶切鉴定，构建重组表达质粒pGEX-PCV2-dCap， PCV2衣壳蛋白在N端与GST融合。将重组表达质粒pGEX-PCV2-dCap转化表达菌五.co// ￡.co//BL21，挑选单克隆接入5mL含10(Hig/mLAmp的LB培养基中，37'C、 250r/min振荡 培养10h，然后按1:100转接500mL 2xYTA(100ng/mL Amp)的培养基，37°C、 250r/min振荡 培养3h至AsoQ为0.6-0.8时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG在37。C诱导表达4h， 4°C 4000r/min离心10min收集诱导表达菌体。
采用GSTrap FF亲和层析柱(Amersham公司)在天然条件下纯化PCV2 GST-dCap蛋白， 主要步骤为按每毫升培养菌液加入50piL 4。C预冷的Binding buffer(140 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/LKCl， 10 mmol/LNa2HP04， 1.8 mmol/LKH2P04， pH 7.3)将收集的细菌沉淀重新悬浮， 超声波裂解破碎(0.2-0.3kw， 120次)直至菌液呈均一、半透明状或云雾状消失；加入终浓度为1%的Triton X-100，冰上振荡混匀30min， 4°C、 12000rpm离心30 min，取上清液进一步用 0.45 pm滤器过滤。取上清过用Binding buffer预平衡的GSTrap FF纯化柱，流速为 0.5mL/min(中间不能引入气泡)。用20-30倍柱床体积Binding buffer洗涤柱子(流速为1 mL/min)，用10倍柱床体积的Elution buffer(50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L reduced glutathione, pH 8.0)洗脱(流速为1 mL/min)，或者用80U凝血酶(Thrombin)柱上酶解PCV2 GST-dCap融合蛋白，纯化重组的dCap蛋白，用eppendorf管收集洗脱液，每管l.OmL，取样 作SDS-PAGE分析，并用Bradford法测蛋白含量，计算表达量。结果显示，含pGEX-PCV2-dCap 重组质粒的表达菌成功表达分子量为48kDa的GST-dCap融合蛋白，其表达量为6.14 mg/L培 养物，可用于制备PCV2抗衣壳蛋白单克隆抗体。
实施例2抗PCV2衣壳蛋白单克隆抗体的制备与筛选
分别将重组PCV2衣壳蛋白和纯化PCV2病毒与弗氏佐剂等量混合，充分乳化，以 50吗-100ng/只免疫BALB/c系小鼠3次，每次间隔15-30天；第3次加强免疫后3-4天，将 免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75%酒精浸泡5-10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100 目尼龙网过滤，1000r/min离心10min,收集脾细胞；将1 X 108的脾细胞与2-5 X 107的SP2/0 骨髓瘤细胞混合，1000r/min离心10min，弃上清，在37。C的水浴中将0.7-lml的40%-50% PEG 4000 (pH8.5-9.0)缓缓加入细胞，温育lmin后，缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG 的作用，37。C水浴5-10min， 1000r/min离心10min，弃上清，将细胞重悬于HAT选择培养基 中，并加入96孔培养板(100pL-20(^L/孔)，置37'C 5%(:02培养箱中培养。培养7-10天后， 分别用5pg-10ng/ml的PCV1和PCV2衣壳蛋白重组蛋白包被96孔酶标板，以ELISA检测 杂交瘤的培养上清，挑取强阳性细胞克隆(00492=0.8以上)，经连续3次的有限稀释法克隆化， 建立杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞腹腔注射经降植烷致敏一周的BALB/c系小鼠，每只小鼠 注射5xl()S个细胞，诱生小鼠腹水，制备抗PCV2衣壳蛋白单克隆抗体。所建立的14株杂交 瘤细胞株染色体数为92-98，其分泌的单克隆抗体特异识别PCV2衣壳蛋白，与GST及其它 菌体蛋白不发生交叉反应，亲和力常数达1(T9，轻链亚型为K或X，重链亚型为IgGl， IgG2a， IgG2b或IgG3。
实施例3抗PCV2衣壳蛋白单克隆抗体的筛选
以间接免疫荧光(IFA)对所制备的14株抗衣壳蛋白单克隆抗体进行筛选和鉴定。分别将 PCV1分离株，1768PCV2分离株，1767PCV2分离株和1766PCV2分离株按1:10接种胰酶消化的 无PCV污染的PK-15细胞，将病毒细胞混合液加入96孔细胞培养板，每孔100 nL， 37°C 5% C02培养96h，加入1:1混合的甲醇丙酮固定液100 nL， -20°。固定20min。将固定液弃去， 自然干燥。用5%的脱脂奶粉封闭lh，每孔加入待检杂交瘤细胞上清100 nL， 37'C孵育lh， PBST洗涤5次，加入1:400稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG 50 |xL， 37。C孵育40min， PBST 洗涤5次。加入50pLPBS,用倒置荧光显微镜观察阳性细胞，筛选识别不同PCV基因型和 抗原亚型的单克隆抗体。经IFA检测和筛选，单克隆抗体3F6均能识别感染PK-15细胞的PCV1， 1768PCV2, "67PCV2和"66PCV2病毒粒子，为识别PCV共同抗原表位的单克隆抗体 mAbl，单克隆抗体8A12仅特异性识别感染PK-15细胞的1767PCV2病毒粒子，而不与其他三 株病毒感染细胞反应，为特异识别^WpCV2亚型单克隆抗体mAb2，单克隆抗体6H9识别感 染PK-15细胞的1767PCV2和1766PCV2病毒粒子，但不与1768PCV2和PCV1感染细胞反应， 为识别1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的单克隆抗体mAb3，单克隆抗体1B9识别感染 PK-15细胞的1768PCV2， "67PCV2和i766pCV2病毒粒子，而不与PCV1感染细胞反应，为识 别PCV2共同抗原表位的单克隆抗体mAb4，上述识别PCV共同抗原表位，1767PCV2亚型特 异性，1766PCV2和1767PCV2亚型特异性，以及PCV2特异性抗衣壳蛋白单克隆抗体分别用于 制备PCV2抗原亚型鉴定试纸卡的金标玻璃棉，检测印迹T1，检测印迹T2和检测印迹T3的 印制。
实施例4抗PCV2衣壳蛋白单克隆抗体识别抗原表位的鉴定
以合成多肽分析鉴定抗衣壳蛋白单克隆抗体识别的抗原表位。根据PCV2 HZ0201衣壳 蛋白的氨基酸序列，设计由18肽组成的氨基酸重叠多肽片段，每条肽之间重叠8个氨基酸， 移位10个氨基酸(aa)，跨越PCV2衣壳蛋白氨基酸位25-233(未包含核定位信号NLS中的前 24个氨基酸)，共计20条肽，于每条肽N端加一半胱氨酸Cys，用于载体蛋白偶联，所设计 多肽由上海波泰生物技术有限公司合成，每条合成多肽10mg，纯度大于90%，冻干保存。
用无菌的蒸馏水或去离子水、无氧水溶解冻干多肽，浓度为lmg/mL，应用异型双功能 试剂Sulfo-SMCC(分子量436.37，美国Pierce公司产品)通过多肽N端Cys上的-SH基团与载 体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联，步骤为1)称量4mgBSA，溶于500pl偶联缓冲液(O.l M phosphate, 0.15MNaCl， lmMEDTA, pH7.2); 2)加入lmg Sulfo-SMCC于载体蛋白溶液； 3)RT孵育60min或37'C孵育30min，并不时混匀；4)对偶联缓冲液充分透析，以除去多余 的偶联剂，用偶联缓冲液调整蛋白浓度为5mg/ml; 5)取20pL(100吗)Sulfo-SMCC活化的载 体蛋白，加入N末端含Cys的溶解多肽100吗，充分混匀，于4t:孵育4h或过夜，完成偶联 反应，4'C保存备用。
采用Peptide-ELISA分析抗衣壳蛋白单克隆抗体识别的抗原表位。以50mM Tris-HCl缓冲 液(pH8.6)作包被液稀释BSA偶联多肽至lng/mL，包被96孔酶标板，每孔100^1， 4'C孵育 过夜，PBST洗涤3次；用5X的脱脂奶PBS封闭酶标板，20(HiL/孔，37。C封闭3h， PBST洗 涤3次；加入用5%的脱脂奶1:500-1000稀释的抗衣壳蛋白单克隆抗体，100^iL/孔，重复3 个孔，37。C孵育1.5h， PBST洗涤6次;加入1:10000稀释的HRP羊抗鼠IgG， 100^0/孔，37 r孵育lh， PBST洗涤6次；加入TMB显色溶液100nL，室温孵育10min，观察显色结果， 每孔加入5(^1 2M硫酸溶液终止反应，在酶标仪上读取450nm吸收值。对于Peptide-ELISA 阳性多肽，进一步设计合成系列截短多肽，偶联于载体蛋白BSA，同上以Peptide-ELISA分 析截短多肽与相应单克隆抗体的反应性，精确定位所获得抗衣壳蛋白单克隆抗体识别的抗原 表位。合成多肽的抗原表位分析结果表明，单克隆抗体mAbl识别的PCV共同抗原表位为PCV2衣壳蛋白的156YHSRYFT162，单克隆抗体mAb2识别的1767PCV2亚型特异性抗原表位 为PCV2衣壳蛋白C末端^LKDPPLNP^，是w》CV2新的血清学标志，单克隆抗体mAb3 不能识别PCV2衣壳蛋白的任何一条合成多肽，表明该单克隆抗体识别的1766PCV2和 1767PCV2共同抗原表位为构象型抗原表位，单克隆抗体mAb4识别的PCV2共同抗原表位为 PCV2 Cap蛋白的195HVGLGTAF2()2。
实施例5抗小鼠IgG多克隆抗体的制备
采取小鼠血液，分离血清，以辛酸-硫酸铵法粗提小鼠血清IgG，并用Superdex200凝胶 层析进行纯化。首先用4倍血清体积的0.06 M pH4.8醋酸缓冲液稀释血清，以1 M NaOH调 pH至4.5;在室温下边搅拌边逐滴加入辛酸，每毫升血清加入25 辛酸，4'C静置2h， 12000 r/min离心30 min，取上清；在溶液中加10倍体积磷酸盐缓冲液PBS，用5 M NaOH调pH 至7.4，冰浴至4"C;按每毫升混合液加0.277 g硫酸铵并搅拌30 min， 4'C静置4h， 12000 r/min 离心30 min，弃上清；沉淀以0.05 M PBS pH7.4重悬于，透析除盐，直至用BaCl2检测无 白色沉淀为止，用PEG8000进行浓縮。利用GE公司AKAT purifier蛋白纯化系统以Hiload 16/60 Superdex 200 prep pg凝胶过滤预装柱纯化粗提的小鼠IgG。用0.22pm滤器过滤粗提的 小鼠血清IgG溶液，并经超声波除气；将Hiload 16/60 Superdex 200 prep pg凝胶过滤预装柱 与AKAT purifier蛋白纯化系统相连接，先用ddH20清洗柱子，接着用含0.15MNaCl的0.05M 磷酸盐缓冲液(PBS, pH8.0)平衡柱子，流速为2 mL/min，直至UV280的吸光值和电导值基线 稳定，平衡柱子时要清洗各阀位。将过滤的猪血清IgG样品用注射器(上样前注意排空注射器 里的气泡，以免损害柱子)注入样品环中，设置洗脱速度和报警压，进行上样和洗脱，流速为 lmL/min。观察UV280值基线的变化，收集紫外吸收峰的洗脱峰，每管收集2mL， SDS-PAGE 电泳检测脱蛋白，合并收集液，装入透析袋，放入PEG8000中浓縮，用Nanodrop 1000分光 光度仪测OD280和OD260吸光值，并根据公式计算IgG含量蛋白含量 (mg/mL)-(1.45xOD28o-0.74xOD26o)x稀释倍数，测得小鼠IgG的蛋白含量为12.0mg/mL，用于 羊抗小鼠IgG多克隆抗体的制备。
以50~10(Hig/kg体重的小鼠IgG蛋白加弗氏佐剂充分乳化，经皮下和肌肉注射免疫健康 山羊3 4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000以上时， 心脏采血或颈动脉放血，收集高免血清；以辛酸-硫酸铵法粗提免疫山羊血清IgG，并用 Superdex 200凝胶层析进行纯化，不重述。所制备的抗小鼠IgG多克隆抗体用于PCV2抗原 亚型鉴定试纸卡对照印迹的印制。
实施例6金标玻璃棉的制备
以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在沸腾的50-100ml 0.01-0.05%氯金酸水溶液中加入 2-4ml的0.5-2%拧檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以O.lmol/L &(:03调胶体 金pH至8.5-9,5，以1:1000-1:1300的标记比将待标记的单克隆抗体mAbl加入pH8.5-9.5金溶胶中，标记10min后，加20% PEG 10000至终浓度0.05%, 4。C 1500-3000g离心20min， 除去未结合的金颗粒，4°C 15000g离心lh，弃上清，获初步纯化金标蛋白混合物后，用丙烯 葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得胶体金标记的抗PCV2衣壳蛋白单克隆抗体。 将1:100-1:1500稀释的胶体金标记蛋白吸附于精制玻璃棉中，4'C低温真空干燥，制备PCV2 抗原亚型鉴定试纸卡的金标玻璃棉。
实施例7 PCV2抗原亚型鉴定试纸卡的实施结构
PCV2抗原亚型鉴定试纸卡的实施结构参见图1，图中，1为支撑层用不吸水薄片条，实 施中可采用塑胶薄片条或采用不吸水的硬质纸片材，反应试剂载体吸附层由2， 3， 4， 5，组 合而成，从样品端12开始，到手柄端13依次粘贴在支撑层1上面；其中2为样品端纤维层， 实施中可使用玻璃纤维棉简称玻璃棉，3为吸附金标蛋白的纤维层，金标蛋白为胶体金标记 的识别PCV共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAbl，可采用精制玻璃纤维棉，简称为 金标玻璃棉，4为纤维素膜层，实施中可采用硝酸纤维素膜，5为手柄端吸水材料层，采用 吸水纸，如滤纸或其它吸水纸均可，2， 3， 4， 5各层彼此之间交界处纤维互相交叉渗透；PCV2 抗原亚型鉴定试纸卡的6为识别1767PCV2亚型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体 mAb2溶液在纤维素膜上印制的1767亚型检测印迹Tl" I "，7为用识别1766PCV2和1767PCV2 共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb3溶液印制的1766和1767亚型检测印迹T2" I "， 8为用识别PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb4溶液印制的PCV2检测印迹 T3 " I "， 9为用抗小鼠IgG多克隆抗体pAb溶液印制的对照印迹C " I "，在纤维素膜上的 检测印迹T1，检测印迹T2，检测印迹T3和对照印迹C组合排列为"I 111"， 10为样品 溶液的加样孔，ll为塑料卡，12为样品端，13为手柄端。
实施例8 PCV2抗原亚型鉴定试纸卡实施检测的反应原理
PCV2抗原亚型鉴定试纸卡检测的反应原理为待检测样品溶液加入样品孔后，待检溶 液通过虹吸带动待检抗原与金标蛋白一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗透到滤纸层中，在 扩散过程中PCV2病毒抗原与胶体金标记的识别PCV共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体 mAbl相结合，形成金标蛋白-抗原复合物，"WPCV2形成的复合物与检测印迹T1中的识别 nWpCV2亚型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb2相结合，生成红棕色"| "标
记，同时也分别与检测印迹T2中的识别，PCV2和，PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单 克隆抗体mAb3，以及检测印迹T3中的识别PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体 mAb4相结合，生成另两条红棕色"I I "标记，部分未与抗原结合的金标蛋白不能与检测 印迹结合而继续扩散，在纤维膜上与对照印迹C中的抗小鼠IgG多克隆抗体pAb相结合，生 成红棕色标记"I "，四种标记组合叠加，形成四条红棕色阳性标记"I I I 1"，代表样品 为1767亚型PCV2病毒阳性；同理，i^PCV2形成的金标蛋白-抗原复合物不能与检测印迹 Tl中的识别1767PCV2亚型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb2识别，不能形成红 棕色标记，复合物继续扩散与检测印迹T2中的识别1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb3，以及检测印迹T3中的识别PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单 克隆抗体mAb4相结合，生成两条红棕色"I I"标记，部分未与抗原结合的金标蛋白不能 与检测印迹结合而继续扩散，在纤维膜上与对照印迹C中的抗小鼠IgG多克隆抗体pAb结合， 生成红棕色标记"I "，从而形成三条红棕色阳性标记"111"，代表样品为1766亚型PCV2 病毒阳性；i^PCV2形成的金标蛋白-抗原复合物不能被检测印迹Tl中的识别w》CV2亚型 特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb2，以及检测印迹T2中的识别1766PCV2和 ^PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb3所识别，但能与检测印迹T3中的识别 PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体mAb4相结合，生成一条红棕色"I "标记， 部分未与抗原结合的金标蛋白不能与检测印迹结合而继续扩散，在纤维膜上与对照印迹C中 的抗小鼠IgG多克隆抗体pAb结合，生成红棕色标记"I "，从而形成两条红棕色阳性标记 "I 1"，代表样品为1768亚型PCV2病毒阳性，相反，如果样品溶液中不含PCV2病毒， 则没有金标蛋白-抗原复合物形成，不能与检测印迹T1， T2或T3结合，只有金标蛋白与对 照印迹C相结合，生成一条红棕色标记"I "，代表样品为PCV2病毒阴性。如果纤维素膜上 没有红棕色标记显现，则表明检测失败或试纸卡失效。
实施例9 PCV2抗原亚型鉴定试纸卡检测的实例操作方法
采集待检猪淋巴结或脾脏，以样品稀释液或生理盐水1:5倍稀释，充分研磨，制备样品 溶液。取50pL样品溶液分别加入PCV1和PCV2鉴别检测和PCV2亚型鉴定检测试纸卡，水 平放置约2-5分钟，检测结果见图2。 PCV2抗原亚型鉴定试纸卡的显现一条红棕色标记"I " 为PCV2阴性，显现两条红棕色标记"I I"为1768亚型PCV2阳性，显现三条红棕色标记 "I I I"为1766亚型PCV2阳性，显现四条红棕色标记"I I I I "为1767亚型PCV2 阳性，如果PCV2抗原亚型鉴定试纸卡没有标记显示，则表明检测失败或试纸卡失效。序列表
<110>浙江大学
<120>猪圆环病毒PCV2亚型鉴定试纸卡
<160>2
<210> 1
<211>25
〈212〉DNA
<213〉人工序列
<223>PCV2上游引物pGl
〈400〉1
GCGGATCCAA TGGCATCTTC AACAC
<210>2
〈211>25
〈212>DNA
<213〉人工序列
〈223〉 PCV2下游引物pG2
〈400>2
CCGCTCGAGT TAAGGGTTAA GTGGG
权利要求
1. PCV2抗原亚型鉴定试纸卡，包括用不吸水薄片条制成的支撑层(1)，反应试剂载体吸附层固定在支撑层(1)上，从样品端(12)到手柄端(13)的反应试剂载体吸附层依次为纤维层(2)，金标纤维层(3)，纤维素膜层(4)和吸水材料层(5)，试纸卡固定在塑料卡(11)内，其特征在于金标纤维层(3)为吸附胶体金标记的识别PCV共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体的金标玻璃棉，纤维素膜层(4)为从样品端(12)至手柄端(13)依次印制检测印迹T1(6)、检测印迹T2(7)、检测印迹T3(8)和对照印迹C(9)的硝酸纤维素膜，在样品端(12)设有加样孔(10)。
2. 如权利要求1所述PCV2抗原亚型鉴定试纸卡，其特征在于检测印迹Tl(6)为 以识别nWpCV2亚型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液在纤维素膜上印制的 1767亚型条状检测印迹，检测印迹T2(7)为以识别""PCV2和，PCV2共同抗原表位的 抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液印制条状检测印迹，检测印迹T3(8)为以识别PCV2共同抗原 表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液印制条状检测印迹，对照印迹C(8)为以抗小鼠IgG多 克隆抗体溶液印制的条状对照印迹，上述4条印迹按序平行排列。
全文摘要
PCV2抗原亚型鉴定试纸卡适用于猪PCV2亚型鉴定。其反应试剂载体吸附层包括纤维层，金标纤维层，纤维素膜层和吸水材料层；金标纤维层为吸附胶体金标记的识别PCV共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体的金标玻璃棉，纤维素膜层上印制检测印迹T1、T2、T3和对照印迹C；检测印迹T1为识别¹⁷⁶⁷PCV2亚型特异性抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液印制的印迹，检测印迹T2为识别¹⁷⁶⁶PCV2和¹⁷⁶⁷PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液印制的印迹，检测印迹T3为识别PCV2共同抗原表位的抗衣壳蛋白单克隆抗体溶液印制的印迹，对照印迹C为抗小鼠IgG多克隆抗体溶液印制的印迹。试纸卡特异性强，敏感性高，检测结果直观，易于推广应用。
文档编号G01N33/577GK101413950SQ20081016244
公开日2009年4月22日 申请日期2008年11月13日 优先权日2008年11月13日
发明者周继勇, 金玉兰, 焰 颜 申请人:浙江大学