专利名称：一种新的人细胞生长抑制基因thap11及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的人细胞生长调控基因，还涉及组成该基因的DNA及该DNA编
码的蛋白质和在肿瘤、神经退行性疾病诊断、治疗中的应用。
发明背景 细胞生长受到多种基因的复杂调控。c-Myc作为原癌基因，在调节细胞增殖、生 长、分化和凋亡的信号调控网络中占据重要地位。多个基因研究报道可通过下调c-Myc引 发细胞生长阻滞(Roussel et al. ， 1991 ;He et al. ， 1998)。作为最重要的转录因子之 一，c-Myc广泛表达于胚胎发育的各个时期以及有高度增殖能力的组织当中。细胞静息期 c-Myc的表达水平很低，在生长因子作用下，c-Myc蛋白迅速合成，并通过其C端的bHLHZ (ba sic-helix-loop-helix-zipper)结构域与MAX形成异源二聚体，募集具有组蛋白乙酰化酶 (HAT)功會鹏转录共激活物-TRRAP (transformation/transcription domain-associated protein)，将核小体组蛋白乙酰化，从而改变染色体结构，使c-Myc-MAX复合物能够结合在 靶基因的特异调控序列一 E-box(CACGTG)上(McMahon et al. ， 1998 ;Bouchard et al.， 2001)，激活或抑制一系列相关基因的转录，诱导细胞进入G1期开始增殖(Pelengaris et al. ， 2002)。研究发现，人类基因组中存在有25， 000个c-Myc的结合位点。可以推测，c-Myc 参与调节整个有机体的相当大一部分基因，它能够激活elF4和elF2等一些是对生长很重 要的转录起始因子(Rose丽ald et al. ， 1993);还会激活一系列与代谢相关的基因的转录， 从而影响DNA、蛋白合成，最终促进细胞生长；而更多受到关注的被c-myc调节的基因是与 细胞周期运行关系密切的调控因子。c-Myc可激活周期素D(CyclinD)，周期素依赖激酶 K2(CyclinD-D印endent Kinase,CDK2)等的蛋白表达，促进细胞越过限制点，进入细胞周期 运转，开始分裂(Steiner et al. ， 1995 ;Berns etal. ， 1997) ;c-myc同时也可以抑制相关因 子如CDK的抑制因子P21(Seoane et al. ， 2002) ， P27 (Obaya et al. ， 2002)等的表达，通过 消除细胞周期运行的阻力而加快周期运转，促进增殖。此外，也有报道，c-Myc参与细胞凋 亡调控。 c-Myc调控了众多与细胞分裂、生长相关的基因的转录与活性，因此，C_Myc的异 常表达、失调、扩增等往往伴随多种肿瘤的发生发展。在 70%的癌症中可以发现与c-Myc 家族(c-myc，N-myc， and Liyc)直接扩增有关或与其调控因子失调而导致的c-Myc表达异 常有关。在不同组织如皮肤(Pelengaris et al. ， 1999)、胰腺(Pelengaris et al. ，2002)， 前列腺(Ellwood-Yen et al. ，2003)过表达c_Myc的转基因小鼠，都可以产生生致死性的 恶性肿瘤。因此，有效的抑制c-Myc及其下游基因的活性常被作为体内治疗这些肿瘤的策 略。大量实验已证明抑制c-Myc表达，可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。而那些能够抑制 c-Myc发挥转录活性的基因也备受关注，它们表达后能抑制细胞过度生长、增殖；相反，丢 失或失活很有可能引起c-Myc的表达失控最终导致肿瘤发生，因此这些基因往往是抑癌候 选基因。如多功能锌指转录因子CTCF定位在染色体16q22_23，它广泛表达，通过抑制c_Myc 抑制细胞生长而被列入抑癌基因。 THAP(Thanatos-associated protein)蛋白家族是新发现的一类功能蛋白，因其各成员蛋白质的N端含有进化上高度保守的THAP结构域而命名(Roussigne et al.， 2003)。该结构域与果蝇P元件转座酶的DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD)高度 同源，主要特征为内部的C2CH(Cys-Xaa2—4-CyS-Xaa35—5。-CyS-Xaa2-HiS)锌指模序以及位于 结构域C端的AVPTIF盒。有研究报道认为，THAP家族蛋白起源于果蝇P元件，是蛋白质在 漫长的进化过程中获得了P转座元件DBD结构域(Quesneville et al. ，2005)的结果。因 此，THAP蛋白具有同P元件转座酶类似的分布范围，仅限于动物当中存在。其各成员之间 的染色体定位无明显相关性，散在分布于全基因组中。 对于THAP蛋白家族功能了解比较少，很多线索都来自于模式生物中THAP家族同 源物的研究。果蝇的THAP蛋白之一-DIP2 (Dorsal interacting protein)是果蝇转录因子 NF-KB家族的一个成员(Bhaskar etal. ， 2000)。线虫的多THAP结构域蛋白-HIM-17 (Reddy et al. ，2004)，在减数分裂染色体分离的过程中扮演了重要角色。线虫中的LIN-36、 LIN15A、 LIN15-B也都属于THAP蛋白家族(Ferguson et al. ， 1989)。它们都可与重要的 肿瘤抑制基因LIN35/Rb相互作用，参与调节细胞生长。LIN-36还被证实具有FZR-1 (Fizzy related family-1)的功能，可从整体上调节线虫细胞增殖和个体发育(Fay et al.， 2002)。抑制LIN-36或LIN-15A的活性能使细胞即使在缺乏CyD_l/CDK_4的情况下仍然可 以进入S期，从而推测这两个蛋白是细胞G1/S期转换的抑制物(Boxem et al. ，2002)。
人的THAP蛋白家族包括12个成员(THAPO-THAPll)，目前有研究报道的仅限 于3个成员。THAPO最初是在研究IFN-y诱导HeLa细胞凋亡的相关基因时筛选出来 的，当时命名为死亡相关蛋白(Deathassociated protein-4， DAP4/p52rlPK) (Deiss et al. ， 1995)，后发现它可通过与p58IPK相互作用而解除该蛋白对PKR(interferon-induced serine/threonine protein kinase, PKR)的抑制，使PKR恢复激酶活性，磷酸化相关蛋 白，引起细胞蛋白合成受阻，细胞增殖受到抑制(Gale et al. ， 1998) 。 THAPl是一个新的 核内前凋亡因子，能与Par-4(prostate-apoptosis-response-4)相互作用并共同定位于 PML-NBs(promyelocytic leukemia薦lear bodies, PML NBs)中，参与血清撤除或TNF_ a 诱导的凋亡(Roussigne et al.，2002)。体夕卜SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment Assay)实验(Clouaire et al. ，2005)还发现THAPl可与特 定的DNA序列结合，证实THAP蛋白有DNA结合活性。对于THAP7的研究主要集中在它和转 录的关系上。THAP7多组织广泛表达，它可与组蛋白结合，促进组蛋白H3的去乙酰基化，同 时募集NcoR(Nuclearhormone receptor cor印ressor)禾口HDAC3 (histone deacetylase 3) 到靶基因的启动子上抑制基因转录(Macfarlanet al. ，2005)。最近，又有研究表明THAP7 抑制转录还存在另外的机制它能募集INHAT (Inhibitor ofacetyltrans-ferases)亚基 TAF-IP ((template activating factor-IP)到基因的启动子上，通过直接封闭组蛋白的 乙酰化而抑制转录(Macfarlan et al. ，2006)。综上所述，THAP蛋白家族是一类锌离子依 赖的序列特异性DNA结合蛋白，可能通过影响细胞周期、染色体修饰、基因转录等过程，广 泛地参与细胞增殖、凋亡等多种生命活动的调控。 THAPll是本发明从人骨髓cDNA文库中筛选获得的新基因。它是人THAP蛋白家 族的最后一个成员，染色体定位在16q22. 1。 THAPllmRNA全长1903bp (Genebank注册号为 BC012182)，含有一个945bp的开放阅读框(序列1)，编码314个氨基酸组成的蛋白质(序 列2)，其主要特征除了含有N端定位的THAP结构域外，分子中部还有一段28个谷氨酰胺串
4联重复排列的polyQ片段和一个生物信息学预测的核定位信号。对THAPll的功能，至今尚 未见任何研究报道。
发明内容
本发明检测了 THAP11的组织和细胞表达谱，显示它分布广泛，无明显的组织特异 性(
图1) 。 GFP-THAP11融合蛋白技术表明THAP11定位在细胞核(图2)。用肿瘤多组织 cDNA微阵列芯片检测发现，THAP11在多种肿瘤组织表达明显低于相应的癌旁组织，在癌细 胞系中THAP11的内源性表达水平也很低(图3)。此外，利用Real-time PCR检测了 12例 肝癌病人中THAP11的表达情况，表明在9例病人中THAP11在肝癌组织中表达水平明细高 于癌旁组织(图4)。由此，我们推测THAP11可能参与细胞增殖调控。利用构建的可诱导 表达THAP11的HEK293稳定细胞株(图5)，我们研究了 THAP11对细胞行为的影响，发现诱 导THAP11表达，可明显抑制HEK293细胞增殖(图6)。此外，在7721、 HeLa、 MCF-7细胞中 过表达THAP11也能引起集落形成能力明显下降(图7)。上述结果说明，THAPll是生长抑 制基因。 为研究THAP11抑制细胞增殖的机制，本检测了多种与细胞生长、分裂相关的基因 在THAP11诱导前后变化状况，发现随着THAP11的表达，c-myc蛋白水平逐渐下调(图8)。 荧光素酶报告基因实验证实，THAPll能够负调控c-myc启动子的转录活性(图9)。进一步 检测c-myc调控下游耙基因，发现0DC、Nucleolin等与细胞代谢、DNA合成过程相关的基因 表达明显下调(图10)，说明THAP11通过抑制c-myc转录改变了此类基因的表达，引起细胞 生长阻滞。为评价c-myc在THAP11发挥生物学功能中所起的作用，我们在表达THAP11的 同时过表达c-myc，被抑制的细胞集落形成能力得到明显恢复，表明c-myc下调是THAP11负 调控细胞增殖的重要原因(图11)。 THAP11定位于染色体区域16q22. 1，该区域定位了多个肿瘤抑制基因，在多种肿 瘤细胞中发生杂合缺失，被普遍认为是多种肿瘤发生发展过程中的易感区域。结合THAPll 抑制c-myc转录以及在肿瘤组织中表达下调的现象，本发明专利者得出结论，该基因可能 是一种新的肿瘤抑制基因。 THAP11在其104-132位有一段多聚谷氨酰胺区域，并可抑制细胞增殖、促进细胞 凋亡，还可抑制转录因子CREB活性(图12)，因此，可能是神经退行性疾病的获选致病基因， 可用于该类基因的诊断和治疗。 本发明提供了一种构成人基因的DNA，具有序列1所述核苷酸序列或有一个或多 个碱基缺失、取代或增加的核苷酸序列。 本发明提供了一种蛋白质，它具有序列2所示氨基酸序列或相对于所述氨基酸序 列有一个或多个氨基酸缺失、替代或增加的氨基酸序列。 本发明提供了一种探针，它包含与组成前述核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA。
本发明提供了一种蛋白抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体，可特异针对前述蛋 白质的表达进行检测。 本发明提供了一种病毒重组载体，表达组成前述一种核苷酸序列组成的DNA。
本发明提供了一种DNA片段，该片段可用作引物，并由前述一种核苷酸序列的部 分序列组成。
本发明提供了一种人用诊断制剂，它包括前述探针及前述蛋白质的抗体。可用于 肝癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、白血病、肾癌、神经系统肿瘤等恶性肿瘤中基因表达的检查。 本发明还提供了含有前述蛋白的抗肿瘤药物制剂，包括表达前述氨基酸序列的 DNA. 因此，构成本发明基因的DNA，它们的转录物mRNA及其翻译的蛋白质可用作多种
肿瘤的治疗、诊断和预防用药。 结合附图更好地说明本发明 图1THAP11的组织表达谱。结果显示，在8种成年人组织中，以管家基因G3PDH为
内参，心、脑、骨骼肌中有较高水平的THAP11表达，其余组织均有低水平表达。 图2THAP11定位于细胞核。pTHAPll-GFP及突变核定位信号的pmTHAPll-GFP转染
C0S7细胞，荧光显微镜下观察荧光信号分布情况。结果显示THAP11定位于细胞核，而将核
定位信号突变后定位发生变化，成为全细胞分布。 图3利用肿瘤组织芯片检测THAP11的表达。通过杂交方法检测THAP11在19种 癌症及相应癌旁组织及9种肿瘤细胞株的表达情况。 图4Real-time PCR检测THAP11在肝癌组织及癌旁组织中的表达。结果显示，在 所检测的大部分病人中THAPil在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织。
图5THAP11可诱导表达细胞株的建立。(A) THAPll-pIND转染293-ECR细胞中后选 取不同单克隆，在5iiM PonA诱导条件下培养48小时。提取细胞总蛋白，利用THAP11抗体 进行Western鉴定THAP11表达情况。(B) 3号克隆不同剂量PonA诱导48小时(左)或经 5iiM PonA for诱导不同时间(右)，提取细胞总蛋白，利用THAP11抗体进行Western鉴定 THAP11表达情况。P-actin作为参照。 图6THAP11可抑制HEK293细胞的增殖。(A)293EcR(上)及293-THAP11细胞(下) 接种24孔板，在PonA存在下培养，每天计数细胞。结果显示，THAPll的诱导表达可抑制细 胞的增殖，并具有剂量效应关系。(B) [3H]掺入DNA合成实验检测THAP11对细胞DNA合成 的影响。细胞处理同(A)。 图7集落形成实验表明THAP11可抑制7721， HELA， MCF-7细胞的增殖。不同肿瘤 细胞转染pcDNA-THAPll或pcDNA3. 1空载体。12小时后接种6孔板，培养2周，检测细胞集落数。 图8THAP11可降低c-Myc的表达。293-THAP11细胞在PonA存在(右)或不存在 (左)条件下培养不同时间，提取细胞总蛋白，Western检测THAPll的表达情况。P-actin 作为参照。 图9THAP11抑制c-Myc的启动子活性。(A) 293-THAP11细胞接种24孔板，转染 c-Myc启动子报告基因载体。PonA诱导后24小时，收取细胞，检测荧光素酶活性。表达海 参荧光素酶的pRL-TK载体作为内参，标定转染效率。(B)在不同肿瘤细胞中共转c-Myc启 动子报告基因载体和pcDNA3. l-THAPll载体或pcDNA3. l空载体，24小时后检测荧光素酶活 性。无论在293细胞中还是在肿瘤细胞中THAP11的表达均抑制了 c-Myc启动子的活性。
图10THAP11降低c-Myc耙基因的表达。RT-PCR检测THAP11表达后c-Myc下游 靶基因的变化情况。结果显示，THAPll的表达可抑制ODC，hTERT及Nucleolin的表达。对CyclinA无影响。G3PDH作为内参。 图11回转c-Myc可缓解THAP11的增殖抑制作用。pIRES， pIRES-THAPl 1及 pIRES-Myc-THAPll分别转染不同肿瘤细胞，2周后检测细胞的集落形成数目。结果显示， c-Myc的回转可缓解THAP11导致的细胞增殖抑制作用。 图12THAP11对CREB活性具有抑制作用。293-THAP11细胞转染Gal4-CREB， Gal4-luci及pFC-PKA质粒，后经PonA诱导。24小时后收取细胞，检测荧光素酶活性。表 达海参荧光素酶的pRL-TK载体作为内参，标定转染效率。结果显示，THAPll的表达可抑制 PKA对CREB的转录激活作用，表明THAP11参与了 CREB的转录调节过程。
实施例1人THAP1 lcDNA的获得 以EDAG基因为诱饵，利用本领域通用的酵母双杂交技术研究其相互作用蛋白，获 得一段DNA序列，采用该DNA序列作BLAST检索，本发明发现与推测的人类基因THAPll具有 较高的同源性。提出人骨髓细胞总RNA，按反转录试剂盒(Promega公司)说明书进行反转 录。取IP g定量后的RNA，加水补至10. 5iil，70。C、10min，加入2iU的10Xbuffer、2 WMgCl2、2ii 1的d證、lii 1的oligo dT、lii 1的rRNasin、 1. 5 ii 1的AMV(15U)，反应体系 共20 ii 1 ;42。C、lh ;94。C、5min ;4。C、5min。 RNA即反转录为cDNA。以5，-GGGGTACCATGCCTG GCTTTACGTGCTGCG-3' ;5' -CGGAATTCCACATTCCGTGCTTC TTGCGGATG-3'为引物PCR扩增目的 片段。PCR条件为
Cycle 1 (lx)
94°C 5min
Cycle 2(30x)
94°C lmin
55°C 30s
72 °C lmin
Cycle 3(lx)
72°C lOmin PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，结果产生特异的DNA条带，将该DNA片段与 PMD-18-T载体(TAKARA生物公司)连接，连接产物转化E. coli JM109,菌落PCR鉴定为阳 性克隆后，再经酶切鉴定后测序。测序后的序列为序列l所示。由于DNA序列确认它的真 实性，因此，用下述方法可产生特异性杂交探针使携带质粒的大肠杆菌菌株生长，纯化质 粒DNA，用适当的限制性酶对其进行消化，电泳分离DNA片段。 生物信息学分析显示，THAP11蛋白质内部有两个明确的结构域位于蛋白分子N 端90个氨基酸残基组成的THAP结构域和位于分子中部28或29个谷氨酰胺残基串联重 复而成的PolyQ片段；另外，还有一个预测的核定位信号(Nuclear location sequence, NLS)。同源比对显示，人THAPll与小鼠THAP11 cDNA序列同源性高达86. 73%，与大鼠的 则为88. 11X，除了个别位点核苷酸差异外，其主要不同在于编码PolyQ片段中谷氨酰胺的 (CAG)重复次数有所差别，小鼠与大鼠PolyQ的重复数目分别为18和24。
实施例2THAP11在多种组织中表达 以5 '-GGGGTACCATGCCTGGCTTTACGTGCTGCG-3，；5 '-CGGAATTCCACATTCCGTGCTTCTTG CGGATG-3，为引物，采用PCR技术，以8种成人组织cDNA为模板扩增THAPll，以G3PDH作为
7内参。结果显示，THAP11在检测的8种成人组织当中均有表达，在心脏和骨骼肌中的表达 水平较高(图1)。由此可见，THAP11在成人体内分布广泛，无明显特异性的组织分布。
实施例3THAP11定位于细胞核 为观察THAP11的亚细胞定位，我们将THAP11 cDNA构建到pEGFP载体的EcoRI/ Kpnl位点，组成THAP11-GFP融合基因表达载体。将该表达载体转染C0S7细胞，激光扫描共 聚焦显微镜检测显示荧光信号分布为细胞核(图2)，将THAP11分子内部预测的细胞核定位 信号突变后，细胞定位发生改变，成为全细胞分布，表明THAP11的核定位信号对其在细胞 核的定位是必需的。 实施例4THAP11在多种癌及相应癌旁组织的表达有明显差异
以5 '-GGGGTACCATGCCTGGCTTTACGTGCTGCG-3' ;5 '-CGGAATTCCACATTCCGTGCT TCTTGCGGATG-3，为引物，采用PCR技术扩增cDNA片断作为探针模板，a-"p标记后与 CancerProfiling ArrayII杂交，检测它在19种癌及相应癌旁组织以及9种肿瘤细胞系的 表达情况。所检测的154对cDNA来自于154个病人的癌及相应癌旁组织。杂交结果显示， THAP11在不同组织的肿瘤中表达情况有很大差异(图3)。在甲状腺(10/10)、皮肤(6/10)、 胰腺(4/7)、外阴(5/4)、睾丸(4/10)等癌组织中，THAP11表达受到抑制，显著低于相应的癌 旁组织；在小肠、子宫等肿瘤组织中有类似差别，但不明显；而在肺癌(7/10)、卵巢癌组织 (4/10)当中则相反，THAP11表达水平明显增多。以上结果表明THAP11虽然分布没有组织 特异性，但它的功能在不同的组织当中可能是不一样的。此外，在膜的右下方，排列了 9种 肿瘤细胞系的cDNA，除了肺癌细胞系A549外，THAP11与其它肿瘤细胞系的杂交信号普遍较 弱。 我们进一步检测了肝癌病人中THAP11的表达水平。通过常规方法提取来自12例 肝癌病人的肝癌及癌旁组织总RNA。经反转录获得第一链cDNA。以5'-AGAAGACGTGAAGCCCA TCGA-3' ;5' -TGGTGCCTGACGACAAGGAGTA-3'为引物，利用SYBRgreen试剂，进行Real-time PCR。 PCR条件
Cycle 1 Step 1 : Cycle 2 Step 1 : St印2 : Cycle 3 Step 1 : Cycle 4 Step 1 : Cycle 5 Step 1 :
(IX)
(40X)
(IX)
(IX)
(8IX)
95. 0°C
95. 0°C 65. 0°C
95. 0°C
55. 0°C
for 01:00.
for 00:10. for 00:30.
for 01:00.
for 01:00.
55. 0°C -95. 0°C for 00:10.
使用IQTM5 Multicolor Real-time PCR Detection System对报告荧光染料所发 射的荧光进行实时监测。荧光发射量反映循环数并由序列检测仪的软件读出，给出对PCR 扩增有意义的循环数阈值，循环数的值与基因组DNA对数呈线性关系。结果显示(图4) ， 12 例肝癌病人中有9例病人的肝癌组织中THAP11表达明显低于癌旁组织，表明THAP11在肝癌发生中表达下调。 实施例5可诱导表达THAPll稳定细胞株的建立 根据上述实验结果，THAPll在肿瘤组织中的内源性表达水平普遍偏低，提示该蛋 白可能对细胞增殖有负面效应。为避免由于THAPll表达后对细胞产生毒性作用而无法得 到组成性表达的稳定细胞株，我们选用了蜕皮激素诱导表达系统-293EcR细胞系。
293EcR细胞系由HEK293细胞衍生而来，可表达经过修饰的蜕皮激素受体因 子VpEcR(包含一个DNA结合区和一个VP16激活区)及其天然配体USP(ultraspirale protein)在哺乳动物中的同源物-RXR(retinoidX rec印tor)，在蜕皮激素(ecdysone)或 其类似物松甾酮(PonasteroneA)存在时，二者可迅速结合成异源二聚体VpEcR-RXR，激活 含有其效应因子(response element)的启动子，引导目的基因转录。由于哺乳动物本身无 蜕皮激素受体，所以该系统诱导反应的本底极低。 以5' -GGGGTACCATGCCTGGCTTTACGTGCTGCG-3'和5' -CGGAATTCCACATTCCGTGCTTCTT GCGGATG-3'为引物，经PCR技术，将扩增的THAPll CDNA片断克隆到pIND载体。重组载体 或pIND空载体转染293EcR细胞，经G418和Zeocin筛选后，有限稀释法挑取单克隆，扩大 培养。经过RT-PCR和Western鉴定，获得几株阳性细胞单克隆(图5A)，挑取其中的克隆 3，命名为293-THAPll。 为实现THAPll的可调控表达，我们分别检测了添加不同剂量诱导剂以及诱导不 同时间后，THAPll表达水平的变化。结果显示，诱导24小时条件下，随着Ponasteron A(Pon A)浓度的增加，THAPll表达量也明显升高，当诱导剂为5 iiM时，THAPll表达量达到最高。 在使用相同浓度诱导剂的条件下，THAPll的表达则随着诱导时间的延长而增加(图5B)。在 以后的实验中，我们可根据实验需要，通过调整诱导剂浓度或改变诱导时间实现THAPll的 可调控表达。 实施例6THAP11诱导表达抑制细胞增殖 2X 104293-THAP11细胞接种24孔培养板，采用不同浓度PonA诱导THAPll表达， 细胞计数法检测细胞的增殖状况。为排除诱导剂本身可能对细胞系增殖有影响，我们首先 观察加入PonA后，293EcR细胞系的生长曲线变化。结果显示，诱导剂对细胞生长无影响。 但与对照相比，从第3天起，293-THAP11细胞系细胞增殖开始减缓，随着THAPll表达时间 的延长，抑制越发明显，而且这种抑制效应随着诱导剂浓度的增加而增强，呈现剂量依赖性 (图6A)。说明THAPll表达可抑制细胞增殖。 采用[3H]掺入DNA合成实验检测THAPll对细胞DNA合成的影响。发现在 293-THAP11细胞中，THAP11诱导表达可明显抑制细胞DNA合成，随着诱导剂浓度的增加，抑 制效应逐渐增强，具有量效正相关(图6B);相反，我们没有检测到诱导剂本身对293EcR细 胞DNA合成的影响。 实施例7THAP11过表达能抑制肿瘤细胞的集落形成 为进一步确证THAPll在其它细胞系中是否抑制细胞生长，我们采用集落形成 实验分别检测了 THAPll对于7721、 HeLa和MCF-7细胞系增殖的影响。结果显示，转染 pcDNA-THAPll的MCF-7、HeLa以及7721细胞相对于转空载体的细胞，其集落形成能力被分 别抑制了 75%、80%以及60% (图7)。
实施例8THAP11表达伴随c_myc表达下调
为探询THAPll抑制细胞增殖的原因，我们检测了 THAPll诱导表达前后，与细胞增殖密切相关的一些转录因子的变化。可以看到，培养中的293-THAPll细胞本身有较高的c-myc表达，但伴随着THAPll表达量的增加，c-myc蛋白水平呈现明显下调(图8)。
实施例9THAP11能抑制c-myc启动子转录活性 为进一步研究THAPll对c-myc的作用，我们用报告基因检测了 THAPll对c-myc启动子转录活性的影响。用连接c-myc全长启动子(P2启动子上游 3kb， Dr.Ke皿eth WKinzler赠送)的荧光素酶报告基因载体(Del-l)转染293-THAPll细胞，在诱导THAPll表达24小时后，检测荧光素酶活性变化，结果显示，THAPll表达能抑制c-myc启动子活性；且诱导剂浓度为5 M时，启动子活性抑制率达到52% (图9A)。 进一步用pcDNA-THAPll和c-myc启动子荧光素酶报告基因共转染MCF_7、 HeLa、7721等细胞系，以pcDNA3. 1作为对照，结果表明，在这些细胞系中，THAPll同样能够抑制c-myc转录活性，且有剂量效应(图9B)。
实施例10THAP11对c-myc靶基因的影响 c-myc可通过激活或抑制下游众多靶基因的表达来实现其调控作用。为研究THAPll对c-myc调控耙基因的影响，探讨THAPll抑制细胞增殖的机制，我们用RT-PCR检测了 THAPll诱导表达后， 一些与生长和周期相关的c-myc靶基因的变化。如图10所示，受c-myc正调控的鸟氨酸脱羧酶(Orinithine decarboxylase, ODC)、人端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase, hTERT)以及核仁素(Nucleolin)的mRNA水平在THAPll诱导表达60小时后呈现明显下调(图10)。
实施例11回转c-myc可逆转THAPll引起的细胞增殖抑制 C-myc表达下调既可能是抑制细胞增殖的原因，也可能是细胞增殖抑制的结果(Pelengaris et al. ，2003)。为评估c-myc表达下调在THAPll抑制细胞增殖中所起的作用，我们用集落形成实验检测了在表达THAP11的细胞中同时过表达c-myc后细胞的增殖状况有何变化。 pIRES是双基因表达载体，由于其在两个多克隆位点之间引入了核糖体进入位点(IRES)，因此可以同时表达两个目的基因。我们将c-myc和THAPll的编码区分别克隆进载体，构建了只表达THAPll的pIRES-THAPll和共表达两个基因的pIRES-Myc-THAPll载体。Western确认了这两个蛋白的表达情况。将载体分别转染几个细胞系，检测发现，与空载体pIRES相比，pIRES-THAPll表达使细胞形成的集落数目明显减少(图11)。但同时表达c-myc后，这种抑制现象得到明显解除，细胞形成的集落数目大大增加。HEK293细胞由12%增长47% ，7721则由39%增加至69%、 HeLa由50 %增加到76 % 、 MCF-7又23 %到48 % 。表明c-myc下调在THAPll抑制细胞增殖的重要原因。
实施例12THAP11抑制PKA激活的CREB的转录活性 接着，我们用PathDetect signal transduction pathway trans-reportingsystems检测了 THAPll对胞内与增殖相关的几条信号通路的影B向。该系统提供了一个融合了转录因子转录激活结构域与Gal4-DBD的表达载体pFA trans-activator,通过共转染目的基因和转录因子，以及含有Gal4结合位点的报告基因载体，能相对特异、快速地识别一个新基因是否参与所检测信号通路的信息传递，如果参与，又是居于哪个环节。我们检测了系统中所包括的四条通路，分别是转录因子c-J皿、Elk、CREB以及CHOP所调控的途径。发现转入THAPll对于多数信号通路没有影响，单独表达THAPll对CREB的转录活性也没有影响，但若同时转入CREB的激活物PKA后，可以看到与对照相比，THAPll的表达可明显抑制PKA激活的CREB转录活性(图12)。
0088]序列表
0089]〈110〉中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
0090]〈120〉 一种新的人细胞生长抑制基因THAPll及其应用
0091]〈160>2
0092]〈210>1
0093]〈211>945
0094]〈212>DNA
0095]〈213〉人种(Homo Sapiens.)
0096]〈400>1
0097]atgcctggctttecgtgctgcgtgccaggctgctecaacaactcgcaccggg織郷cg60
0098]ctgcacttctacacgtttcc3朋gg3CgCtgagttgcggcgcctctggctc朋g朋cgtg120
0099]tcgcgtgccggcgtcagtgggtgcttctccaccttccagcccaccacaggccaccgtctc180
0100]tgcagcgttcacttccagggcggccgcaagacctecacggtecgcgtccccaccatcttc240
0101]ccgctgcgcggcgtc朋tgagcgca朋gtegcgcgcagacccgctggggccgcggccgcc300
0102]cgccgcaggc3gC3gC3gC33C3gC3gC3gC3gC3gC朋C3gC3gC朋C3gcagcagcag360
0103]C3gC朋C3gC3gC3gC3gC3gcagcagcagcagcagtcctcaccctctgcctccactgcc420
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0105]caggccactgtegac3gcagtcaggctccgggatccgtecagccggcgcccatcactccc540
0106]actggag朋g3Cgtg朋gCCcatcgatctc3C3gtgC朋gtggagtttgcagccgcagag600
0107]ggcgcagccgctgcggccgccgcgtcggagttecaggctgcteccgcagggctggaggct660
0108]gccgagtgccctetgggcccccagttggtggtggteggggEl卿gggCttccctgatect720
0109]ggctccgaccattcgtectccttgtcgtcaggcaccacgg3gg￡lgg￡lgCtcctgcgcaag780
0110]ctg朋tgagcagcgggacatcctggctctgEltgg朋gtgEl3gatg朋3g3gatga朋ggc840
0111 ]agcattcgccacctgcgtctcactgaggccaagctgcgcg朋g朋ctgcgtg卿3gg3t■
0112]cggctgcttgccatggctgtcatccgcaag朋gcacgg朋tgtga945
0113]〈210>2
0114]〈211>315
0115]〈212>PRT
0116]〈213〉人种(Homo Sapiens.)
0117]〈400>2
0118]Met Pro Gly Phe Thr Cys Cys ValPro Gly Cys Tyr AsnAsn Ser His16
0119]Arg Asp Lys Ala Leu His Phe TyrThr Phe Pro Lys Asp Ala Glu Leu32
0120]Arg Arg Leu Trp Leu Lys Asn ValSer Arg Ala Gly ValSer Gly Cys48
0121]Phe Ser Thr Phe Gin Pro Thr ThrGly His Arg Leu CysSer Val His64
0122]Phe Gin Gly Gly Arg Lys Thr TyrThr Val Arg Val ProThr lie Phe80
0123]Pro Leu Arg Gly Val Asn Glu ArgLys Val Ala Arg ArgPro Ala Gly96
AlaAlaAlaAlaArgArgArgGinGinGinGinGinGinGinGinGin112GinGinGinGinGinGinGinGinGinGinGinGinGinGinGinGin128GinGinGinGinSerSerProSerAlaSerThrAlaGinThrAlaGin144LeuGinProAsnLeuValSerAlaSerAlaAlaValLeuLeuThrLeu160GinAlaThrValAspSerSerGinAlaProGlySerValGinProAla176ProlieThrProThrGlyGluAspValLysProlieAspLeuThrVal192GinValGluPheAlaAlaAlaGluGlyAlaAlaAlaAlaAlaAlaAla208SerGluLeuGinAlaAlaThrAlaGlyLeuGluAlaAlaGluCysPro224MetGlyProGinLeuValValValGlyGluGluGlyPheProAspThr240GlySerAspHisSerTyrSerLeuSerSerGlyThrThrGluGluGlu256LeuLeuArgLysLeuAsnGluGinArgAsplieLeuAlaLeuMetGlu272ValLysMetLysGluMetLysGlySerlieArgHisLeuArgLeuThr288GluAlaLysLeuArgGluGluLeuArgGluLysAspArgLeuL肌Ala304MetAlaVallieArgLysLysHisGlyMet31权利要求
一种构成人基因的DNA，相对于序列1所示核苷酸序列或有一个或多个碱基缺失、取代或增加的核苷酸序列。
2. —种蛋白质，它具有序列2所示氨基酸序列或相对于所述氨基酸序列有一个或多个 氨基酸缺失、替代或增加的氨基酸序列。
3. —种探针，它包含于权利要求1所述的核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA。
4. 一种用作引物的DNA片段，它由权利要求1所述的核苷酸序列的部分序列组成。
5. —种病毒重组载体，它包括由权利要求1所述的核苷酸序列组成的DNA。
6. —种人用诊断制剂，它包括权利要求3所述探针。
7. 权利要求6所述的诊断制剂在肝癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肾癌等恶性肿瘤及 神经退行性疾病中基因表达检查的应用。
8. —种抗肿瘤药物制剂，它含有权利要求2所述的蛋白质。
9. 一种能与权利要求2所述蛋白质特异性结合的多克隆和单克隆抗体。
10. —种诊断性药物制剂，它含有权利要求9所述的抗体用来检测肿瘤和神经退行性 疾病患者的基因表达。
全文摘要
本发明提供了一种新的人细胞生长抑制基因及其编码蛋白的应用。该基因和编码蛋白质与细胞周期调控有关，可通过抑制原癌基因c-Myc表达抑制肿瘤细胞生长，并在多种肿瘤组织中表达下调，因此与肿瘤的发生有密切关系。该基因及其编码蛋白质和它们的衍生物可以被用作与细胞周期调控失调引起的肿瘤及神经退行性疾病等疾病的诊断、治疗和药物筛选。
文档编号G01N33/574GK101712959SQ20081016719
公开日2010年5月26日 申请日期2008年10月8日 优先权日2008年10月8日
发明者朱晨雁, 李长燕, 杨晓明, 胡德庆, 詹轶群, 许望翔 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所