专利名称：血液分析试剂及其使用方法
技术领域：
本发明涉及血液分析试剂及其使用方法，更具体地讲，本发明涉及用于对血液中
细胞进行分类计数的血液分析试剂及采用所述试剂进行血液分析的方法。
背景技术：
在正常人体内，嗜碱性粒细胞数量较少，仅占白细胞总数的0_1%。但在重金属中 毒、何杰金病、慢性粒细胞白血病等疾病中，嗜碱性粒细胞的数量会明显升高，因此嗜碱性 粒细胞计数对于这些疾病的诊断具有重要意义。 过去，临床上经常使用一些化学染料来对嗜碱性粒细胞进行染色计数，包括瑞 氏_吉姆萨复合染色法、甲苯胺蓝染色法和中性红染色法等。这些方法仅能提供嗜碱性粒 细胞的百分比计数，同时操作时间长、易受操作者主观影响，并不适合临床大规模标本的检 US4，882，284公开了一种对白细胞进行分类计数的方法。方法中使用了荧光染料 对白细胞进行染色，然后通过测定荧光、侧向散射光和前向角散射光信号可将白细胞分成 淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞五个亚群。但由于嗜碱性 粒细胞的荧光和前向角散射光信号与中性粒细胞、单核细胞的荧光和前向散射光信号有部 分重叠，因此使用这个方法对嗜碱性粒细胞数量正常或偏低的标本进行测定时，计数和分 类结果并不准确。 US5196346公开了一种用于嗜碱性粒细胞计数的试剂和方法。试剂中含有聚氧乙 烯醚类(polyoxyethylene ether)表面活性剂等组分。该方法仅使用单一参数(阻抗信 号)对嗜碱性粒细胞进行分类计数，与多参数的分类方法相比，其准确性较低。
US5538893、US5677183、US5518928分别公开了一种用于嗜碱性粒细胞分析用试剂 和方法。试剂中的主要成分包括非离子表面活性剂类的聚氧乙烯醇醚(polyoxyethylene glycol ether)等组分。此试剂可将除嗜碱性粒细胞以外的白细胞裸核化，唯独保持嗜碱性 粒细胞的结构完整。然后通过测定细胞的阻抗或低角散射光获得细胞大小方面的信号，再 通过测定细胞的侧向或高角散射光获得细胞内部结构方面的信号，最后将两种信号进行组 合即可对嗜碱性粒细胞进行分类计数。 US6214625B1公开了 一种对嗜碱性粒细胞和嗜酸粒细胞进行分类计数的试剂 和方法。试剂由一种溶血剂和一种稳定剂组成。使溶血剂与血液细胞混合一定时间，以 仅保持嗜碱性粒细胞的结构完整，随后添加稳定剂。最终，通过测定细胞的阻抗、旋转 散射光(rotatedlight scatter)信号，或者射频(radio frequency) 、 log光散射(log lightscatter)即可对嗜碱性粒细胞进行分类计数。这一方法测定的参数较多，需要多个特 殊的测定装置，仪器结构复杂、价格昂贵。 应用流式技术或阻抗方法对嗜碱细胞进行分析的基本原理是根据大小进行区分。 一般采用在酸性条件下处理血液样本，由于嗜碱细胞的特性，在此处理条件下，嗜碱细胞仍 然保持完整细胞形态，而嗜碱细胞以外的白细胞基本都被裸核化，这样从大小信息就可以识别嗜碱细胞。但是一些异常血液样本，如含有未成熟细胞、异常细胞等，在此处理条件下 不形成裸核，仍保持完整细胞结构，这样根据大小信息进行识别嗜碱细胞时，形成嗜碱细胞 数目假性增高。 —般在嗜碱细胞识别的通道中进行白细胞总数计数，但是由于有核红细胞(NRBC) 的干扰，使得含有有核红的样本的白细胞总数计数出现偏差，需要扣除单独有核红的计数 部分，才能获得准确的白细胞总数计数。 有核红细胞作为未成熟红细胞，可分为早、中、晚幼红细胞，通常存在骨髓等造血 组织器官，在正常成人外周血中极少出现。外周血中有核红细胞的出现和许多疾病状态以 及不良的预后有关，如溶血性贫血、急慢性白血病、红白血病、髓外造血及严重缺氧等，对一 些胎儿疾病的诊断及预后也具有重要的临床价值。 传统方法使用手工镜检方式检测外周血中的有核红细胞，这种方法容易受到检测
者的主观因素影响，并且计数细胞数目太少，造成误差大，并且耗时费力。在美国专利号5648225、5559037、5874310、6472215、5298426、6911313中分别公
开了有核红细胞的检测方法。 上述公开的试剂和方法中，都需要采用分别采用单独的试剂和通道进行嗜碱细胞 和有核红细胞的识别，不能同时进行有核红细胞和嗜碱细胞的识别，而且技术操作比较复 杂，不仅试剂和仪器成本较高，而且影响血液分析整体测试速度。
发明内容
本发明一方面提供了一种血液分析试剂，所述试剂包括 (1).具有通式I结构的化合物 其中 &、尺2各自独立选自C卜18烷基0)01 6、 18烷基0R6和苄基，其中苄基由选自以下 的取代基任选取代卣素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卣代烷基、氨 基、烷基氨基、酰氨基和羧基，并且&和R2不同时为苄基； R6每次出现时独立为H、C卜18烷基或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取 代卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰 氨基和羧基； X为CH2、 C (CH3) 2、 0、 S或Se ;
9
Y为-CH2-CH R3、 R4和R5各自独立选自H、卤素、氰基、羟基、18烷基、C卜18烷基磺酸基、磺酸基
和C卜5烷基C00R7 ; R7为H或C卜6的烷基； Z—为阴离子； (2)选自阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂的至少一种表面活性剂。 本发明另一方面提供了包含本发明的血液分析试剂的试剂盒，其中所述通式I的
化合物和所述表面活性剂分开独立存放于单独的容器或所述通式I的化合物和所述表面
活性剂被配制为单成分溶液。所述试剂盒可用于对血液细胞进行分类计数，优选可有效鉴
别和计数待测血液样品中有核红细胞和/或嗜碱细胞，并进行白细胞计数。 本发明还一方面提供了一种对血液细胞进行分类计数的方法，所述方法包括以下
步骤(a)将血样与本发明的血液检测试剂混合形成细胞悬液；(b)检测细胞的散射光和荧
光信号；和(c)依据散射光和荧光信号对血液中的细胞进行分类计数。 本发明还一方面提供了本发明的血液分析试剂在制备用于对血液细胞进行分类 计数的试剂盒中的用途。 本发明采用一种试剂用一个测试通道即可实现嗜碱性粒细胞和有核红细胞的识 别计数；能够对嗜碱性粒细胞计数准确，排除有核红细胞对白细胞计数的干扰，使白细胞计 数准确。也可用于单独识别计数嗜碱细胞或有核红细胞。
图1是本发明测定方法中使用的流式细胞仪的光学系统示意图。 图2是使用本发明一个实施方案的血液分析试剂测定外周血的前向散射光和荧
光信号所生成的散点图(实施例1) 图3是使用本发明一个实施方案的血液分析试剂测定外周血的前向散射光和荧 光信号所生成的散点图(实施例2) 图4是使用本发明一个实施方案的血液分析试剂测定外周血的前向散射光和荧
10光信号所生成的散点图(实施例3) 图5是使用本发明一个实施方案的血液分析试剂测定外周血的前向散射光和荧 光信号所生成的散点图(实施例4) 图6是使用本发明一个实施方案的血液分析试剂测定外周血的前向散射光和荧 光信号所生成的散点图(实施例5) 图7本发明一个实施方案的血液分析试剂测定外周血的前向散射光和荧光信号 所生成的散点图(实施例6) 图8本发明一个实施方案的血液分析试剂测定外周血的前向散射光和荧光信号 所生成的散点图(实施例7) 图9是使用专利US5518928中公开的嗜碱细胞检测试剂测定外周血的前向散射光 和荧光信号所生成的散点图(实施例8) 图10是使用本发明一个实施方案的血液分析试剂测定外周血的前向散射光和荧 光信号所生成的散点图(实施例8) 图11是使用本发明一个实施方案的血液分析试剂分析测试样本所测嗜碱细胞百 分比结果与标准ICSH方法所得结果的相关性图(实施例9) 图12是使用本发明一个实施方案的血液分析试剂分析测试样本所测有核红细胞 百分比结果与标准ICSH方法所得结果的相关性图(实施例9)
具体实施方式
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。 本文中使用的术语"烷基"，无论是单独使用还是与其他基团结合使用，指包含
l-18、优选l-12、更优选l-8、最优选1-6个碳原子的直链烷基和支链烷基。如提及单个烷
基如"正丙基"，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如"异丙基"，则只特指支链烷基。
例如，"C卜e烷基"包括C卜4烷基、(V3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规
则也适用于本说明书中使用的其它基团。 本文中使用的术语"卤素"包括氟、氯、溴和碘。 本文中使用的术语"生物样品"包括但不限于肽、蛋白质、核酸和血液中的有核红 细胞。 本文中使用的术语"芳基"是指含有3至20个碳原子的芳族单环或2或3环稠环 基团，任选还含有1至3个选自N、 0和S的杂原子。 本文中使用的术语"杂环基"是指含有3至20个碳原子的非芳族单环或2或3环 稠环基团，任选还含有1至3个选自N、 0和S的杂原子。 本文中使用的术语"磺酸基"是指_S03H基团或_S03—M基团，其中M为相反离子，包 括例如碱金属离子(例如K+离子)或碱土金属离子。 本文中使用的术语"烷基磺酸基"是指上述"磺酸基"通过上述"烷基"与分子的其 他部分连接的基团。 本文中使用的术语"有核红细胞"包括早幼红细胞、中幼红细胞以及晚幼红细胞。
本发明的血液分析试剂
本发明所公开的试剂和方法可用于测试全血中的有核红细胞和嗜碱细胞。将本发
明试剂加入到全血中后，试剂中成分能够快速溶解红细胞，保留有核红细胞的细胞核，并使
除嗜碱细胞外的白细胞膜部分溶解，应用荧光散射法，对细胞进行分类。 本发明一方面提供了一种血液分析试剂，所述试剂包括 (1).具有通式I结构的化合物
I 其中 &、尺2各自独立选自C卜18烷基0)01 6、 18烷基0R6和苄基，其中苄基由选自以下 的取代基任选取代卣素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卣代烷基、氨 基、烷基氨基、酰氨基和羧基，并且&和R2不同时为苄基； R6每次出现时独立为H、C卜18烷基或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取 代卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卣代烷基、氨基、烷基氨基、酰 氨基和羧基； X为CH2、 C (CH3) 2、 0、 S或Se ;
12 (2)选自阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂的至少一种表面活性剂。 具有通式I结构的化合物 可用于本发明的作为荧光染料的化合物具有以下通式I结构
R3、 R4和R5各自独立选自H、卤素、氰基、羟基、18烷基、C卜18烷基磺酸基、磺酸基
和C卜5烷基C00R7 ; R7为H或C卜6的烷基； Z—为阴离子。 优选&、1 2各自独立选自C卜6烷基C00Re、(V6烷基0R6和苄基，且&和R2不同时为苄基。 优选R6每次出现时独立为H、 C卜6烷基或者苯基。 优选R3、R4和R5各自独立为H、卤素、氰基、羟基、(V6烷基、(V6烷基磺酸基、磺酸基
或C卜5烷基C00R7。 优选X为C(CH3)2、0或S。
<formula>formula see original document page 13</formula>
OPh phO 通式I的化合物在本发明所提供的血液分析试剂中的合适浓度范围在O. Olppm到 lOOO卯m，优选的浓度范围为0. lppm到100卯m，而更优选的浓度范围为lppm到50卯m。
通式I的化合物可作为本文中所述的盐形式直接用于生物样品的染色。或者，在 一个实施方案中，通式I化合物可作为其衍生物的形式使用，所述衍生物包括但不限于缀 合物。 典型地，缀合物在荧光激活细胞分选仪(FACS)中使用。本文中使用的"缀合物"是 指通式I合物通过共价键与其它分子连接而形成的化合物。可与通式I化合物缀合的分子 可为与细胞或细胞成分特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底物、 辅酶等。通常，测试样品与缀合物温育一段时间，使得该缀合物与测试样品中的某些细胞或 细胞成分特异性结合，该缀合物与细胞或细胞成分的结合也可被称为染色。该染色步骤可 依次进行多次，或用多种缀合物同时进行多种染色。染色完成后，样品在荧光激活细胞分选 仪中进行分析，其中激发光源激发缀合物中的通式I化合物，而测定装置测定由激发的化 合物产生的发射光。 或者，在另一个实施方案中，该缀合物还可用于固相免疫测试，例如夹心型免疫测 试。固相免疫测试的技术是本领域公知的，可由标准教科书获得。所述缀合物可用作固相 免疫测试中的各种合适成分。 有关本发明所用的具有通式I结构的化合物的具体描述可参见中请人同时待审 的中国发明专利申请，申请号为200810217140. 9，发明名称为花菁类化合物及其在生物样品染色中的用途。该专利申请通过引用结合到本文中。
表面藩齐H 本发明所用的表面活性剂可选用阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂中的一 种，或者是两者组合。 可用于本发明的阳离子表面活性剂为具有式II所示结构的季铵盐型阳离子表面
活性剂
<formula>formula see original document page 16</formula> 其中 R8为C原子数6-14的烷基或链烯基；
R9、 R1Q为C原子数1-4的烷基或链烯基；
Ru为C原子数1-4的烷基或链烯基或苄基；
B为卤素原子。 优选所述R8选自己基、辛基、癸基、十二烷基和十四烷基，特别优选为癸基、十二烷 基或十四烷基直链烷基。 优选所述R9、 R1Q选自甲基、乙基、丙基和丁烯基等，特别优选为甲基、乙基或丙基。
优选所述X为氯原子或溴原子。 可用于本发明的非离子表面活性剂选自辛基苯基聚氧乙烯醚，聚氧乙烯(10) 十六烷基醚、聚氧乙烯(23)十六烷基醚、聚氧乙烯(25)十六烷基醚和聚氧乙烯(30)十六 烷基醚等，优选聚氧乙烯(25)十六烷基醚。 本发明的试剂系统的离子表面活性剂用量通常为50-5000mg/L，优选 100-2000mg/L。具体用量根据使用表面活性剂的种类做出适当的调节。无论哪一种表面活 性剂其溶血能力只要达到红细胞膜溶解，白细胞膜产生微孔，能够进入荧光染料即可。最好 远远小于白细胞产生裸核用量。表面活性剂的溶血效果和侧链长度有关，侧链越长溶血力 越强，所需浓度越低。
其它组分 本发明试剂中还可加入芳香族有机酸或其盐，使用芳香族有机酸可以使红细胞溶 血速度加快，优选水杨酸及其盐、苯甲酸及其盐，使用浓度为1-lOOmmol/L.
本发明的检测试剂还可包括用于调节pH的缓冲剂。常见的缓冲剂有柠檬酸、甲 酸、乙酸、甘氨酸、苯二甲酸、酒石酸、苹果酸、马来酸等，其使用浓度通常为0.01-0. lmo1/ L，优选为0. 01-0. 05mol/L。使用缓冲剂通常将试剂的pH值控制在在2_6之间，优选为 2. 5-4. 5。 本发明的检测试剂中还可以加入抗氧化剂，常用的有2，6-二叔丁基-4-甲基苯 酚、4-甲氧基苯酚、异维C钠、维生素等，其使用浓度通常为0. l-5g/L。
本发明的检测试剂还可包括用于调节渗透压的渗透压调节剂。试剂的渗透压一般 控制在20-150m0sm/kg之间，因为渗透压在此范围内，红细胞容易被溶解，可防止对测量造 成干扰。常用的碱金属盐、葡萄糖、甘露醇等均可将试剂渗透压控制在合理范围内。
另外，本发明的具有结构I通式的化合物在水溶液不稳定的情况下，可以溶解在 甲醇、乙醇、二甲亚砜、乙二醇等溶剂中保存。使用时可以与其他成分的水溶液混合使用。
輛日月麵編斤i式嫩 本发明另一方面提供了本发明的血液分析试剂在制备用于对血液细胞进行分类 计数的试剂盒中的用途。优选所述试剂盒可有效鉴别和计数待测血液样品中有核红细胞和 /或嗜碱细胞，并进行白细胞计数。 本发明还一方面提供了包含本发明的血液分析试剂的试剂盒，所述试剂盒可用于 对血液细胞进行分类计数，优选可用于鉴别和计数待测血液样品中有核红细胞和/或嗜碱 细胞，并进行白细胞计数。 在一个试剂盒的实施方案中，所述通式I的化合物作为储存液的形式，保存在单 独的容器中。优选采用甲醇、乙醇、二甲亚砜、乙二醇等作为溶剂。使用时可以与其他成分 的水溶液混合使用。 在另一个试剂盒的实施方案中，所述通式I的化合物与上述表面活性剂和/或其 他组分一起配制为单成份溶液。 所述试剂盒还可包含用于血液细胞，优选有核红细胞、嗜碱性粒细胞以及白细胞
分类计数所需的其他试剂，以及进行所述分类计数的方法的说明书。所述试剂盒还可包含
可测定并与测试样品对比的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的各组分可分装在单个容
器中，不同容器连同其说明一起全部在单独的包装中。 采用本发明的血液检测试剂对血液细胞进行分类计数的方法 本发明还一方面提供了一种对血液细胞进行分类计数的方法，所述方法步骤包括
以下步骤(a)将血样与本发明的血液检测试剂混合形成细胞悬液；(b)检测细胞的散射光
和荧光信号；和(c)依据散射光和荧光信号对血液中的细胞进行分类计数。 利用本发明的试剂对样品进行测试的具体过程包括将本发明的试剂和待测样品
混合一段时间后，检查细胞的荧光强度和细胞大小的信息，可以将有核红细胞、嗜碱细胞以
及其它类型白细胞进行有效的区分。另外，由于不同发育时期有核红细胞的细胞核体积大
小不同，本发明试剂可将有核红细胞进一步区分为不同发育时期的幼稚红细胞。 利用本发明的试剂对样品进行处理时，可同时在待测样品中加入具有通式I结构
的化合物和含有表面活性剂的溶血剂，也可以按照前后顺序与样品进行混合。 在流式细胞仪或全自动血液细胞分析仪上使用本发明的血液检测试剂对血
液细胞进行检测时，首先将血液样本和本发明的血液检测试剂按一定比例，通常为
i : io-i : ioo混匀制备成细胞悬液，并在反应温度42t:的条件下孵育4-30秒。然后将
细胞悬液注入到如图1所示的光学系统进行检测。 在上述光学系统内，单个细胞依次进入流动室，并使用半导体激光器发出的波长 630nm左右激发光对其进行照射。本发明血液检测试剂所用的荧光染料可以在640nm附近 被激发且其波长在42t:可以保持稳定，因此与使用的半导体激光器工作波长相匹配。
经过激发的细胞发出的光散射信号被收集到光电二极管中，散射光的收集角度可以为低角(0° -5° )，也可以为高角(6。 -20° )。而细胞发出的荧光信号则被侧向的光 电倍增管所收集。 光散射信号和荧光信号被输入到数据处理单元进行分析处理。最终，依据细胞的
光散射信号和荧光信号将血液中的各种进行分类和计数。
实施例 以下所提供的实施例仅用于对本发明作出进一步的举例说明，而无意于对说明书 作出任何限定。 除非另有声明，否则以下实施例中所用的血液细胞检测设备为深圳迈瑞生物医疗 电子股份有限公司生产的BC系列流式细胞分析仪，检测波长640nm。所述细胞分析仪的原 理图如图l所示。
实施例1 具有以下结构的化合物(荧光染料)10mg
柠檬酸 1.21g
十二烷基三甲基氯化铵 500mg
水杨酸钠 1.6g
4甲氧基苯酚 0. 2g H20 加至l升量
(用HC1将试剂pH值调至3. 5左右) 其中血液检测试剂所用的作为荧光染料的通式I化合物具如下结构
取一高值有核红细胞样本，经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞士-吉姆 撒染色法确认，其有核红细胞比率为22NRBC/100个WBC，取此血液样本20ii L与lmL试剂混 匀形成细胞悬液，42t:孵育4. 8秒。然后使细胞悬液通过流式细胞分析仪，并测定细胞的前 向(0° )散射光信号和荧光信号，生成如图2所示散点图。散点图上有核红细胞与白细胞 之间存在明显界限，计算结果为22. 24%。 本发明该实施例的试剂可将有核红细胞进一步划分为中、晚幼红细胞，经国际血 液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法确认，样本中中幼红细胞比率为2% (2NRBC/100个WBC)，晚幼红细胞比率为20% (20NRBC/100个WBC)。使用本发明该实施例 的试剂和方法生成的散点图计算结果为中幼红细胞2. 15%，晚幼红细胞20. 09% .
实施例2 取一嗜碱细胞含量较高样本，经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法确认，其嗜碱细胞百分比为5% 。使用实施例1所述试剂和方法对该样本进行检 测，生成如图3所示的散点图。散点图上嗜碱性粒细胞与其他白细胞之间存在明显界限，计 算结果为4.61%。 0135] 实施例3
0136] 具有以下结构的化合物(荧光染料)10mg 0137] 柠檬酸 1.21g 0138] 聚氧乙烯(25)十六烷基醚 500mg 0139] 水杨酸钠 1.6g 0140] 2，6-二叔丁基-4_甲基苯酚 0.2g 0141] H20 加至l升量 0142](用HC1将试剂pH值调至3. 5左右)
0143] 其中血液检测试剂所用的作为荧光染料的通式I化合物具如下结构 0144] 将血液标本20ul和lml试剂混匀制成细胞悬液，42。C孵育4秒。然后使细胞悬液 通过流式细胞分析仪，并测定细胞的前向(0° )散射光信号和荧光信号，生成如图4所示散 点图，测试结果为有核红细胞5.6%，嗜碱细胞1.2%。同一标本经国际血液学标准化委员 会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法确认，其有核红细胞比率为5% (5NRBC/100个WBC)， 嗜碱细胞百分比为1%，
实施例4 (成分一)
1.21g
十二烷基三甲基氯化铵 400mg
苯甲酸钠 2.0g
4甲氧基苯酚 0. 2g
H20 加至1升量
(用HC1将试剂pH值调至3. 5左右)
(成分二)
具有以下结构的化合物(荧光染料)lOmg 甲醇 5ml 乙二醇 95ml
其中血液检测试剂所用的作为荧光染料的通式I化合物具如下结构
<formula>formula see original document page 20</formula> 取一高值有核红样本，将血液样本20ul与1ml实施例4中(成分一 )混合，混匀 后加入(成分二)，42t:孵育3秒。然后使细胞悬液通过流式细胞分析仪，并测定细胞的前 向(0° )散射光信号和荧光信号，生成如图5所示散点图，测试结果为有核红细胞4.5%， 嗜碱细胞O. 1%。经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞士-吉姆撒染色法确认，其 有核红细胞比率为NRBC 4% (4/100个WBC)，嗜碱细胞百分比为0。
实施例5 具有以下结构的化合物(荧光染料)10mg
:0163] 柠檬酸 1.21g
:0164] 十四烷基三甲基氯化铵 lOOmg
:0165] 水杨酸钠 1.6g
:0166] 4甲氧基苯酚 0.2g
:0167] H20 加至l升量(用HC1将试剂pH值调至3. 5左右) 其中血液检测试剂所用的作为荧光染料的通式I化合物具如下结构
EtOOC COOEt 取一有核红细胞样本，经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞士-吉姆撒染 色法确认，其有核红细胞比率为4NRBC/100个WBC，嗜碱粒细胞比率为1 % ，取此血液样本 20 L与lmL试剂分别混匀形成细胞悬液，42t:孵育4. 8秒。然后使细胞悬液通过流式细胞 分析仪，并测定细胞的前向(0° )散射光信号和荧光信号，生成如图6所示散点图，测试结 果为有核红细胞4. 5%，嗜碱细胞百分比为0. 7% .
实施例6 具有以下结构的化合物(荧光染料)10mg
柠檬酸 2. lg
十二烷基三甲基氯化铵
水杨酸钠
焦亚硫酸钠
H90
加至l升
300mg 2. 0g 0. 2g 其中血液检测试剂所用的作为荧光染料的通式I化合物具如下结构
<formula>formula see original document page 21</formula> 取一有核红细胞样本，经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞士-吉姆撒染 色法确认，其有核红细胞比率为4NRBC/100个WBC，嗜碱粒细胞比率为1 % ，取此血液样本 20 L与lmL试剂分别混匀形成细胞悬液，42t:孵育4. 8秒。然后使细胞悬液通过流式细胞 分析仪，并测定细胞的前向(0° )散射光信号和荧光信号，生成如图7所示散点图。测试结 果为有核红细胞3. 8%，嗜碱细胞百分比为0. 8%。
0182]实施例7
0183]具有以下结构的化合物(荧光染料)10mg
0184]柠檬酸2. 52g
0185]拧檬酸钠0. 88g
0186]十二烷基三甲基氯化铵300mg
0187]水杨酸钠l』g
0188]4甲氧基苯酚0. 2g
0189]H20加至1升量
0190](用HC1将试剂pH值调至3. 5左右)
0191]其中血液检测试剂所用的作为荧光染料的通式I化合物具如下结构0192] 取一高值有核红细胞样本，经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞士-吉姆 撒染色法确认，其有核红细胞比率为39NRBC/100个WBC，取此血液样本20 y L与lmL试剂分别混匀形成细胞悬液，42t:孵育4. 8秒。然后使细胞悬液通过流式细胞分析仪，并测定细 胞的前向(0° )散射光信号和荧光信号，生成如图8所示散点图。测试结果为有核红细胞 38. 6%。 实施例8 取临床血样一份，使用美国专利US5518928中公开的嗜碱细胞检测试剂处理后， 使细胞悬液通过流式细胞分析仪，然后通过测定细胞的阻抗或低角散射光获得细胞大小方 面的信号，再通过测定细胞的侧向或高角散射光获得细胞内部结构方面的信号，最后将两 种信号进行组合对嗜碱粒细胞进行计数，如图9，检测结果为2. 5%，经国际血液学标准化 委员会(ICSH)推荐的瑞士-吉姆撒染色法确认，其嗜碱细胞百分比为O. 5%，光学散射法测 量结果明显高于镜检结果。镜下观察样本中的部分未成熟粒细胞体积大，胞浆内颗粒物质 增多，染色呈深蓝色，未成熟粒细胞百分比为3%，结果表明一些疾病导致血液样本中未成 熟粒细胞时，可能造成散射法检测的嗜碱性粒细胞结果假性偏高。使用本发明实施例1的 试剂和方法测试结果为0.6%，如图10。使用专利中方法进行检测时，由于这些细胞中的核 酸含量高于嗜碱性粒细胞，可以利用不同细胞中结合荧光强度不同将其与嗜碱性粒细胞进 行区分。 实施例9 取临床血液30份，使用实施例1中所述的方法和推荐的瑞士 _吉姆撒染色法进行
嗜碱细胞分类检测，其相关性如图11。取有核红样本30例，使用实施例1中所述的方法和
推荐的瑞士 _吉姆撒染色法分别进行有核红细胞检测，其相关性如图12. 已通过上述各实施方案和具体实施例对本发明作出说明，但本领域技术人员会理
解，在不偏离本发明宗旨和范围的情况下，可对本发明作出各种修改、变更和替换。
权利要求
一种血液分析试剂，所述试剂包括(1).具有通式I结构的化合物其中R1、R2各自独立选自C1-18烷基COOR6、C1-18烷基OR6和苄基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基，并且R1和R2不同时为苄基；R6每次出现时独立为H、C1-18烷基或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取代卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基；X为CH2、C(CH3)2、O、S或Se；Y为-CH2-CH＝CH-、或各自独立为R3、R4和R5各自独立选自H、卤素、氰基、羟基、C1-18烷基、C1-18烷基磺酸基、磺酸基和C1-5烷基COOR7；R7为H或C1-6的烷基；Z-为阴离子(2)选自阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂的至少一种表面活性剂。F2008102182672C0000011.tif,F2008102182672C0000012.tif,F2008102182672C0000013.tif,F2008102182672C0000021.tif,F2008102182672C0000022.tif,F2008102182672C0000023.tif
2. 权利要求1的血液分析试剂，其中R2各自独立选自(V6烷基C00R6、 (V6烷基0R6 和节基，且&和R2不同时为节基。
3. 权利要求1-2中任一项的血液分析试剂，其中Re每次出现时独立为H、C卜e烷基或者 苯基。
4. 权利要求1-3中任一项的血液分析试剂，其中R3、R4和R5各自独立为H、卤素、氰基、 羟基、C卜6烷基、(V6烷基磺酸基、磺酸基或C卜5烷基C00R7。
5. 权利要求1-4中任一项的血液分析试剂，其中X为C(CH3)2、 0或S。
6.
7. 权利要求1-6中任一项的血液分析试剂，其中Z—为选自卤素离子、C104—、 PF( CF3S03—、BF4—、乙酸根或对甲苯磺酸根负离子的阴离子。
8. 权利要求1-7中任一项的血液分析试剂，所述化合物为<formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula>OPh PhO 。
9. 权利要求1-8中任一项的血液分析试剂，其中所述阳离子表面活性剂为具有式II所示结构的季铵盐型阳离子表面活性剂{R8-N+-R"} B-II射R8为C原子数6-14的烷基或链烯基； R9、 R1Q为C原子数1-4的烷基或链烯基； Rn为C原子数1-4的烷基或链烯基或苄基； B为卤素原子。
10. 权利要求9的血液分析试剂，其中所述R8选自己基、辛基、癸基、十二烷基和十四烷 基，优选为癸基、十二烷基或十四烷基直链烷基。
11. 权利要求9-10中任一项的血液分析试齐U，其中所述R9、Rw选自甲基、乙基、丙基和 丁烯基等，优选为甲基、乙基或丙基。
12. 权利要求9-11中任一项的血液分析试剂，其中所述X为氯原子或溴原子。
13. 权利要求1-8中任一项的血液分析试剂，其中所述非离子表面活性剂选自辛基苯 基聚氧乙烯醚，聚氧乙烯(10)十六烷基醚、聚氧乙烯(23)十六烷基醚、聚氧乙烯(25)十六 烷基醚和聚氧乙烯(30)十六烷基醚等，优选聚氧乙烯(25)十六烷基醚。
14. 权利要求1-13中任一项的血液分析试剂，所述试剂还含有芳香族有机酸或其盐， 优选水杨酸及其盐、苯甲酸及其盐。
15. 权利要求1-14中任一项的血液分析试剂，所述试剂还含有选自柠檬酸、甲酸、乙 酸、甘氨酸、苯二甲酸、酒石酸、苹果酸和马来酸的pH值缓冲剂。
16. 权利要求15的血液分析试剂，其中所述缓冲剂的pH值为2-6，优选为2. 5-4. 5。
17. 权利要求1-16中任一项的血液分析试剂，所述试剂还含有选自2，6- 二叔丁 基-4-甲基苯酚、4-甲氧基苯酚、异维C钠和维生素的抗氧化剂。
18. 权利要求1-17中任一项的血液分析试剂，所述试剂还含有选自碱金属盐、葡萄糖 和甘露醇的渗透压调节剂。
19. 权利要求18的血液分析试剂，所述试剂的渗透压一般控制在20-150m0sm/kg之间。
20. —种对血液细胞进行分类计数的方法，所述方法包括以下步骤(a)将血样与权利 要求1-19中任一项的血液分析试剂混合形成细胞悬液；(b)检测细胞悬液的散射光和荧光 信号；和(c)依据散射光和荧光信号对血液中的细胞进行分类计数。
21. 权利要求20的方法，其中所述血液细胞包括有核红细胞、嗜碱性粒细胞和/或白细胞。
22. —种用于血液分析的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-19中任一项的血液分析 试剂，其中所述通式I的化合物和所述表面活性剂分开独立存放于单独的容器或所述通式 I的化合物和所述表面活性剂被配制为单成分溶液。
全文摘要
本发明一方面提供了一种血液分析试剂，所述试剂包括(1)具有通式I结构的化合物；(2)选自阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂的至少一种表面活性剂。本发明另一方面提供了一种对血液细胞进行分类计数的方法，所述方法包括以下步骤(a)将血样与本发明的血液检测试剂混合形成细胞悬液；(b)检测细胞的散射光和荧光信号；和(c)依据散射光和荧光信号对血液中的细胞进行分类计数。本发明所提供的血液分析试剂可有效鉴别和计数待测血液样品中有核红细胞和/或嗜碱细胞，并进行白细胞计数。
文档编号G01N15/10GK101750476SQ20081021826
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月8日 优先权日2008年12月8日
发明者包德泉, 匡玉吉, 张宝华, 徐兵, 邵建辉, 雷霆 申请人:深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司