专利名称：：一种化妆品中孕激素黄体酮的测定方法
技术领域：
：本发明涉及一种化妆品中孕激素黄体酮的测定方法，特别是涉及一种通过超高效液相色谱质谱联用4义(UPLC/MS/MS)对化妆品中孕激素黄体酮进4于定性和定量一企测的方法。
背景技术：
：黄体酉同(Proglsterone)又名孕酉同(Utrogestan)、Ji力孕素(Pro—gestln),为孕激素，在医疗上黄体酮有口H和注射两种剂型，具有人工调整月经周期等作用，但黄体酮也具有一定的副作用，大剂量时能抑制垂体促性腺激素的分泌，产生抑制排印作用。目前，化妆品中黄体酮对雀斑美容具有很好的疗效，但是其检测方法只有《化妆品卫生规范》中制定了黄体酮的高效液相色镨法，此方法的缺点是不能对含有微量孕激素黄体酮的样品，以及含有较多干扰杂质的样品进行准确定性判断和定量测定，因此建立一种能够准确定性、快速和准确定量的检测方法，有利于监控化妆品领域黄体酮添加使用量和残留量，从而保障化妆品的安全使用。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于克服了孕激素黄体酮目前检测标准中技术上既不能微量定量也不能准确定性的缺陷，通过摸索提取液、萃取液、定容液，以及最佳萃取溶剂配比7;口最佳色语条件而提供一种化妆品中孕激素黄体酮的定性和定量纟全测方法。为实现上述目的，本发明采取以下设计方案本发明的一种通过超高效液相色谱质语联用仪(UPLC/MS/MS)对化妆品中孕激素黄体酮进行定性和定量检测的方法包括如下步骤待测试样为溶液状样品，准确称取充分混匀后的样品1.000g2.000g(±0.Olg)于lOmL具塞比色管中，在水浴上馏除乙醇等挥发性有机溶剂，用甲醇稀释到10mL,充分混匀后'，滤膜过滤后获得试样处理液。待测试样为膏状、乳状样品，准确称耳又充分混匀后的样品1.000g~2.000g(±0.01g)于250mL锥形瓶中，在水浴上馏除乙醇等挥发性有机溶剂，加入饱和氯化钠溶液50mL，2。/。硫酸2.0mL，充分振荡溶解后转移至250mL分液漏斗，以环己烷30mL分三次萃耳又，必要时离心分离，合并环己烷，减压蒸馏除去环己烷，甲醇溶解残留物，转移到10mL具塞比色管中，用曱醇稀释到刻度，充分混匀后，滤膜过滤后获得试样处理液。称取孕激素黄体酮标准品，用甲醇溶解并定容后作为储备液，然后进一步用曱醇稀释为具有浓度梯度的标准使用液；利用超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC/MS/MS)对标准使用液和试样处理液进4于;险测；计算结果，试样中孕激素黄体酮的计算公式为式中X-试样中纳他霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);C-试样处理液浓度(ng/mL);V-试样定容体积，单位为克(mL);m-试样质量，单位为克(g)。优选地，所述水浴上馏除乙醇等挥发性有机溶剂。优选地，添加饱和氯化钠水溶液50mL,2y。硫酸水溶液2mL,充分振荡溶解。优选地，采用环己烷30mL,分三次萃取。优选地，采用曱醇作为定容液。所述利用超高效液相色语质谱联用仪(UPLC/MS/MS)对试样处理液进行检测的色语条件为液相色"i普条件色i普柱ACQUITYUPLCBEHC18,2.lmmx50mm,1.7fim;柱温30°C;流动相乙腈+0.2%曱酸水溶液(60+40);流速0.3mL/min;进样量5pL;质谱条件离子源电喷雾离子源；扫描方式正离子扫描；才全测方式多反应4t测；毛细管电压(Kv):1.0;离子源温度(°C):110;去溶剂温度(°C):350;去溶剂流速(L/hr):700;本实验的多反应监测(MRM)、驻留时间、锥孔电压和碰撞能量参数见表l。表lACQUITYTQDMRM参数<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注315.30〉109.OO为定性离子对315.30>97.OO为定量离子对并根据定性离子对315.30〉97.00结合质谱定性理论进行定性，外标峰面积法定量。本发明的优点是采用本发明的方法检测化妆品中孕激素黄体酮，快速有效，RSD小于5。/。，既能准确的进行定性判断，也能进行定量分析，最低检测限达到0.01mg/kg。由此可见，本发明的方法，为化妆品中孕激素黄体酮的检测，提供了一种可靠的便于实施的依据，能够满足研究、生产和曰常市场抽检的需要。具体实施例方式实施例1,溶液状化妆品中孕激素黄体酮的精密度和回收率检测待测试样为溶液状样品，准确称取充分混匀后的样品1.000g2.000g(±0.01g)于lOmL具塞比色管中，在水浴上馏除乙醇等挥发性有机溶剂，用甲醇稀释到10mL，充分混匀后，过0.22um滤膜，作为试样处理液备用。黄体酮标准储备溶液称取黄体酮0.Olg(准确至0.0001g)于100ml容量瓶中，用少量曱醇溶解，最后用甲醇稀释至刻度，此溶液作为黄体酮标准储备液。lmL此溶液含黄体酮0.lmg,再稀释为10.0、50.0、100、200、500ng/mL的标准4吏用液。检测条件为液相条件色语柱:ACQUITYUPLCBEHC18,2.lmmx50mm，1.7(im;柱温30°C;流动相乙腈+0.2%甲酸水溶液(60+40);流速0.3mL/min;进样量5pL;质谱条件离子源电喷雾离子源；扫描方式正离子扫描；才全测方式多反应冲企测；毛细管电压(Kv):1.0;离子源温度(°C):110;去溶剂温度(°C):350;去溶剂流速(L/hr):700;本实验的多反应监测(MRM)、驻留时间、锥孔电压和碰撞能量参数见表l。表lACQUITYTQDMRM参数MRM驻留时间(sees)4#孔电压(volts)碰撞能量[ev]黄体酮315.30>97.000.100復0020.00315.30〉109.000.10040.0025.00注315.30〉109.OO为定性离子对315.30〉97.OO为定量离子对根据其质谱峰定性，外标峰面积法定量。计算结果，试样中孕激素黄体酮的计算公式(1)为Y一CxK—1000xm式中X-试样中孕激素黄体酮的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);C-试样处理液浓度(ng/mL);V-试样定容体积，单位为克(mL);附-试样质量，单位为克(g);试样中孕激素黄体酮的含量按公式(1)进行计算，结果如下:9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2，膏状、乳状化妆品中孕激素黄体酮精密度和回收率的检测待测试样为膏状、乳状样品，准确称耳又充分混匀后的样品L000g2.000g(±0.01g)于100mL锥形瓶中，在水浴上馏除乙醇等挥发性有机溶剂，加入饱和氯化钠溶液50mL,2。/。硫酸2.0mL，充分振荡溶解后转移至250mL分液漏斗，以环己烷30mL分三次萃取，必要时离心分离，合并环己烷，减压蒸馏除去环己烷，曱醇溶解残留物，转移到10mL具塞比色管中，用曱醇稀释到刻度。充分混匀后，过0.22um滤膜，作为试样处理液备用。称fl黄体酮0.Olg(准确至0.OOOlg)于100ml容量jf瓦中，用少量曱醇溶解，最后用甲醇稀释至刻度，此溶液作为黄体酮标准储备液。lmL此溶液含黄体酮0.lmg，再逐渐稀释为10.0、50.0、100、200、500ng/mL的标准4吏用液。检测条件为液相条件色语柱ACQUITYUPLCBEHC18,2.lmmx50mm,1.7nm;柱温30°C;流动相乙腈+0.2%甲酸水溶液(60+40);流速0.3mL/min;进样量5|uL;质语条件离子源电喷雾离子源；扫描方式正离子扫描；才全测方式多反应4全测；毛细管电压(Kv):1.0;离子源温度(°C):110;去溶剂温度(°C):350;去溶剂流速(L/hr):700;本实验的多反应监测(MRM)、驻留时间、锥孔电压和碰撞能量参数见表l。表lACQUITYTQDMRM参数MRM驻留时间(sees)锥孔电压(volts)碰撞能量[ev]黄体酮315.30>97.000.10040.0020.00315.30〉109.000.10040.0025.00注315.30〉109.OO为定性离子对315.30〉97.OO为定量离子对根据其质i普峰定性，外标峰面积法定量。计算结果，试样中孕激素黄体酮的计算公式(1)为Y_CxF_1000xm式中X-试样中孕激素黄体酮的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);C-试样处理液浓度(ng/mL);V-试样定容体积，单位为克(mL);附-试样质量，单位为克(g);试样中孕激素黄体酮的含量按公式(1)进行计算，结果如下:ii<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>显而易见，本领域的普通技术人员，可以用发明的这种通过超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC/MS/MS)对化妆品中孕激素黄体酮进行定性和定量4全测。上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。权利要求1、一种通过超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC/MS/MS)对化妆品中孕激素黄体酮的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括如下步骤待测试样为溶液状样品准确称取充分混匀后的样品1.000g～2.000g(±0.01g)于10mL具塞比色管中，在水浴上馏除乙醇等挥发性有机溶剂，用甲醇稀释到10mL，充分混匀后，滤膜过滤后获得试样处理液；待测试样为膏状、乳状样品准确称取充分混匀后的样品1.000g～2.000g(±0.01g)于100mL锥形瓶中，在水浴上馏除乙醇等挥发性有机溶剂，加入饱和氯化钠溶液50mL，2％硫酸2.0mL，充分振荡溶解后转移至250mL分液漏斗，以环己烷30mL分三次萃取，必要时离心分离，合并环己烷，减压蒸馏除去环己烷，甲醇溶解残留物，转移到10mL具塞比色管中，用甲醇稀释到刻度，滤膜过滤后获得试样处理液；称取孕激素黄体酮标准品，用甲醇溶解并定容，作为黄体酮储备液，然后进一步用甲醇稀释为具有浓度梯度的标准使用液；利用超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC/MS/MS)对标准使用液和试样处理液进行定性和定量检测；计算结果，试样中孕激素黄体酮的计算公式为式中X-试样中孕激素黄体酮的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；C-试样处理液浓度(ng/mL)；V-试样定容体积，单位为克(mL)；m-试样质量，单位为克(g)；2、根据权利要求l所述的一种化妆品中孕激素黄体酮的测定方法，其特征在于水浴上馏除乙醇等挥发性有机溶剂，很好的解决了试样液中一些有机溶剂的残存，避免了其对色镨峰的影响。3、根据权利要求1所述的一种化妆品中孕激素黄体酮的测定方法，其特征在于添加饱和氯化钠水溶液50mL,2。/。硫酸水溶液2mL,充分振荡溶解，能够有效的去除油脂等大分子类物质，防止乳化，从而保证样品的回收率。4、根据权利要求1所述的一种化妆品中孕激素黄体酮的测定方法，其特征在于采用环己烷30mL分三次萃耳又，环己烷30mL和三次萃耳又，为最佳萃取条件。5、根据权利要求1所述的一种化妆品中孕激素黄体酮的测定方法，其特征在于采用曱醇作为定容液，很好的保证了在质语条件下，标准液和试样液保持了相同的介质溶液，从而达到最优的离子化条件。6、根据权利要求1所述的一种化妆品中孕激素黄体酮的测定方法，其特征在于所述利用超高效液相色谱质语联用仪(UPLC/MS/MS)对试样处理液进行定性和定量4全测的液相条件为色i普柱ACQUITYUPLCBEHC18,2.lmmx50mm,1.7,柱温30°C流动相乙腈+0.2%甲酸水溶液(60+40)流速0.3mlVmin进样量5pL此条件下具有4艮好的分离效旲。7、根据权利要求1所述的一种化妆品中孕激素黄体酮的测定方法，其特征在于所述利用超高效液相色谱质语联用仪(UPLC/MS/MS)对试样处理液进行定性和定量^r测的质语条件为离子源电喷雾离子源；扫描方式正离子扫描；-险测方式多反应4全测；毛细管电压(Kv):1.0;离子源温度(°C):110;去溶剂温度(°C):350;去溶剂流速(L/hr):700;本实验的多反应监测(M腿)、驻留时间、锥孔电压和碰撞能量参数见表l。表lACQUITYTQDMRM参数<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>注315.30〉109.OO为定性离子对315.30〉97.OO为定量离子对此条件下，黄体酮具有很好的色语峰形和较高的质语灵敏度8、根据权利要求1所述的一种化妆品中孕激素黄体酮的测定方法，其特征在于利用较为适用的超高效液相色i普质语联用仪(UPLC/MS/MS)对样品中孕激素黄体酮进行定性和定量检测。全文摘要本发明涉及一种通过超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC/MS/MS)对化妆品中孕激素黄体酮的测定方法。待测试样经馏除乙醇等挥发性有机溶剂后，加入饱和氯化钠和2％硫酸水溶液，充分振荡溶解，环己烷萃取后减压蒸馏，甲醇定容、过滤后得到试样处理液；准确称取黄体酮标准品，用甲醇溶解、稀释为具有浓度梯度的标准使用液；利用液质联用仪(UPLC/MS/MS)对标准使用液和试样处理液进行定性、定量检测；然后便可计算出结果。采用本发明的方法检测化妆品中黄体酮的含量，快速有效，相对平均偏差小于5.0％，由此可见，本发明的方法，为化妆品中孕激素黄体酮的检测，提供了一种可靠的便于实施的方法，能够满足研究和生产中的需要。文档编号G01N30/00GK101451981SQ20081024673公开日2009年6月10日申请日期2008年12月30日优先权日2008年12月30日发明者薇宋申请人:谱尼测试科技(北京)有限公司