测定试剂、使用其的免疫比浊法和待测物分析用具的制作方法

专利名称：测定试剂、使用其的免疫比浊法和待测物分析用具的制作方法
技术领域：
本发明涉及测定试剂、使用其的免疫比浊法和待测物分析用具。
背景技术：
一直以来，作为临床检查中的免疫学测定方法，使用酶免
疫分析法(EIA法)、免疫比浊法等。其中，使用胶乳颗粒作为 不溶性载体颗粒的免疫比浊法，由于改良了测定灵敏度(例如， 参照专利文献l ~ 4),并且能够利用自动分析仪器，因此近年来 被广泛〗吏用。
所述使用胶乳颗粒的免疫比浊法也被称作胶乳凝集免疫比 浊法。该方法是利用以下方式的测定方法使用负载有测定对 象的抗体的胶乳颗粒，所述一皮负载的抗体与待测物中的测定对 象(抗原)发生抗原抗体反应，从而所述胶乳颗粒凝集。所述 待测物中的测定对象中具有例如j象在体内发生炎症反应等时血 液中所出现的C反应性蛋白(CRP)那样的、以4艮宽的浓度范围 存在于血液中的物质。因此，所述使用胶乳颗粒的免疫比浊法， 除了前述的提高灵敏度之外，还被要求能够在很宽的浓度范围 内对所述测定对象进行定量。因此，提出了例如下述专利文献 1 ~ 4中所记载的那样的使用2种胶乳颗粒的方法。
专利文献l中公开了 一种使用附加有不同量的同 一抗原或 同一抗体的、平均粒径不同的2种胶乳颗粒的方法。另外，专利 文献2中公开了以下方法将抗体或抗原致敏后的、平均粒径不 同的2种以上的胶乳颗粒混合，并照射特定波长的光。另外，专 利文献3中公开了 一种使用固定有单克隆抗体的、平均粒径不同的2种胶乳颗粒的方法。此外，专利文献4中公开了 一种方法，该方法中使用了将分别用不同的单克隆抗体致敏而成的2种抗体致敏胶乳颗粒以特定比例混合后的物质。
专利文献l:日本特7>昭63 - 14783号7>净艮
专利文献2:日本专利第2588174号公报
专利文献3;曰本净争开2005 _ 106609号7>寺艮
专利文献4:日本专利第3598701号乂>净艮

发明内容
然而，如所述专利文献l ~ 3中所公开的那样的、使用平均粒径不同的2种l交乳颗4立的免疫比浊法，例如如下所述，难以确保测定对象(抗原)的可测定的浓度范围和测定灵敏度。即，所述免疫比浊法中，例如，为了确保对于低浓度的测定对象的测定灵敏度，需要增多平均粒径大的颗粒(大颗粒)的抗体致敏量，减少平均粒径小的颗粒(小颗粒)的抗体致敏量。然而，若减少对所述小颗粒的抗体致敏量，则为了确保测定对象的可测定的浓度范围，需要增加抗原抗体反应时的小颗粒量。其结果，胶乳颗粒所需要的成本升高。另外，由于抗原抗体反应时整体颗粒浓度变高，容易发生非特异性凝集。此外，若过量增加抗原抗体反应时的小颗粒量，则对于低浓度的测定对象的测定灵敏度反而会降低。另一方面，代替增加抗原抗体反应时的小颗粒量，而增加致敏反应时用于致每文小颗粒的抗体量，则测定对象为低浓度的情况下，小颗粒先于大颗粒而更多地与测定对象反应，因此难以确保对于低浓度的测定对象的测定灵敏度。此外，若减少小颗粒量，则可能会发生前区现象，另外，由于凝集的颗粒数减少，所以难以获得高浓度侧的灵敏度。这样，
浊法中，例如，对最佳平均粒径的组合、用于致敏胶乳颗粒的抗体的比例、2种胶乳颗粒的混合比例、抗原抗体反应时的胶乳颗粒浓度等的控制很困难，难以确保对于低浓度的测定对象的测定灵敏度和测定对象的可测定的浓度范围。
另一方面，如所述专利文献3和4中所/>开的那样的、使用
负载有单克隆抗体的胶乳颗粒的方法，其目的在于防止前述非特异性凝集和确保测定灵敏度。然而，该方法由于使用单克隆抗体，因此存在成本高的问题。此外，单克隆抗体由于只有一种抗原识别部位，因此除了测定对象抗原为多价或多聚体的情况外，仅使用一种抗体则无法通过抗原抗体反应发生凝集。因此，在使用单克隆抗体的情况下，需要将多种单克隆抗体进行组合，但由于所选择的抗体需要满足相互的抗原识别部位不同、不会接近、不受位阻等条件，因此非常复杂。而且，通常仅单克隆抗体的话，则对于低浓度的测定对象的测定灵敏度较低。另外，胶乳凝集免疫比浊法中，在待测物中的测定对象(抗原)的浓度高的情况下，例如，若所述待测物的稀释率低，则稀释后的待测物(测定试样)中的测定对象的浓度依然4艮高，因此存在测定范围窄的问题。因此，胶乳凝集免疫比浊法无法像例如使用微芯片的测定方法那样应用于待测物稀释率低的测定方法中。
因此，本发明的目的在于提供一种例如可以抑制不溶性载体颗粒量和单克隆抗体量、提高对于低浓度范围的测定对象(抗
原)的测定灵敏度、能够在宽浓度范围对测定对象进行测定，并且，还能够应用于试验片等待测物分析用具的测定试剂，以及使用该测定试剂的免疫比浊法和待测物分析用具。
为了达成所述目的，本发明的测定试剂的特征在于，其为用于免疫比浊法的测定试剂，所述测定试剂包含含有多个负载有抗体的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群，
所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群，
所述平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群中，至少
l种不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
其他种类的不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
本发明的免疫比浊法的特征在于，该方法使用了具有不溶性载体颗粒群的测定试剂，所述不溶性载体颗粒群含有多个负载有抗体的不溶性载体颗粒，
通过使作为抗原的测定对象与所述抗体反应，从而使所述不溶性载体颗粒群凝集，作为所述测定试剂，使用本发明的测定试剂。本发明的待测物分析用具的特征在于，其为用于免疫比浊
法的待测物分析用具，其具有基板和测定试剂，并且在所述基
板上配置有所述测定试剂，
所述测定试剂为本发明的测定试剂。
本发明人等为了达成所述目的，反复进行了一系列的研究。
结果发现，如果使用以下测定试剂作为测定试剂的话，则能够
以很少的颗粒量和单克隆抗体量对从低浓度至高浓度的测定对
象(抗原)进行测定，从而完成了本发明。该测定试剂为包含不溶性载体颗粒群，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群，其中，至少l种不溶性载体颗粒群负载有多克隆抗体和单克隆抗体，其他的不溶性载体颗粒群负载有所述两种抗体中的至少一种抗体。根据本发明，能够在很宽的浓度范围对测定对象进行定量，而且，能够高灵敏度地测定低浓度的测定对象。另外，根据本发明，能够利用待测物分析用具等，并且能够降低成本。


图l为示出本发明的实施例中使用各种测定试剂对CRP浓度和吸光度变化量的关系进行测定的结果的图。
图2为示出本发明的其他实施例中使用各种测定试剂对CRP浓度和吸光度变化量的关系进行测定的结果的图。
图3为本发明的待测物分析用具的一个例子，(A)为所述待测物分析用具的平面图，(B)为所述(A)中所示的待测物分析用具的从I - I方向所观察的截面图。
图4为示出本发明的其他实施例中使用配置有千系测定试剂的待测物分析用具对CRP浓度和吸光度变化量的关系进行测定的结果的图。
附图标记说明
1 待测物分析用具
2a 上基板
2b 下基板
3 试剂部
4 测定部5a、 5b 流路
6 测定试剂
7 贯通孔、导入口
8 开口部
具体实施方式
本发明的测定试剂中，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，
所述2种不溶性载体颗粒群中，优选平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
优选平均粒径大的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。另外，本发明的测定试剂不限于上述形态，例如，也可以为以下形态。
即，也可以是以下形态本发明的测定试剂中，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，
所述2种不溶性载体颗粒群中，平均粒径大的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
本发明的测定试剂中，所述不溶性载体颗粒可以为胶乳颗
粒o
本发明的测定试剂中，用于致敏所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒的、所述多克隆抗体和所述单
克隆抗体的抗体浓度比优选为1: 9~7: 3。
本发明的待测物分析用具中，用于致敏所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒的、所述多克隆抗体和所述单克隆抗体的抗体浓度比优选为1: 9~7: 3。本发明的待测物分析用具，例如，可以为试^r片、测试盒(cartridge)和微芯片中的任意一种。
以下，对本发明进行详细说明。但是，本发明不限于此。
<免疫比浊法>
本发明的免疫比浊法，如前所述，其特征在于，该方法使用了具有不溶性载体颗粒群的测定试剂，所述不溶性载体颗粒群含有多个负载有抗体的不溶性载体颗粒，通过使作为抗原的测定对象与所述抗体反应，从而使所述不溶性载体颗粒群凝集，作为所述测定试剂， -使用本发明的测定试剂，即，4吏用如下测定试剂作为所述测定试剂包含含有多个负载有抗体的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群，所述不溶性载体颗粒群包含平
均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群，所述平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群中，至少l种不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，
有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
本发明中，只要使用2种以上平均粒径不同的不溶性载体颗粒群即可，例如，用以往一^知的^见定的方法求算平均粒径时，优选使用显示为不同平均粒径的2种以上的不溶性载体颗粒群。本发明中，"平均粒径"的种类没有特别限定，但通常可以列举数均粒径、长度平均粒径、平均(体积-面积)粒径(Volume-Surface meandiameter )、 质量平均粒径、体积平均粒径、表面积平均3f立;f圣、比表面积等^f介4立4圣(equivalent specificsurface diameter )、中值粒径、众数径等，这些平均粒径的测定可以采用各自分别对应的公知的测定方法。另外，也可以使用
能通过筛孔大小不同的2种筛子进行分类的2种以上的不溶性载
体颗粒群。
另外，本发明中，"所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群，，也可以指例如在测定所使用的全部不溶性载体颗粒的粒径分布时，直方图中显示2个以上的峰。即，本发明中，"包含平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群的所述不溶性载体颗粒群"可以指例如"其粒度分
ii布具有2个以上的峰的不溶性载体颗粒群"。另外，作为所述粒
度分布的测定方法，可以列举例如4吏用光学显凝:4竟或电子显凝: 镜的显微镜法、光散射法、遮光法、激光衍射法、电阻法、电 感带法(electric sensing zone method )、 筛分法、液相沉降法、 离心沉降法、惯性碰撞法等。另外，也可以从这种粒度分布算 出平均粒径。
另外，以各自的平均粒径作为基准，所述不溶性载体颗粒 群中所含有的平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群例 如可以含有粒径为平均粒径±15%的颗粒，优选含有粒径为平 均粒径士5 %的颗粒。
所述平均粒径不同的不溶性载体颗粒群的种类只要为2种 以上，则没有特别限定，例如为2 5种，优选为2 3种，更优 选为2种。
所述不溶性载体颗粒群的所述平均粒径没有特别限定，例 如为0.03 2fim, 4尤选为0.05 ~ lpm,更^尤选为0.07 ~ 0.5fim。本 发明中，例如，4吏用平均粒径不同的2种颗粒群的情况下，所述 平均粒径小的颗粒(以下，称为"小颗粒"。)群的所述平均粒径 例^口为0.03 ~ 0.2|im， ^尤选为0.05 ~ 0.15fim, 更4尤选为0.07 ~ 0.12|xm,相同情况下，所述平均粒径大的颗粒(以下，称为"大 颗粒"。)群的所述平均粒径没有特别限定，例如为0.08 ~ 2fim， 优选为0.1 liim，更优选为0.12~ 0.5pm。
作为所述不溶性载体颗粒的材质，没有特别限定，可以使 用例如合成高分子等有机化合物、多孔玻璃、硅胶等无机化合 物等。所述不溶性载体颗粒的形态没有特别限定，可以列举例 如胶乳颗粒、珠、板等，优选胶乳颗粒。
作为所述胶乳颗粒的材质，没有特别限定，可以列举例如 聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-丙烯酸酯共聚物等。另外，所述胶乳颗粒例如也可以在颗粒表面附加官能团等。 作为所述官能团，可以列举例如羧基、氨基、磺基、曱醇基、 酰氨基等。
本发明中，所述2种以上的不溶性载体颗粒群中，如前所述， 至少l种不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆 抗体和单克隆抗体两者，与其平均粒径不相同的其他不溶性载 体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体 中的至少任一者。后者的颗粒群，例如，可以仅负载多克隆抗 体和单克隆抗体中的任一者，也可以负载两者，优选多克隆抗 体、或多克隆抗体与单克隆抗体两者，更优选所述两者。本发 明中，使用平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群的情况下，例 如，可以使所述小颗粒负载多克隆抗体和单克隆抗体两者，使 所述大颗粒负载多克隆抗体和单克隆抗体中的至少任一者。另 外，也可以与之相反，例如，使所述小颗粒负载多克隆抗体和 单克隆抗体中的至少任一者，使所述大颗粒负载多克隆抗体和 单克隆抗体两者。其中，所述小颗粒优选负载多克隆抗体和单 克隆抗体两者，所述大颗粒优选负载多克隆抗体或单克隆抗体 中的至少任一者，更优选负载多克隆抗体、或多克隆抗体与单 克隆抗体两者。
负载有多克隆抗体和单克隆抗体两者的所述不溶性载体颗 粒中，所负载的所述多克隆抗体与单克隆抗体的比率没有特别 限定。作为具体例子，在所述小颗粒的情况下，多克隆抗体 单克隆抗体例如优选为l: 9~7: 3,更优选为l: 9~5: 5。另 一方面，在大颗粒的情况下，所述多克隆抗体单克隆抗体例 如优选为l: 9~5: 5。另外，所述不溶性载体颗粒所负载的所 述多克隆抗体与单克隆抗体的比率例如为重量比或抗体分子数 的比。
13定，例如可 以用抗体致壽丈所述颗粒而进行。所述抗体对所述颗粒的致l丈反 应没有特别限定，可以使用例如物理吸附法或化学结合法等公 知的方法等而适当实施。另外，在所述不溶性载体颗粒的表面 附加有所述官能团的情况下，例如，可以在对所述官能团进行 了活化处理后，进行所述致敏反应。
在所述致敏反应时，所述不溶性载体颗粒的浓度没有特别 限定。所述不溶性载体颗粒的浓度是指例如，在进行用所述 抗体致敏所述不溶性载体颗粒的反应时，致敏反应液中的不溶
性载体颗粒的浓度。所述不溶性载体颗粒浓度例如为0.001 ~ 5w/v%, ^尤选为0.01 ~ 2w/v% ，更4尤选为0.1 ~ lw/v% 。
所述致敏反应中，多克隆抗体或单克隆抗体相对于所述不 溶性载体颗粒的浓度没有特别限定，例如，可以根据所述不溶 性载体颗粒的浓度而适当决定。所述抗体的浓度是指例如， 在进行所述抗体致敏所述不溶性载体颗粒的反应时，致敏反应 液中的抗体的浓度。使所述大颗粒负载多克隆抗体的情况下， 例如，含有lw/v。/c不溶性载体颗粒的所述反应液中的所述多克 隆抗体的浓度例A。为0 ~ 2mg/mL, <尤选为0.001 ~ 2mg/mL,更 优选为0.005 ~ 1.5mg/mL,进一 步优选为0.01 ~ lmg/mL。另夕卜， 使所述大颗粒负载单克隆抗体的情况下，例如，含有lw/v。/。不 溶性载体颗粒的所述反应液中的所述单克隆抗体的浓度优选为
0 ~ 2mg/mL,更优选为0 ~ 1.5mg/mL,进一 步优选为0 ~ lmg/mL。 另一方面，使所述小颗粒负载多克隆抗体的情况下，例如，含 有lw/v%不溶性载体颗粒的所述反应液中的所述多克隆抗体的 所述4元体;农度例^口为0 2mg/mL, <尤选为0.001 ~ 2mg/mL,更 优选为0.005 ~ lmg/mL，进一 步优选为0.01 ~ 0.5mg/mL。另夕卜， 使所述小颗粒负载单克隆抗体的情况下，例如，含有lw/v。/。不20
溶性载体颗粒的所述反应液中的所述单克隆抗体的浓度，例如
为0 ~ 2mg/mL , 优选为0.001 ~ 2mg/mL ， 更优选为0.005 ~ 1.5mg/mL,进一 步优选为0.01 ~ lmg/mL。
使所述不溶性载体颗粒负载多克隆抗体和单克隆抗体两者 的情况下，所述致敏反应时的所述全部抗体的浓度没有特别限 定。使所述小颗粒负载两种抗体的情况下，例如，含有lw/v。/。 不溶性载体颗粒的所述反应液中的全部抗体的浓度例如为 0.001 ~ 5mg/mL , 优选为0.01 ~ lmg/mL , 更优选为0.1 ~ 0.5mg/mL。使所述大颗粒负载两种抗体的情况下，例如，含有 lw/v%不溶性载体颗粒的所述反应液中的全部抗体的浓度例如 为0.001 ~ 5mg/mL , 优选为0.01 ~ 2mg/mL , 更优选为0.1 ~ lmg/mL。
另外，如前所述，使所述不溶性载体颗粒负载多克隆抗体 和单克隆抗体两者的情况下，所述致敏反应时，所述多克隆抗
特别限定。所述抗体浓度比是指例如，在进行所述两抗体致 敏所述不溶性载体颗粒的反应时，致壽丈反应液中的所述两抗体 浓度比(多克隆抗体单克隆抗体)。另外，所述抗体浓度比例 如为重量比。使所述大颗粒负载所述多克隆抗体和单克隆抗体 的情况下，例如，含有lw/v。/。不溶性载体颗粒的所述反应液中 的所述多克隆抗体与所述单克隆抗体的抗体浓度比没有特别限 定，例如优选为l: 9~5: 5。另一方面，使所述小颗粒负载所 述多克隆抗体和所述单克隆抗体的情况下，例如，含有lw/v。/。 不溶性载体颗粒的所述反应液中的所述多克隆抗体与所述单克 隆抗体的浓度比例如优选为1: 9~7: 3,更优选为l: 9~5: 5。 作为所述抗体，只要是与作为测定对象的抗原发生抗原抗 体反应的抗体即可，可以列举例如Fab、 Fab，、 F(ab，)2等抗体片段、免疫球蛋白分子等。所述多克隆抗体可以使用以往公 知的方法从例如小鼠、兔、山羊、绵羊、鸡等来源的血清中采 集，或者也可以是市售的各种抗体。另外，所述单克隆抗体也 没有特别限定，例如，可以使用市售的各种抗体，也可以适当 使用通过采用了细胞融合技术或基因重组技术等公知方法而制 作的抗体。
接着，就本发明的免疫比浊法，示出具体方法的一个例子， 但本发明不限于此。
首先，使用前述2种以上的不溶性载体颗粒群，使这些颗粒 所负载的抗体与待测物中的测定对象(抗原)发生抗原抗体反 应，使所述不溶性载体颗粒群凝集。
作为所述测定对象(抗原)，只要可以发生抗原抗体反应， 则没有任何限制。作为具体例子，可以列举例如C反应性蛋白、 ASO (抗《连球菌溶血素0 )、类风湿因子、HbAlc、肌酐、肝炎 病毒、各种酶等。
含有所述测定对象(抗原)的待测物没有特别限定，可以 列举例如临床检查中的一般的待测物。作为所述待测物，可以 列举例如全血、血细胞、血清、血浆、尿等生物试样。本发明 中，例如，可以将所采集的所述待测物直接作为测定试样使用， 也可以将在抗原抗体反应之前预先对待测物实施了稀释处理、 过滤处理、加热处理等的待测物作为测定试样^吏用。作为用于 所述稀释处理的溶剂，没有特别限定，可以列举水、生理盐水、 緩冲液等。作为所述緩冲液的緩冲剂，例如，只要不妨碍所述 反应即可，可以列举例如MES(2-(N-吗啉代)乙石黄酸)、磷酸、 三羟甲基氨基甲烷(Tris)等。所述緩冲液中例如还可以添加 其他成分，例如，为了稳定反应，可以添加BSA (牛血清白蛋 白)等。另外，所述稀释处理中的待测物的稀释率没有特别限定，例如，在使用后述那样的试验片的测定的情况下，也可以 为低稀释率，作为稀释率的具体例子，例如优选为5 100倍，
更优选为10 80倍，进一步优选为15 ~ 50倍。
作为使负载有所述抗体的不溶性载体颗粒与所述测定对象 (抗原)发生抗原抗体反应的方法，没有特别限定，例如，可 以使用/>知的方法。作为所述反应方法，例如，可以向所述测 定试样中添加分散有所述不溶性载体颗粒群的分散液而进行反 应，也可以向所述不溶性载体颗粒群中添加所述测定试样而进 行反应。后者的情况下，所述不溶性载体颗粒群例如可以是分 散液，也可以是干燥状态。作为所述后者的方法，例如可以应 用后述的试验片、微芯片、测试盒等待测物分析用具。具体而 言，将所述不溶性载体颗粒群以例如分散液或干燥状态预先配 置在基板的试剂部，向所述试剂部添加所述测定试样，从而能 够进行抗原抗体反应。
限定。所述不溶性载体颗粒浓度是指例如，在所述不溶性载 体颗粒的抗体与测定对象发生抗原抗体反应时，抗原抗体反应 液中的不溶性载体颗粒的浓度。作为所述不溶性载体颗粒浓度， 例如优选为O.Oll ~ lw/v% ,更优选为0.033 ~ 0.5w/v% ,进一步 优选为0.055 ~ 0.3w/v% 。另外，所述不溶性载体颗粒浓度中， 所述小颗粒群的所述颗粒浓度优选为O.Ol ~ 0.5w/v% ,更优选 为0.03 ~ 0.3w/v% ,进一步优选为0.05 ~ 0.2w/v% 。另夕卜，所述 不溶性载体颗粒浓度中，所述大颗粒群的颗粒浓度优选为 0.001 ~ 0.05w/v% ，更优选为0.003 ~ 0.04w/v% ，进一步优选为 0.005 ~ 0.03w/v% 。
所述抗原抗体反应时，所述小颗粒群的颗粒与所述大颗粒 群的颗粒的比例没有特别限定。作为具体例子，所述小颗粒群
17的颗粒与所述大颗粒群的颗粒的重量比优选为100: 1~1: 100， 更优选为10: 1-1: 10,进一步优选为5: 1~1: 5。
作为具体例子，以血液作为待测物，将用于通过免疫比浊 检测CRP的反应液的条件示于以下，但本发明不限于此。所述 抗原抗体反应时的所述不溶性载体颗粒浓度没有特别限定。所 述不溶性载体颗粒浓度是指例如，在所述不溶性载体颗粒的 抗体与测定对象发生抗原抗体反应时，抗原抗体反应液中的不 溶性载体颗粒的浓度。作为所述不溶性载体颗粒浓度，例如优 选为O.Oll ~ lw/v% ，更优选为0.033 ~ 0.5w/v% ，进一步优选为 0.055 ~ 0.3w/v% 。另外，所述不溶性载体颗粒浓度中，所述小 颗粒群的所述颗粒浓度^尤选为0.01 ~ 0.5w/v% ，更优选为0.03 ~ 0.3w/v%，进一步优选为0.05 ~ 0.2w/v% 。另夕卜，所述不溶性载 体颗粒浓度中，所述大颗粒群的颗粒浓度优选为0.001 ~ 0.05w/v%,更优选为0.003 ~ 0.04w/v% ，进一步优选为0.005 0.03w/v。/0。
接着，测定前述的抗原抗体反应。即，例如，通过检测由
度，乂人而测定所述抗原抗体反应。由此，可以间^妾地定量所述 测定对象。
作为所述抗原抗体反应的测定方法，没有特别限定，例如， 可以列举通过光学方法测定抗原抗体反应后的反应液的吸光度 或散射光等的方法。所述光学方法中，例如，可以z使用通用的 光学测定仪器。另外，测定结果的评价方法也没有特别限定， 例如，可以将所述抗原抗体反应的反应开始后一定时间内的吸 光度变化量作为指标。此时，作为所述反应开始后一定时间， 没有特别限定，优选反应开始后0 5分钟，更优选30 180秒， 进一步优选30 ~ 150秒。所述定量，例如，可以基于含有已知浓度的测定对象的标 准试样的标准曲线而进行。作为具体例子，首先，准备多种设 定为目标浓度范围的标准试样，使这些标准试样在同样的条件
下发生抗原抗体反应，检测其凝集程度。然后，由表示所述凝 集程度的吸光度等的测定值和所述已知浓度制作标准曲线，并 将待观'J物的测定值代入所述标准曲线，从而定量所述待测物中 的测定对象。
<测定试剂〉
本发明的测定试剂为用于本发明的免疫比浊法的测定试 剂，含有前述的所述不溶性载体颗粒群。本发明的测定试剂只 要含有前述的所述不溶性载体颗粒群，则其他构成和条件没有 任何限制。另外，只要没有特别表明，则如所述本发明的免疫 比浊法中所述。
本发明中，所述2种以上的不溶性载体颗粒群各自的含有比 例没有特别限定，例如，将本发明的测定试剂用于免疫比浊法
的免疫比浊法中所述那样的条件的方式而含有所述各颗粒群。
本发明的测定试剂，除了所述不溶性载体颗粒群以外，还 可以含有例如如前所述的缓冲剂、分散剂、稳定剂等。另外， 本发明的测定试剂例如可以是千燥体，也可以是液体。 <待测物分析用具〉
本发明的待测物分析用具，如前所述，其特征在于含有本 发明的测定试剂。具体而言，本发明的待测物分析用具的特征 在于，其为用于免疫比浊法的待测物分析用具，其具有基板和 测定试剂，并且在所述基板上配置有所述测定试剂，所述测定 试剂为本发明的测定试剂。本发明的待测物分析用具只要含有 本发明的测定试剂，则其他构成和条件没有任何限制。本发明的待测物分析用具中，所述测定试剂例如才艮据其形态，可以以 干燥体形式进行配置，也可以以液体(分散液)形式进行配置。 本发明的待测物分析用具的形态没有任何限定，可以列举 例如测试盒、试验片、微芯片等芯片等。所述待测物分析用具，
优选能够连接到例如用于#r测通过前述那样的抗原抗体反应的 凝集程度的通用的测定4义器上。作为所述测试盒，例如可以列 举以下形态所述基板具备配置有所述测定试剂的试剂槽。关 于所述测试盒，例如，在连接到所述测定仪器上之前或之后， 将测定试样导入配置有所述测定试剂的所述试剂槽，在抗原抗 体反应后，通过所述测定仪器，可以测定所述试剂槽内的凝集 程度。另夕卜，关于所述测试盒，例如，所述基斧反可以进一步具 有通过流^各而与所述试剂槽连结的反应槽。此时，可以向所述 试剂槽导入测定试样，使所述测定试样与所述测定试剂的混合 液通过所述流^各而移动到所述反应槽中，/人而测定所述反应槽 内的凝集程度。配置于所述测试盒的所述试剂槽中的所述本发 明的测定试剂，例如可以是液体(分散液)，也可以是干燥体。 另外，作为所述试验片，例如可以列举在长方形等的基板上 配置有具有本发明的测定试剂的试剂部的形态。作为所述试剂 部的材质，可以列举例如滤纸或各种聚合物制的多孔质体。这 种试验片，例如，将测定试样添加到配置有所述测定试剂的所 述试剂部，在抗原抗体反应后，通过所述测定4义器，可以测定 所述试剂部中的凝集程度。在所述试验片中，所述本发明的测 定试剂优选例如以干燥状态进行配置。例如，在将所述多孔质 体等配置于所述基板之前或之后，向所述多孔质体等供给分散 液状的所述测定试剂，然后将其干燥即可。另外，所述微芯片 等芯片例如可以列举以下形态所述基板具有试样的导入口 、 试剂部和流^各，所述导入口和所述试剂部通过所述流^各而连结。
20这种芯片，例如，^v所述导入口导入测定试样， -使所述测定试 样通过所述流^各向所述试剂部移动，在所述试剂部进行抗原抗 体反应后，通过所述测定4义器，可以测定所述试剂部内的凝集 程度。配置于所述芯片的所述试剂部的所述本发明的测定试剂， 例如可以为液体，也可以为干燥体。另夕卜，这些^f寺测物分析用 具的例如所述试剂部或试剂槽根据需要可以进 一 步含有用于检 测;疑集体的纟企测试剂。
以下，结合比较例而对本发明的实施例进行说明。另夕卜， 本发明不受以下的实施例和比较例的限制。
〔实施例1 〕
本例中，作为平均粒径不同的不溶性载体颗粒群，使用负 载有单克隆抗体和多克隆抗体的小颗粒群、和负载有多克隆抗
体的大颗粒群，通过下述A和B工序，调制测定试剂。 A.不溶性载体颗粒的调制
本例中，使用平均粒径0.096pm的羧基改性聚苯乙烯胶乳 颗粒(ceradyne， inc.制)作为所述小颗粒群的不溶性载体颗粒 (小颗粒)，使用平均粒径0.213pm的羧基改性聚苯乙烯胶乳颗 粒(ceradyne， inc.制)作为所述大颗粒群的不溶性载体颗粒(大 颗粒)。首先， 一边搅拌含有所述小颗粒的下述组成的活化液一 边混合，在室温(25°C )下反应l小时，使颗粒表面的官能团活 化。反应结束后，离心分离(6000rpm, 15分钟)，除去上清， 将活化了官能团的所述小颗粒悬浮于4mL 5Ommol/L MES緩冲 液(pH6.1)中，用超声波使其再分散，然后清洗。再次进行所 述清洗操作后，离心分离(6000rpm, 15分钟)，除去上清。使 用5Ommol/L MES緩沖液(pH6.1 )悬浮所获得的所述小颗粒， 用超声波使其再分散，获得小颗粒的胶乳分散液。另外，使所述胶乳分散液中的所述小颗粒的浓度为2W/V。/。。另一方面，使
与调制所述小颗粒的胶乳分散液同样，调制大颗粒的胶乳分散液。
(活^:液的组成) 试剂_最终浓度_
MES (pH6.1，同仁化学研究所制) 50mmol/L NHS水溶液※1 100mmol/L EDAC水溶液※2 1 .Ommol/L
羧基改性聚苯乙烯月交乳颗粒(10%溶液) lw/v%
※1 NHS ( N-羟基琥珀酰亚胺，大力，4 f义夕公司制) ※2EDAC( l-乙基-3-( 3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐， Sigma乂^司制)
接着，一边以不起泡的方式搅拌， 一边向所述小颗粒的胶 乳分散液2mL中添加下述组成的用于致敏小颗粒的抗体液 2mL,在室温(25°C )下反应l小时，进行对小颗粒的致敏反应。 下述组成中所示的浓度为致敏反应液中的各成分的最终浓度， 使所述致敏反应液中的小颗粒的最终浓度为lw/v% 。另外，所 述致敏反应液中，使所述小颗粒负载的多克隆抗体与单克隆抗 体的浓度比(重量比)为多克隆抗体单克隆抗体=7: 3。
(用于致敏小颗粒的抗体液的组成) 组成 致敏反应时的最终浓度
MES(pH6.1,同仁化学研究所制) BSA ( Sigma公司制) 单克隆抗体液※1 多克隆抗体液※2
50mmol/L lmg/mL 0.12mg/mL 0.28mg/mL
※l兔来源的抗人CRP单克隆抗体液(抗体浓度10.5mg/mL，克隆号No.8, Immuno Probe Co.， Ltd.制)
※2兔来源的抗人CRP多克隆抗体液
(蛋白质浓度12.2mg/mL ,贝克尔(Becker )滴定度 3.5mg/mL， Oriental Yeast Co., ltd.制)
反应结束后，离心分离(6000rpm, 15分4f ),除去上清， 将致敏的所述小颗粒悬浮于50mmol/L MES緩冲液(pH6.1 ) 4mL 中，通过超声波处理使其分散，然后清洗。再次离心分离 (6000rpm, 15分钟)，除去上清后，将清洗后的所述小颗粒悬 浮于50mmol/L MES緩冲液(pH6.1) 2mL中，通过超声波处理 使其再分散。将再分散的所述小颗粒与封闭緩冲液(50mmol/L MES緩冲液(pH6丄)，4w/v。/。
BSA)2mL混合，通过超声波处 理使其分散后，在4。C下静置一晚，进行封闭处理。封闭处理结 束后，离心分离(6000rpm, 15分钟)，除去上清，4吏用下述组 成的分散液分散所述小颗粒，使小颗粒的分散浓度为3.33w/v % 。
(分散液的组成)
组成__
Tris画HCl ( pH7.5，大力，4 f ^夕公司制) 50mmol/L BSA ( Sigma乂A司制) lw/v% 皂角苷(大力，4r义夕公司制) 2.14w/v% D (-)甘露醇(大力，4 f1 X夕公司制) 2w/v%
另一方面，所述大颗粒使用下述组成的用于致敏大颗粒的 抗体液，使致敏反应液中的大颗粒的最终浓度为0.5w/v。/。，使 多克隆抗体的最终浓度为0.5mg/mL，不添加单克隆抗体，除此 以外与所述小颗粒同样地进行致敏反应，进而，使大颗粒的分 散浓度为1.67w/v% ，除此之外与所述小颗粒同样地分散于分散液中。所述致敏反应液中，使所述大颗粒负载的多克隆抗体与单克隆抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体单克隆抗体=
10: 0。另外，下述组成所示的浓度表示致敏反应液中的各成分的最终浓度。
(用于致每丈大颗粒的抗体液的组成)
组成_致敏反应时的最终浓度
MES (pH6.1,同仁化学研究所制) 5Ommol/LBSA ( Sigma7i^司制) lmg/mL多克隆抗体液※ 0.5mg/mL※兔来源的抗人CRP多克隆抗体液
(蛋白质浓度12.2mg/mL ,贝克尔(Becker )滴定度3.5mg/mL, Oriental Yeast Co., ltd.制)B.测定试剂的调制
首先，将所调制的所述含有小颗粒的分散液和所述含有大颗粒的分散液按照所述小颗粒与所述大颗粒的浓度比(重量比)为10: l进行混合，获得胶乳混合液。然后，用所述分散液稀释所述胶乳混合液，〗吏所述小颗粒浓度为0.372w/v。/a ,所述大颗粒浓度为0.036w/v。/Q ，调制本例的测定试剂。另夕卜，所述胶乳混合液中，所述小颗粒与所述大颗粒的重量比为小颗粒大颗粒=10: 1。
〔实施例2〕
在小颗粒的致敏反应中，使致敏反应液中的多克隆抗体液和单克隆抗体液的最终浓度分别为0.2mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地调制本例的测定试剂。另夕卜，所述致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体单克隆抗体=5: 5。〔实施例3〕在小颗粒的致壽文反应中，使致敏反应液中的多克隆抗体液
的最终浓度为0.12mg/mL ,使单克隆抗体液的最终浓度为0.2 8 mg/mL,除此之外与所述实施例1同样地i调制本例的测定试剂。另外，所述致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体单克隆抗体=3: 7。〔实施例4〕
在小颗粒的致每丈反应中，^吏致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.04mg/mL ,使单克隆抗体液的最终浓度为0.3 6mg/mL ，除此之外与所述实施例1同样地调制本例的测定试剂。另外，所述致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体单克隆抗体=1:9。〔比较例1 〕
本例的测定试剂中，使小颗粒仅负载多克隆抗体。具体而言，在小颗粒的致敏反应中，使致敏反应液中的多克隆抗体的最终浓度为0.4mg/mL (未添加单克隆抗体)，除此之外与所述实施例1同样地调制本例的测定试剂。另夕卜，所述致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体单克隆抗体==10: 0。〔比较例2〕
本例的测定试剂中，使小颗粒仅负载单克隆抗体。具体而言，在小颗粒的致敏反应中，使致敏反应液中的单克隆抗体的最终浓度为0.4mg/mL (未添加多克隆抗体)，除此之外与所述实施例1同样地调制本例的测定试剂。另夕卜，所述致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比为多克隆抗体单克隆抗体=0: 10。
使用所述实施例1~4、比较例1和2的测定试剂，如下所述，通过免疫比浊法进行CRP的测定。CRP使用的是高纯的C反应性说明书第22/29页
蛋白抗体(C-Reactive Protein Antigen, High Pure) ( Capricon
公司制)。
即，首先，将所述CRP用稀释液(50mniol/L Tris=HCl(pH7.5), 100mmol/LNaCl (大力，4亍X夕公司制)，lw/v%BSA)一希释，调制^见定浓度(0、 0.05、 0.1、 0.15、 0.5、 1、 2.5、5、 10、 20mg/100mL)的CRP溶液(待测物)。然后，将所述各CRP溶液(待测物)用所述稀释液进一步稀释至1.66倍，调制测定试样。向所述各测定试样6jiL中添加反应緩冲液(1.28w/v%NaCl) 63(iL和所述各测定试剂21jiL,在37。C下^f吏其反应。反应开始(添加)后5分钟，使用自动通用测定仪器(商品名Bio-majesty ( BM-8 )，日本电子司制)测定所述反应液的658nm处的吸光度。然后，从所述反应开始150秒后的吸光度测定值减去所述反应开始30秒后的吸光度测定值，算出吸光度的变化量，将该变化量用于测定评价。另外，所述反应液中的胶乳颗粒浓度为所述小颗粒的所述浓度为0.087w/v。/。，所述大颗粒的所述浓度为0.008w/v % , 全部胶#L颗粒的浓度为0.095w/v% 。
图l的图中示出了通过实施例1 ~ 4、比较例l和2的测定试剂的测定结果。该图中，横轴为各CRP溶液(待测物)的CRP的浓度(mg/100mL),纵轴为各CRP浓度下的所述吸光度的变化量。另外，该图的图中，各实施例和比较例的图标为实施例l为令，实施例2为A，实施例3为國，实施例4为參，比较例l为o,比较例2为口。如该图中所示，在使用使所述小颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体两者的实施例1 ~ 4的测定试剂时，伴随CRP浓度的增加，吸光度的变化量增大。与其相对，在使用使所述小颗粒仅负载任一者的抗体的比较例的测定试剂时，若CRP浓度超过10mg/100mL,则比较例2中吸光度变化量几乎没 26有变化，比较例l中则反而减少了。这样表明通过使所述小颗粒负载多克隆抗体和单克隆抗体两者，能够在从低浓度至高浓度的很宽的浓度范围内，以高灵敏度进行测定。并且，如使用了实施例1 ~ 4的测定试剂的测定结果所示，通过改变负载的多克隆抗体和单克隆抗体的比例，能够容易地调整灵敏度。另夕卜，
即使所述反应液中的所述CRP溶液(待测物)的稀释率为非常低的约25倍，在使用实施例l ~ 4的测定试剂时，随着CRP浓度的增加，吸光度变化量增大，可以获得良好的测定结果。此外，在使用减少了负载的单克隆抗体的比例的实施例1 ~ 4的测定试剂的测定中，与使用仅负载单克隆抗体的比较例2的测定试剂的情况相比，吸光度增加量变大，测定灵敏度均提高。〔实施例5〕
本例中，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.04mg/mL,使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL,除此之外与所述实施例l同样地进行小颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体单克隆抗体=1: 9。另一方面，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为0.25mg/mL,使单克隆抗体液的最终浓度为0.25mg/mL,除此之外与所述实施例1同样地进行大颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述大颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体单克隆抗体=5: 5。并且，将含有小颗粒的分散液与含有大颗粒的分散液按照所述小颗粒与大颗粒的浓度比(重量比)为5: l进行混合，用所述分散液进一步稀释，使所述小颗粒的浓度为0.417w/v。/。，所述大颗粒的浓度为0.083w/v % ，除此之外与所述实施例1同样地调制本例的测定试剂。
〔实施例6〕本例中，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为
0.04mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL，除此之 外与所述实施例l同样地进行小颗粒的致敏反应。另外，致敏反 应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克 隆抗体单克隆抗体=1: 9。另一方面，z使致每丈反应液中的多 克隆抗体液的最终浓度为0.15mg/mL,使单克隆抗体液的最终 浓度为0.35mg/mL，除此之外与所述实施例1同样地进行大颗粒 的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述大颗粒负载的抗体 的浓度比(重量比)为多克隆抗体单克隆抗体=3: 7。并且， 将含有小颗粒的分散液与含有大颗粒的分散液按照所述小颗粒 与大颗粒的浓度比(重量比)为5: l进行混合，用所述分散液 进一步稀释，使所述小颗粒的浓度为0.417w/vS ,所述大颗粒 的浓度为0.083w/v % ，除此之外与实施例1同样地调制本例的测 定试剂。
〔实施例7〕
本例中，使致敏反应液中的多克隆抗体液的最终浓度为 0.04mg/mL，使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL,除此之 外与所述实施例l同样地进行小颗粒的致敏反应。另外，致敏反 应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克 隆抗体单克隆抗体=1: 9。另一方面，z使致壽丈反应液中的多 克隆抗体液的最终浓度为0.1mg/mL,使单克隆抗体液的最终浓 度为0.4mg/mL ,除此之外与所述实施例1同样地进行大颗粒的 致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述大颗粒负载的抗体的 浓度比(重量比)为多克隆抗体单克隆抗体=2: 8。并且， 将含有小颗粒的分散液与含有大颗粒的分散液按照所述小颗粒 与大颗粒的浓度比(重量比)为5: l进行混合，用所述分散液 进一步稀释，使所述小颗粒的浓度为0.417w/v。/。，所述大颗粒的浓度为0.083w/v。/c)，除此之外与实施例l同样地调制本例的测
定^式剂。
〔实施例8〕
本例中，橫_致敏.良应液中的多克隆抗体的最终浓度为
0.04mg/mL,使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL,除此之 外与所述实施例l同样地进行小颗粒的致敏反应。另外，致每丈反 应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克 隆抗体单克隆抗体=1: 9。另一方面，^吏致每丈反应液中的多 克隆抗体液的最终浓度为0.05mg/mL,使单克隆抗体液的最终 浓度为0.45mg/mL,除此之外与所述实施例1同样地进4亍大颗粒 的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述大颗粒负载的抗体 的浓度比(重量比)为多克隆抗体单克隆抗体=1: 9。并且， 将含有小颗粒的分散液与含有大颗粒的分散液按照所述小颗粒 与大颗粒的浓度比(重量比)为5: l进行混合，用所述分散液 进一步稀释， -使所述小颗粒的浓度为0.417w/v。/。，所述大颗粒 的浓度为0.083w/v。/。，除此之外与实施例l同样地调制本例的测 定试剂。
〔实施例9〕
本例中，使致敏反应液中的多克隆抗体的最终浓度为 0.04mg/mL,使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL,除此之 外与所述实施例l同样地进行小颗粒的致敏反应。另外，致敏反 应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克 隆抗体单克隆抗体=1: 9。另一方面，使致壽丈反应液中的多 克隆抗体液的最终浓度为0.5mg/mL,不添加单克隆抗体，除此 之外与所述实施例l同样地进行大颗粒的致敏反应。另外，致敏 反应液中，使所述大颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多 克隆抗体单克隆抗体=10: 0。并且，将含有小颗粒的分散液与含有大颗粒的分散液按照所述小颗粒与大颗粒的浓度比(重
量比)为5: l进行混合，用所述分散液进一步稀释，使所述小 颗粒的浓度为0.417w/v。/。，所述大颗粒的浓度为0.083w/v。/0 ， 除此之外与实施例l同样地调制本例的测定试剂。
作为所述测定试剂，^吏用所述实施例5 ~ 9的测定试剂，关
颗粒的所述浓度为0.097w/v % ,使所述大颗粒的所述浓度为 0.019w/v% (全部胶乳颗粒浓度为0.116w/v。/。)，除此之外与前 述的实施例1 4、比较例1和2的测定同样，通过免疫比浊法进 行测定。
图2的图中示出了通过实施例5 ~ 9的测定试剂的测定结果。 该图中，横轴为各CRP溶液(待测物)的CRP的浓度
另外，各实施例在该图中的图标为实施例5为令，实施例6为 ■，实施例7为A，实施例8为參，实施例9为口。如该图所示，在 使用实施例5 ~ 9中任一者的测定试剂时，伴随CRP的浓度的增 加，吸光度的变化量均增大，能够在宽浓度范围进行测定。另 外，使用了使大颗粒负载所述两抗体的大颗粒的实施例5 8的 测定试剂的测定，与4吏用了仅负载多克隆抗体的实施例9的测定 试剂的测定相比，高浓度范围的测定灵敏度进 一 步提高。 〔实施例10〕
本例中，^使致敏反应液中的多克隆抗体的最终浓度为 0.04mg/mL,使单克隆抗体液的最终浓度为0.36mg/mL，除此之 外与所述实施例l同样地进行小颗粒的致敏反应。另外，致敏反 应液中，使所述小颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克 隆抗体单克隆抗体=1: 9。另一方面，与所述实施例l同样地 进行大颗粒的致敏反应。另外，致敏反应液中，使所述大颗粒负载的抗体的浓度比(重量比)为多克隆抗体单克隆抗体=
10: 0。另外，本例中，含有小颗粒的分散液和含有大颗粒的分 散液的调制，分别使用下述组成的分散液进行分散，使所述分 散液中的所述小颗粒的浓度为2w/v。/。，所述分散液中的所述大 颗粒的浓度为0.4w/v。/c),除此之外与实施例l同样地进行。并且， 将所述小颗粒的分散液与所述大颗粒的分散液按照1: 1的体积 比混合，调制下述组成的测定试剂。另外，本例的测定试剂中， 所述小颗粒与大颗粒的浓度比(重量比)为5: 1。
(分散液的组成) 组成 浓度
Tris-HCl ( pH7.5,大力，4 f义夕乂>司制)
BSA ( Sigma/^司制)
皂角苷(大力，4^义夕公司制)
蔗糖(大力，4亍义夕公司制)
(测定试剂的组成)
组成
200mmol/L 4w/v% 8.56w/v% 4w/v%
浓度
Tris-HCl ( pH7.5,大力，4 f义夕公司制) lOOmmol/L BSA ( Sigma^^司制) 2w/v% 皂角苷(大力，4^只夕公司制) 4.28w/v% 蔗糖(大力，4 f义夕公司制) 2w/v% 小颗粒(0.096jim) lw/v% 大颗粒(0.213pm) 0.2w/v%
接着，制作以下所示的本例的待测物分析用具l。图3示出 了本例的待测物分析用具l。图3的(A)为所述待测物分析用 具1的平面图，图3的(B)为从I-I方向观察该图的(A)的所 述待测物分析用具l的截面图。另外，该图为本例的待测物分析 用具l的概略图，整体和各结构的大小和比率等与实际不同。待测物分析用具l具备上基板2a和下基板2b,在所述下基板2b上层 压有所述上基板2a。所述下基板2b在长度方向的左端附近和中 央附近分别形成有凹部，前者成为配置测定试剂6的试剂部3 , 后者成为反应液的测定部4。所述下基—反2b中，所述试剂部3和 所述测定部4之间、以及所述测定部4和长度方向的右端部之间 分别形成有槽，这些槽通过所述上基板2a的层压而形成流路5a、 5b。另外，待测物分析用具l中，流路5b的右端的开口部8为与 用于使流路5a、 5b内部为负压的负压产生装置(例如，吸量管) 的连结部。另一方面，上基板2a在长度方向的左端附近、且与 所述下基板2b的试剂部3对应的部位具有贯通孔7,其成为测定 试样的导入口 7。上基板2a的材质为PET (聚对苯二甲酸乙二 酯)，下基板2b的材质为PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)。
本例中，首先，在下基板2b上层压上基板2a,使用吸量管， 通过所述导入口7向所述下基板2b的所述试剂部3添加所述测定 试剂2.45iiiL,在室温下干燥2小时后，在湿度1%以下的环境下 放置3天，制作待测物分析用具l。所述待测物分析用具l直到使 用时保存在装有硅胶的铝包中。
将血液采集到采血管中，离心分离后，除去血浆。将所获 得的血细胞用生理盐水清洗3次，调制洗净血细胞。另一方面， 向无CRP的血清(Biopool公司)中以头见定浓度(0、 0.2、 0.4、 20、 40、 80mg/100mL)添加CRP，调制CRP溶液。然后，向所 述无CRP的血清60)iL和所述洗净血细胞90iaL中添加所述CRP溶 液50iiL,使合计为200(iL。将该混合液200(iL中的25pL，使用 生理盐水600pL进一 步稀释至25倍，调制CRP-洗净血细胞溶液。 以此作为测定试样。所述CRP-洗净血细胞溶液中的CRP浓度分 别为0、 0.05、 0.1、 5、 10、 20mg/100mL。将所述CRP-洗净血 细胞溶液21 |iL滴入所述试剂部3 ，将干燥的所述测定试剂6悬浮。然后，立即通过连结到流路5b端部的开口部8的吸量管，向 图3的(B)的箭头方向吸引，使所述流路5b内部为负压，使所 述悬浮液移动到测定部4， -使CRP与本例的测定"^式剂反应。另夕卜， 所述反应时的所述悬浮液中的不溶性载体颗粒浓度为小颗粒 为0.117w/v。/。，大颗粒为0.023w/v。/。，总颗粒浓度为0.14w/v0/)。 以所述悬浮液移动到所述测定部4的时刻作为反应开始，在所述 反应开始l分钟后和4分钟后，使用分光光度计，对测定波长分钟后的吸光度减去所述反应开始l分钟后的吸光度，算出3分 钟的吸光度变化量。图4的图中示出所述吸光度变化量的测定结果。该图中，纵 轴为吸光度变化量， 一黄轴为CRP-洗净血细胞溶液中的CRP浓度 (mg/100mL)。如该图所示，在4吏用本例的待测物分析用具1 的测定中，伴随CRP的浓度的增加，吸光度的变化量增大，能 够在宽浓度范围进行测定。 产业上的可利用性本发明的用途可以列举例如临床检查或各种筛查等，其用 途不受限制，能够在很广泛的领域中使用。
权利要求
1.一种用于免疫比浊法的测定试剂，其特征在于，所述测定试剂包含含有多个负载有抗体的不溶性载体颗粒的不溶性载体颗粒群，所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群，所述平均粒径不同的2种以上的不溶性载体颗粒群中，至少1种不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，其他种类的不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
2. 根据权利要求l所述的测定试剂，其中，所述不溶性载 体颗粒群包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，所述2种不溶性载体颗粒群中，平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载 有多克隆抗体和单克隆抗体，有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
3. 根据权利要求l所述的测定试剂，其中，所述不溶性载所述2种不溶性载体颗粒群中，有多克隆抗体和单克隆抗体，平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载 有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
4. 根据权利要求l所述的测定试剂，其中，所述不溶性载 体颗粒为力交乳颗粒。
5. 根据权利要求2所述的测定试剂，其中，用于致敏所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒的所述多克隆抗体和所述单克隆抗体的抗体浓度比为1: 9~7: 3。
6. —种免疫比浊法，其特征在于，该方法使用了具有不溶 性载体颗粒群的测定试剂，所述不溶性载体颗粒群含有多个负 载有抗体的不溶性载体颗粒，通过使作为抗原的测定对象与所述抗体反应，从而使所述不溶性载体颗粒群凝集，作为所述测定试剂，使用权利要求l所述的测定试剂。
7. 根据权利要求6所述的免疫比浊法，其中，所述测定试 剂中的所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种不溶性 载体颗粒群，所述2种不溶性载体颗粒群中，平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载 有多克隆抗体和单克隆抗体，有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
8. 根据权利要求6所述的免疫比浊法，其中，所述测定试载体颗粒群，所述2种不溶性载体颗粒群中，有多克隆抗体和单克隆抗体，平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载 有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
9. 根据权利要求6所述的免疫比浊法，其中，所述测定试 剂中的所述不溶性载体颗粒为胶乳颗粒。
10. 根据权利要求7所述的免疫比浊法，其中，致敏所述平隆抗体和所述单克隆抗体的抗体浓度比为1: 9~7: 3。
11. 一种用于免疫比浊法的待测物分析用具，其特征在于， 其具有基板和测定试剂，并且在所述基板上配置有所述测定试 剂，所述测定试剂为；^又利要求1所述的测定试剂。
12. 根据权利要求ll所述的待测物分析用具，其中，所述 测定试剂中的所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种 不溶性载体颗粒群，所述2种不溶性载体颗粒群中，平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载 有多克隆抗体和单克隆抗体，有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
13. 根据权利要求ll所述的待测物分析用具，其中，所述 测定试剂中的所述不溶性载体颗粒群包含平均粒径不同的2种 不溶性载体颗粒群，所述2种不溶性载体颗粒群中，平均粒径大的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载 有多克隆抗体和单克隆抗体，平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒负载 有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。
14. 根据权利要求12所述的待测物分析用具，其中，致敏 所述平均粒径小的不溶性载体颗粒群中的不溶性载体颗粒的所 述多克隆抗体和所述单克隆抗体的抗体浓度比为1: 9~7: 3。
15. 根据权利要求ll所述的待测物分析用具，其中，所述 待测物分析用具为试验片、测试盒或微芯片。
全文摘要
提供一种用于免疫比浊法的测定试剂，该测定试剂可以抑制不溶性载体颗粒量和单克隆抗体量，提高对于低浓度范围的测定对象的测定灵敏度，能够在宽浓度范围对测定对象进行测定，并且，还能够应用于试验片等待测物分析用具。所述测定试剂包含平均粒径不同的2种不溶性载体颗粒群，其构成为其中一种不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体，另一种不溶性载体颗粒群中所含有的不溶性载体颗粒负载有多克隆抗体和单克隆抗体中的至少一种抗体。优选前者为平均粒径小的不溶性载体颗粒群，后者为平均粒径大的不溶性载体颗粒群。
文档编号G01N33/543GK101680891SQ20088001770
公开日2010年3月24日 申请日期2008年11月20日 优先权日2007年11月21日
发明者高木英纪 申请人:爱科来株式会社