专利名称：用于表征有色生物组织的方法和系统的制作方法
用于表征有色生物组织的方法和系统 本发明涉及用于表征含色素的生物组织的方法。本方面还涉及执行该方法的系统。 更具体地，本发明涉及用于表征生物实体(例如浆果)的组织的方法和系统，所述 的生物实体包括仅具有轻微的荧光性或不具有荧光性的第一发色化合物(例如，花色素苷 或黄铜醇)和第二荧光发色化合物(例如，叶绿素)。该表征的目的在于确定生物组织中第 一化合物的含量。对生物组织的这种表征是非常重要的。例如在制酒领域，葡萄中花色素 苷的含量代表了与其成熟度和从葡萄酿造的酒的质量相关的信息。在营养领域，水果和蔬 菜的表皮中黄铜醇的含量是其营养价值的指标。 文献FR 2 830 325公开了一种光学仪器，其能够通过屏蔽效应测量包括第一非
荧光的发色化合物和第二荧光发色化合物的生物组织样本的光吸收特性。该文献中公开的
方法包括对通过用具有不同波长的第一和第二辐射照射生物组织样本激励第二化合物而
产生的荧光进行测量。所谓的参考辐射被第一化合物稍微吸收或完全不吸收，而所谓的测
量辐射则被相对较好地吸收。通过测量由两个辐射产生的荧光并得到测得的荧光的比率，
该方法可测量样本的光吸收特性，并从而可测量生物组织中第一化合物的含量。 然而，第一非荧光的发色化合物的发展(development)会使对由第一辐射产生的
荧光辐射的测量达到饱和。当组织中第一化合物的浓度增大时，第一化合物对测量辐射的
吸收也增大。测量辐射产生的荧光辐射越来越弱，并且不再能与测量噪声区分开来。当组
织中第一化合物的浓度增大时，还可能会对参考辐射产生影响。在本发明中，将这些效果称
为"饱和"。 当前已知的大多数方法和系统都仅限于在达到饱和之前表征生物组织。这些系统 包括基于比色法的系统，不仅存在饱和的问题，这些系统还遇到了与沉积相关的问题，沉积 可出现在生物组织上并可影响测量。还可能记载了基于红外光谱学的系统，这些系统遇到 了与生物组织中水的存在相关的问题，并基于经验的化学计量推导确定在第一化合物中的 用于表征生物组织的其它方法和系统通过实验室中的稀释操作来避免饱和。这些 方法和系统的缺陷在于其破坏性。 本发明的目的在于提出一种新颖的方法和系统，允许以非破坏性且非侵入性的方 式超饱和地表征生物组织。 本发明的另一 目的在于提出一种新的方法和系统，允许原地对生物组织进行超饱 和表征。 因此，本发明提出了用于确定生物实体的组织中称为第一化合物的非荧光的发色 化合物的含量的方法，所述生物组织还包括称为第二化合物的荧光发色化合物，所述方法 包括以下操作的至少一次迭代-由发射装置向所述组织的方向发射称为测量光学辐射的第一辐射和称为参考光
学辐射的第二辐射，所述第一辐射和第二辐射中的每个都选择为产生所述第二化合物的荧 光辐射，所述第一辐射和第二辐射中的每个都被所述第一化合物部分吸收；
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_由测量装置测量所述第一辐射和第二辐射引发的所述荧光辐射；以及
-根据所述第一测量确定所述组织中所述第一化合物的含量。 根据本发明的方法的特征在于，还包括对测量饱和的至少一次补偿，所述测量饱 和是由于所述第一化合物对所述测量辐射的太高吸收而产生的，所述补偿包括为所述测 量辐射选择对应于所述第一化合物的吸收光谱中的较低吸收的波长。 因而，通过将测量辐射的波长朝向第一化合物的吸收光谱中较低吸收的波长移 动，根据本发明的方法可在由第一化合物的含量过高(即，第一化合物对测量辐射的吸收 过高)而导致超饱和时执行对生物实体的生物组织的表征。此外，由于无需在实验室内操 作，根据本发明的方法是非破坏性且非侵入性的，并可原地执行。 有利地，根据本发明的方法还包括由发射装置向所述生物组织的方向发射称为补 充光学辐射的第三光学辐射，所述第三光学辐射被选择为引发所述第二化合物的荧光辐 射。在这种情况下，根据本发明的方法包括测量由所述补充辐射引发的所述荧光辐射。该 测量用于确定所述参考辐射是否受到所述第一化合物的影响。事实上，根据参考辐射和补 充辐射这两个辐射所引发的荧光辐射的比率以及该比率的变化，可确定参考辐射是否受到 了第一化合物的影响。当探测到参考辐射被第一化合物影响时，必须执行饱和补偿，例如通 过将测量比率反转。 根据本发明的第一方面，当组织中第一化合物的含量增大从而使第一化合物影响 参考辐射时，在饱和后为所述测量辐射选择的波长对应于饱和前所述参考辐射的波长附近 的波长。根据本发明的第一方面，当出现饱和时，为所述参考辐射选择新的波长。为测量辐 射选择的所述新的波长可为饱和前参考辐射的波长。当所述生物组织和所述发射装置及所 述测量装置之间的距离固定时，不必使用参考辐射。然而，即使在饱和时，第一测量也能用 在测量比率中。 当所述生物组织和所述发射装置及所述测量装置之间的距离不固定时，在饱和后 为所述参考辐射选择的所述新的波长可对应于仅略微受到或者根本不受第一化合物的含 量影响的波长。更特别地，饱和后参考辐射的波长可对应于补充辐射的波长。
根据本发明的第二方面，当参考波长未受组织中第一化合物的含量的影响时，为 所述测量辐射选择的波长比限制波长对应于对所述第一化合物的更小吸收，对于所述限制 波长，在所述生物组织中所述第一化合物的期望最大含量的情况下将产生潜在的饱和。在 测量系列中，可确定第一化合物的潜在最大含量。根据该潜在最大值和第一化合物的吸收 光谱，可计算出可能获得的最大吸收。确定测量辐射的限制波长，其对应于最大吸收的饱 和。因而，如果为测量辐射选择的波长比限制波长对应于更小的吸收，在测量系列中则不会 产生测量辐射的饱和。限制波长可根据饱和峰值确定。在这种情况下，相对于饱和峰值选 择测量波长。这样，根据本发明的方法可包括确定相对于饱和峰值的偏移以避免饱和或获 得以更线性的方式发展的第一化合物的含量值。 根据本发明的第三方面，当参考波长不受组织中第一化合物的含量的影响时，可 在组织中的第一化合物引起测量饱和时执行饱和补偿，该补偿在每次饱和时重复执行。在 用具有例如对应于饱和峰值的第一波长的测量辐射执行了测量系列之后，当达到第一次饱 和时，可将测量辐射的波长朝向比第一波长对应于更低吸收的第二波长移动，以使第二波 长不产生测量饱和。然后可进行第二测量系列，直到达到新的饱和。然后，可将测量辐射的波长朝向比第二波长对应于更低吸收的第三波长移动，以此类推。在选择了新的波长后，可 考虑吸收差来计算组织中第一化合物的含量。该吸收差可通过研究第一化合物的吸收光谱 而获得，该吸收光谱提供用于所选的不同波长的校准值。
有利地，可将上述本发明的三个方面相结合。 有利地，根据本发明的方法可包括根据对所述第一化合物的吸收光谱和/或对所 述第二化合物的荧光光谱具有影响的物理化学特征，修改所述测量辐射和/或所述参考辐 射的波长。 这些物理化学特征是选自以下列表的特征
-所述生物组织的pH值；-所述生物组织中影响所述第一化合物的辅色效应；以及-所述生物组织中所述第二化合物的支持结构中的至少一个变化的效应。 还可根据生物组织中新化合物的出现(例如通过共价变化)修改测量辐射和/或
参考辐射的波长，修改第一化合物的吸收光谱或第二化合物的荧光光谱。 有利地，测量辐射(或参考辐射)可以预定强度发出，而参考辐射(或测量辐射)
则以可变强度发出，以使所述参考辐射和所述测量辐射中的每个引发的荧光辐射具有相等
的强度。 可根据控制信号调整所述第一辐射的强度，所述控制信号与由所述测量辐射和所 述参考辐射引发的荧光辐射相关。 此外，可通过相移以预定频率(例如可为lkHz)交替改变所述测量辐射和所述参 考辐射的强度。 有利地，根据本发明的方法可包括通过相位调制将发射装置发射的辐射同步。
每个测量辐射都可以脉冲形式发出。 确定所述第一化合物的含量可包括计算(由所述参考辐射引发的荧光)除以(由 所述测量辐射引发的荧光)得到的比率。 根据本发明的方法的有利特征，对所述荧光辐射的测量
_在采自生物实体的组织样本上执行；-或以非破坏性且非侵入性的方式，S卩，不采取样本，直接在所述生物实体上执行。
根据本发明的方法可有利地包括确定所述生物组织中所述第一化合物的含量随 时间的发展。该发展可根据时间单元(可为天)确定。例如，可表示为显示化合物含量随 所选时间单元的发展的图示。 在根据本发明的方法的第一方面的非限制性实施方式中，所述生物组织是葡萄果 皮；所述第一化合物是花色素苷；所述第二化合物是叶绿素。当组织和发射装置及测量装 置之间的距离固定时-饱和前所述测量辐射的波长为530nm ;
-饱和前所述参考辐射的波长为650nm ;
-所述补充辐射的波长为450nm ;
-饱和后所述测量辐射的波长为650nm ;
-饱和后无需参考辐射。 仍然在此实施例的情况下，当组织和发射装置及测量装置之间的距离不固定时
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-饱和前所述测量辐射的波长为530nm ;
-饱和前所述参考辐射的波长为650nm ;
-所述补充辐射的波长为450nm ;
-饱和后所述测量辐射的波长为650nm ;
-饱和后参考辐射的波长为450nm。 在这种情况下，葡萄果皮中花色素苷的含量可根据以下关系确定
ANTH船n前二 logFER_ANTH_GREEN-logFER_CHLG
ANTH船脂二 C+logFER_ANTH_RED-logFER_CHLK
其中， 1. logFER_ANTH_GREEN = log (FRF红/FRF绿)
2. logFER_ANTH_RED = log (FRF蓝/FRF红)
3. logFER_CHLG = log (FRF红/FRF绿)
4. logFER_CHLK = log (FRF蓝/FRF红)
在这些表达式中， 參FRF红对应于由以650nm发射的辐射(即，饱和前的参考辐射和饱和后的测量辐 射)引发的叶绿素的荧光辐射； 參FRF绿对应于由以530nm发射的辐射(g卩，饱和前的测量辐射)引发的叶绿素的 荧光辐射； 參FRF^g对应于由以450nm发射的辐射(即，饱和前的补充辐射和饱和后的参考辐 射)引发的叶绿素的荧光辐射； 參表达式3和式4对应于在葡萄果皮中出现花色素苷之前执行的至少一次测量。
用作在出现花色素苷之后执行的测量的参考；以及 參C是使饱和时刻的ANTH饱和后等于ANTH船。前的常量。 在根据本发明第三方面的另一非限制性实施例中，所述生物组织是葡萄果皮；所
述第一化合物是黄酮醇；所述第二化合物是叶绿素-饱和前所述测量辐射的波长约为375nm ;-饱和前所述参考辐射的波长约为650nm ;-饱和后所述测量辐射的波长约为450nm ;以及-饱和后参考辐射的波长保持约为650nm。 根据本发明的另一方面，提出了实现根据本发明的方法的系统。 根据以下附图和对非限制性实施方式的详细描述，本发明的其它特征和有益效果
将显而易见。
图1是根据本发明的系统的第一实施方式的图示；
图2是根据本发明的系统的第二实施方式的图示；
图3是根据本发明的第一实施方式中的测量原理的图示；
图4是根据本发明的第二实施方式中的测量原理的图示；
图5、6和7是根据本发明第二实施方式的系统的图示； 图8是根据本发明的方法的第一方面的叶绿素荧光光谱、花色素苷吸收光谱、黄 铜醇吸收光谱、以及使用的不同辐射和滤波器的表示；
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图9是根据本发明的方法的第一方面、在测量葡萄果皮中的花色素苷含量时获得 的结果的表示； 图10是根据本发明的方法的第二方面的叶绿素荧光光谱、花色素苷吸收光谱、以 及使用的不同辐射和滤波器的表示； 图11是根据本发明的方法的第二方面、在测量葡萄果皮中的花色素苷含量时获 得的结果的表示； 图12是根据本发明的方法的第一和第二方面的结合、在测量葡萄果皮中的花色 素苷含量时获得的结果的表示； 图13是花色素苷的吸收光谱的变体以及pH的函数的实例表示。 以下将描述的非限制性的实施方式涉及用于测量生物实体的组织中属于多酚族
的第一非荧光的发色化合物的含量的系统，该生物实体的组织还包括为叶绿素的荧光发色
化合物。对多酚的测量通过文献FR2 830 325中描述的叶绿素荧光法实现。 图1和图2是根据本发明的系统的两个实施方式的图示。在这两个实施方式中，
系统表现为两部分的形式发射部10和接收部20。在图1所示的第一实施方式中，发射部
10和接收部20分别设置在植物组织样本30的两侧，而在图2所示的第二实施方式中，发射
部10和接收部20设置在生物组织样本30的同一侧。 在任一实施方式中，发射部10包括照射生物样本30的前表面的三个辐射源11、 12和13。如图l和图2所示，源11至13中的每个与脉冲电源14至16中的一个相关联， 并由同步信号Ss控制。源11至13用于引发叶绿素的荧光。发射部lO还可包括位于源ll 至13与样本30之间的光学滤波器(未示出)，以将朝向样本30发射的辐射11至13中的 不期望成分过滤。 根据本发明的系统的接收部20包括与光学滤波器F2相关联的探测器21，即根据 探测到的荧光辐射提供电信号的硅光电二极管，光学滤波器F2位于样本30与探测器21之 间。滤波器F2的功能是-阻止来自激励源11至13的辐射通过探测器21 ;-部分地或完全地传送由源11至13发射的光学辐射引发的叶绿素荧光发射。
根据本发明的系统的接收部20还包括部件22，其包括控制及计算装置，一方面可 通过同步信号Ss执行电源14至14的同步，并可根据探测器21提供的测量信号Sm的函数 确定组织样本30中第一化合物的含量。 图3和图4分别是第一和第二实施方式中不同辐射的测量原理和光路的图示。参 照图3和图4，源11至13优选地为发光二极管(LED)并照射样本30的同一面31。源11 至13分别发射三个辐射111U21和131，旨在引发叶绿素33的荧光并分别引发三个荧光辐 射H2、122和132。在第一实施方式中，系统的接收部20相对于发射部IO位于叶或浆果 的相反侧，由叶绿素发射的荧光辐射朝向与源11至13相反的一侧并由探测器21探测。事 实上，在第一实施方式中，探测器21用来探测朝向样本的后表面35发射的荧光以测量多酚 34的含量。 图4示出了由辐射Hl、121和131引发并由叶绿素朝向源11、12和13发射的荧 光辐射H2、122和132。在第二实施方式中，系统的接收部20和发射部IO位于叶或浆果的 相同侧，由叶绿素发射的荧光辐射朝向源11至13并由探测器21探测。事实上，在第二实施方式中，探测器21用来探测朝向叶的前表面31发射的荧光以测量多酚34的含量。
无论在哪个实施方式中，源11至13中的每个的波长都根据待测量化合物的吸收 带、其技术特征(例如光谱纯度和功率)、其商用性和成本、以及与探测器21相关的滤波器 F2的商用性和成本而选择。 当荧光为各向同性时，第一和第二实施方式基本等同。第二实施方式是优选实施 方式，并可原地和远离待表征的生物组织使用根据本发明的系统。此外，在第二实施方式 中，根据本发明的系统能以非破坏性且非侵入性的方式直接用于生物实体，即，无需采取生 物组织的样本。 图5至7示出了根据本发明的系统的第二实施方式制造的装置50的不同视图，第 二实施方式是根据本发明的系统的优选实施方式。图5示出了装置50的前视截面图，图6 示出了其等距视图，图7示出了从侧面观察的另一截面图。装置50允许在包括多个浆果70 的葡萄串60上直接测量。 将称为MULTIPLEX⑧的实施方式基于由电池5121供电的便携盒510，电池 5121可远离手柄或集成在手柄中，盒510具有测量表面514和用户界面，用户界面包括屏幕 5152以及例如按钮或按键5101和5102的控制元件。该盒可由形成手柄512的部件支持， 手柄512包括可更换电池5121或远程便携电池的连接器。 盒510还包括圆柱形部件513，其朝向与界面相反的侧延伸并在其端部承载测量 表面。测量表面514由防护件5130围绕，防护件5130或多或少为不透明的并可能是可拆 卸的，从而可减少来自环境光的干扰，并在光学测量距离方面提供相对于测量表面514的 参考点。 测量表面514包括覆盖了待测量的荧光波长的一组探测器540。在本文描述的实 施方式中，探测器组540包括三个探测器541、542和543，三个探测器541、542和543相互 相邻且共同聚集在测量表面514中心处的等边三角形中。这三个探测器定向为关于探测轴 线5140相互平行，或关于探测轴线5140轻微收敛。探测器541、542和543中的每一个均 包括探测元件(这里是大约2cmX2cm的硅光电二极管5420)并分别探测确定的蓝绿、红光 和远红波常带内的光。探测带宽通过滤色器或高通滤波器以及干涉滤波器而获得。这两类 滤波器的组合允许了更好的过滤，这尤其是防止探测器接收激励源发射的辐射所需要的。
应该注意到，探测器直接接收待测量的荧光，而不使用用于会聚、收敛或准直的光 学器件。每个探测器都仅需要单一的探测元件，光电二极管5420(图7)，其选择为足够大以 便获得良好的灵敏度，从而可省去会聚光学器件。这样，探测元件可接收从激励发射器照射 的全部目标区域591发出的辐射549。 这种配置使得可用相对较小的探测元件，并且无需会聚光学器件。除了节省光学 器件的成本之外，还避免了尺寸需求、调整和景深约束。 测量表面514具有支撑几组发射器的凹圆锥外围表面，几组发射器可发射不同波 长的激励光并分布在探测器组540周围的圆上。 这些发射器包括紫外发射器组520，其包括六个UV发射器521至526，在绕探测器 组540的圆上分布为两个相邻的发射器为一组、每组间隔120°的三组发射器。
这些源中的每个均包括位于抛物线反射体5281中的源(这里是紫外LED 527)， 形成大约3(T的光束。反射体安装在基座5282上，基座5282确定其光束相对于探测轴线
105140的位置。可选地，UV发射器还可使用折射器件和反射折射器件来改进发射束的会聚。
发射器还包括可见光发射器组530，包括三个发射器531、532和533，其绕探测器 组540在与UV发射器组520相同的圆上分布为间隔120°并插入在UV发射器之间。每个 可见光发射器都包括这样的源，其包括红色LED、绿色LED和蓝色LED间隔设置的阵列，集成 在侧边测量近似为4. 5cm且功率为3 X 15W的公共组件534中，并由形成会聚微透镜阵列的 透明塑料板覆盖。该公共组件534安装在形成辐射体的块536上，其形状确定源相对于探 测轴线5140的朝向。发射器还包括宽通带的带通滤色器，从而可限制用于荧光探测的波长 内的发射，尤其是朝向远红的发射。 作为本文描述的RGB (红-绿-蓝)源的一种替代，可使用单色激励源，例如，连续 发射200W等级的功率的大功率单色LED阵列形式的琥珀色源。 激励发射器定向为即使在异质对象和/或三维的情况下也能对目标区域591实现 均匀照射。 在例如使用UV激励的短距离应用的实施方式中，发射器的射束定向为朝向探测 器541、542和543的轴线A541、A542和A543会聚。更具体地，激励射束的轴线A541、A542 和A543相互交叉并与探测轴线5140会聚于最佳测量距离处的同一点P5140。在所述的实 施方式中，会聚点P5140与探测器组540相距10到20cm，例如大约15cm。
发射的光束不会聚且显示一定的打开或发散可限制影响测量距离的约束。事实 上，当目标(这里是葡萄串60)位于发射器的射束529和539内时，其朝向探测器组540的 不同表面被均匀照射。这样，朝向探测器发射的荧光549则足够稳定和均匀以提供对测量 区域591的真实测量。 这样，尽管在大约15cm处用UV发射器进行测量，但可在更大距离处(甚至高达大 约lm处)执行仅使用可见光发射器的测量，例如用于测量花色素苷。 在其它实施方式中，发射器的射束可定向为平行于探测轴线，例如用于大距离测 量的应用。 图7更具体地示出了本发明的这一实施方式中的装置的结构。盒的圆柱形部件 513包含基本为环形的电子卡5131，其包括激励源的供电电路、激励源的管理电路和产生 电流发生器的电路。 探测器以及附随的电子器件共同聚合在圆筒形探测模块5400中，置于测量表面 514上由激励发射器形成的圆的中心处，并向待分析的目标的方向延伸。该圆筒的外表面载 有三个探测器541 、542和543。 这种配置使得可将探测器放置在与发射器的端部基本相同的水平面上，以使其具 有宽的接收范围并从而可与目标接近。 探测模块5400包括基本类似的三个小电子卡5141、5142和5143，这三个小电子卡 基本为圆形且沿其纵向轴线堆叠，并由小柱体5144固定和隔开。 第一小电子卡5141位于探测模块5400的外表面侧，承载探测元件(这里是硅光 电二极管)。对于每个探测器，硅光电二极管5420接收穿过滤色器或高通滤波器5421和 干涉滤波器5422的待探测的光，上述滤波器由保持螺母可拆卸地固定，该保持螺母位于 25. 4mm圆柱形开口中并从而可容纳标准的1英寸或25毫米滤波器。 从测量表面514移开的第二小电子卡5142携带电路和放大器通过负反馈环路消除环境光。 第三小电子卡5143携带尤其包含在跟踪保持单元中的电路和组件。 探测模块5400构成紧凑的装配件，其可从盒510移除，例如用于维护，或由相机模
块或包括一个或多个光学波导的模块替代。 该探测模块通过大电子卡5131中的开口连接于处理模块5151，处理模块5151位
于界面侧并包括处理装置的全部或一部分，尤其是采集单元和计算装置。 处理模块包括在盒上携带屏幕5152的部件515中，该部件可倾斜以便于阅读，并
可縮回到盒510中的隔室5105内。该处理模块可包括可拆卸的连接件，以允许其容易地更
换，例如用于更新或改变功能。 这样，连接于激励的电子器件5131、连接于探测器的电子器件5141至5143、和处 理模块5151设置在不同的分开的电子模块中，允许简化的维护。这些模块还间隔一定距 离，在这里是2cm和例如至少1.5cm，从而允许更好的散热并限制了这些模块中包括的电路 之间的干扰的风险。 在本文描述的实施方式中，探测与激励发射器发射的激励同步。具有520毫秒脉
冲的频率为lkHz的激励已成功使用，并允许在需要时实时处理且覆盖位置。在测量周期
内，交替进行建立含量或编程的索引所需的不同荧光测量。 因而，管理和处理装置被设置为-通过脉冲发射用于控制发射器的控制信号；-探测这些脉冲生成的荧光峰值，探测器内的放大使得通过负反馈环路拒绝环境 光；-通过例如相同的控制信号，控制对探测到的荧光峰值的处理，例如通过跟踪保持 单元而实现；以及-将荧光测量的模拟测量提供至采集单元。 在其它实施方式中，利用激励和探测之间的相位调制提供同步探测。这样，管理和 处理单元被设置为-根据包括相位调制的频率控制发射器；-在相位解调中处理荧光探测信号并提供荧光测量。 现在将根据本发明第一方面以可变的距离描述对葡萄果皮中的花色素苷(ANTH) 含量的确定。 图8以消光系数单位示出了 50%酸化甲醇中锦葵色素苷(葡萄中的主要花色素 苷)的吸收光谱82、叶绿素的发射光谱83、以及滤波器F2 (Schott RG9滤波器)的透射光 谱84。 源11是发射绿色(GREEN)辐射111的源，其波长处于花色素苷的吸收带内，该辐 射引发叶绿素33的荧光并引起荧光辐射112的发射。源111的波长例如可大约为530nm。 图8给出了辐射11的光谱86。 GREEN源的实例为Roithner Lasertechnik的NS530L 二极管。 源12发射花色素苷略微吸收或完全不吸收的红色(RED)辐射121，其引发叶绿素 33的荧光并引起荧光辐射122的发射，其用作测量花色素苷含量的参考。这一源的波长优 选地为650nm。图8给出了辐射121的光谱85。
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此外，源13发射花色素苷略微吸收或完全不吸收的蓝色(BLUE)辐射131，其引发 叶绿素33的荧光并引起荧光辐射132的发射，其用作测量花色素苷含量的补充参考。这一 源的波长优选地为450nm。图8给出了辐射12的光谱87。 源11、 12和13分别通过发射辐射111、 121和131接连照射组织30。根据花色素 苷含量34，辐射111被果皮的表皮以可变量吸收，而红光辐射121和蓝光辐射131则不被吸 收或仅略微吸收。辐射111U21和131都引发叶绿素33的荧光，然后分别发射红光或近红 外的荧光辐射112U22和132，其强度与叶绿素接收的辐射Hl、121和131的强度成比例。 测量源11和源12激发的荧光发射的比率可确定葡萄果皮中花色素苷的含量。此外，测量 源12和源13激发的荧光发射的比率可确定参考辐射12是否受到了含量随时间增大的花 色素苷的影响。当葡萄的花色素苷含量增大时，辐射lll被过度吸收并开始饱和。此外，花 色素苷还开始影响参考辐射。在这种情况下，为了在由过高浓度的花色素苷引起的超饱和 情况下进行测量，在饱和前作为参考辐射的辐射121在饱和后变为测量辐射，而在饱和前 作为补充辐射的辐射131在饱和后变为参考辐射。辐射lll不再用于测量。这样则可在超 饱和情况下执行花色素苷的含量测量。
然后，根据以下表达式计算花色素苷含量
ANTH船n前二 logFER_ANTH_GREEN-logFER_CHLG
ANTH船。后二 C+logFER_ANTH_RED-logFER_CHLK
其中， 1. logFER_ANTH_GREEN = log (FRF红/FRF绿)
2. logFER_ANTH_RED = log (FRF蓝/FRF红)
3. logFER_CHLG = log (FRF红/FRF绿)
4. logFER_CHLK = log (FRF蓝/FRF红) 在这些表达式中，logFER_CHLG = log (FRF红/FRF绿)，logFER_CHLK = log (FRF蓝/ FRF红)，logFEILCHLG和logFER_CHLK的量是在葡萄表皮中出现花色素苷之前测量的，ANTH 是以纳摩尔/平方厘米为单位的葡萄果皮中的花色素苷含量，FRFg、FRF"和FRF^分别是由 辐射111、 121和131引发的荧光辐射H2、122和132的强度，C是使得在饱和时刻ANTH饱和 后等于ANTH饱和前的常量。 图9示出了根据本发明的第一方面确定的、葡萄果皮中测量的花色素苷含量的发 展的示意图。轴线91表示开始执行饱和补偿的时间。曲线92示出了根据本发明的饱和补 偿，即，将饱和前的参考辐射在饱和后作为测量辐射并将饱和前的补充辐射在饱和后作为 参考辐射，获得的结果。曲线93示出了不执行饱和补偿获得的结果。因此，应该注意到，在 不执行饱和补偿的情况下，获得的曲线93在饱和后减小，而花色素苷含量继续增大。通过 补偿，实际获得增大的曲线92，表明了葡萄果皮中花色素苷含量的增大。
现在将根据本发明第二方面以可变的距离描述对葡萄果皮中的花色素苷含量的 确定。根据第二方面，辐射121的波长为650nm保持不变。另一方面，辐射111的波长选择 为590nm。与根据本发明的第一方面选择的波长530nm对应于花色素苷的吸收峰值相比，这 一波长对应于花色素苷的较低吸收。图10示出了在本发明第二方面中使用的50%酸化甲 醇中锦葵色素苷(期望确定含量的花色素苷)的吸收光谱82、叶绿素的发射光谱83、以及 滤波器F2的透射光谱84、辐射121的光谱85和辐射111的光谱88。
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本发明第二方面的测量原理与本发明第一方面的测量原理基本类似。源11和12 分别通过发射辐射111和121接连照射组织30。根据花色素苷含量34，辐射111被果皮的 表皮以可变量吸收，而红光辐射121则不被吸收。辐射111和121引发叶绿素33的荧光， 然后分别发射被测量的荧光辐射112和122。然而，由于为辐射121选择的590nm的波长 对应的吸收低于上文所述在本发明第一方面中为辐射121选择的530nm的波长所对应的吸 收，因此，不会由于葡萄果皮中花色素苷含量的增加而导致饱和。图11示出了
參第一曲线1111，其示出了用波长530nm的辐射121执行的测量随葡萄果皮中的 花色素苷含量的变化；以及 參第二曲线1112，其示出了用波长590nm的辐射121执行的测量随葡萄果皮中的 花色素苷含量的变化。波长590nm比波长530nm对应于对花色素苷更低的吸收。应该注意到，对于530nm 的波长(曲线llll)，很快就达到饱和，而对于590nm的波长(曲线1112)，则不出现饱和。 此外，在曲线1112的情况下获得的结果比曲线1111的情况下获得的结果更加线性。
有利地，可将本发明的第一和第二方面结合。事实上，上述的补充辐射131可用于 确定参考辐射121是否受到花色素苷的影响。当花色素苷的浓度或含量使得即使在辐射 111的波长相对于吸收峰值(例如590nm)偏移的情况下也出现饱和时，可将饱和前为参考 辐射的辐射121在饱和后作为测量辐射，并将饱和前为补充辐射的辐射131在饱和后作为 参考辐射。图12示出了将本发明的第一和第二方面结合而获得的结果。曲线1201对应于 用以下辐射进行测量的结果
-530nm的辐射111，
-650nm的辐射121，以及
-450nm的辐射131 ; 曲线1201对应于用以下辐射进行测量的结果
-590nm的辐射111，
-630nm的辐射121，以及
-450nm的辐射131。 轴线1203表示根据本发明的第一方面开始执行饱和补偿的时间。
此外，辐射111U21和131的波长可根据期望表征的生物组织的pH值的变化而修 改。图13示出了 pH = 1时花色素苷的吸收光谱1301以及pH = 8时花色素苷的吸收光谱 1302。应该注意到，当pH值增大时，吸收峰值向更高波长偏移。不论执行本发明的哪一方 面，在饱和补偿中都可考虑吸收光谱的这种变化。 现在将简单描述根据本发明第三方面对葡萄果皮中的黄酮醇(FLAV)含量的测 量。在这种情况下，源11是发射紫外线(UV)辐射111的源，该辐射的波长处于黄酮醇的吸 收带内，其引发叶绿素33的荧光并引起荧光辐射112的发射。源11的波长例如可为375nm 左右。源12可发射650nm的参考辐射121，该波长对应于不被黄酮醇吸收的波长。当果皮中 的黄酮醇含量使测量辐射111饱和时，可使用对应于黄酮醇吸收光谱中较低吸收的450nm 的测量辐射。450nm的这一辐射例如可由源13发射。参考辐射不修改，而是保持为650nm。
本发明还可用于测量发色且具有轻微荧光性或不具有荧光性的其它化合物的含 量，例如番茄中的番茄红素。
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本发明不限于以上描述的实施例，并可用于表征任何类型的生物组织。
权利要求
用于确定生物实体的组织(30)中称为第一化合物的非荧光的发色化合物(34)的含量的方法，所述生物组织(30)还包括称为第二化合物的荧光发色化合物(33)，所述方法包括以下操作的至少一次迭代-由发射装置(11，12)向所述组织(30)的方向发射称为测量光学辐射的第一辐射(111)和称为参考光学辐射的第二辐射(121)，所述第一辐射和第二辐射(111，121)中的每个都选择为产生所述第二化合物(33)的荧光辐射，所述第一辐射和第二辐射(111，121)中的每个都被所述第一化合物(34)部分吸收；-由测量装置(21，22)测量所述第一辐射和第二辐射(111，121)引发的所述荧光辐射(112、122)；以及-根据所述第一测量确定所述组织(30)中的所述第一化合物(34)的含量，其特征在于，所述方法还包括对测量饱和的至少一次补偿，所述测量饱和是由于所述第一化合物(34)对所述测量辐射(111)的太高吸收而产生的，所述补偿包括为所述测量辐射选择对应于所述第一化合物(34)的吸收光谱中的较低吸收的波长。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，还包括由发射装置(13)向所述生物组织 (30)的方向发射称为补充光学辐射的第三光学辐射(131)，所述第三光学辐射被选择为引 发所述第二化合物(33)的荧光辐射(132)，所述方法还包括测量由所述补充辐射(131)引 发的所述荧光辐射(132)，所述测量用于确定所述参考辐射(121)是否受到所述第一化合 物(34)的影响。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述第一化合物(34)中所述生物组织 (30)的含量影响所述参考辐射(121)时，在饱和后为所述测量辐射(111)选择的波长对应 于饱和前所述参考辐射(121)的波长附近的波长。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括当所述生物组织(30)和所述发射 装置(11， 12， 13)及所述测量装置(21)之间的距离不固定时，在饱和后为所述参考辐射选 择新的波长，所述新的波长较少地受到所述第一化合物的含量的影响。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，当所述生物组织(30)和所述发射装置(11， 12,13)及所述测量装置(21)之间的距离不固定时，在饱和后为所述参考辐射选择的所述 新的波长对应于所述补充辐射(131)的波长附近的波长。
6. 如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，当所述参考波长(121)未受到所 述生物组织(30)中所述第一化合物(34)的含量的影响时，为所述测量辐射(111)选择的 波长比限制波长对应于所述第一化合物(34)的更小吸收，对于所述限制波长，在所述生物 组织(30)中所述第一化合物(34)的期望最大含量的情况下将产生潜在的饱和。
7. 如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，还包括根据对所述第一化合物 (34)的吸收光谱和/或对所述第二化合物(33)的荧光光谱具有影响的物理化学特征，修改 所述测量辐射(111)和/或所述参考辐射(121)的波长。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述物理化学特征是选自以下列表的特征 _所述生物组织(30)的pH值；-所述生物组织(30)中影响所述第一化合物(34)的辅色效应；以及 -所述生物组织(30)中所述第二化合物(33)的支持结构中的至少一个变化的效应。
9. 如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述参考辐射(121)和所述测量辐射(111)中的至少之一以预定强度发出，而另一辐射以可变强度发出，从而使所述参考 辐射(121)和所述测量辐射(111)中的每个引发的荧光辐射具有相等的强度。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，根据控制信号调整所述测量辐射的强度， 所述控制信号与由所述测量辐射和所述参考辐射引发的荧光辐射相关。
11. 如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，通过相移以预定频率交替改变所 述测量辐射(111)和所述参考辐射(121)的强度。
12. 如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，还包括通过相位调制将所述辐射 (111,121,131)同步。
13. 如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述测量辐射(111)和所述参考 辐射(121)中的每个都以脉冲形式发出。
14. 如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，确定所述第一化合物(34)的含 量包括计算以下比率由所述参考辐射(121)引发的荧光由所述测量辐射(111 )引发的荧光 。
15. 如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，还包括确定所述生物组织(30)中所述第一化合物(34)的含量随时间的发展。
16. 如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，对所述荧光辐射(112,122)的测-在采自生物实体的组织样本(30)上执行； _或直接在所述生物实体上执行。
17. 如权利要求4至16中任一项所述的方法，其特征在于， -所述生物组织是葡萄果皮；_所述第一化合物是花色素苷； -所述第二化合物是叶绿素；-饱和前所述测量辐射的波长在500至600nm之间； -饱和前所述参考辐射的波长在600至700nm之间； _所述补充辐射的波长在400至500nm之间； -饱和后所述测量辐射的波长在600至700nm之间； -饱和后所述参考辐射的波长在400至500nm之间。
18. 如权利要求4至16中任一项所述的方法，其特征在于， -所述生物组织是葡萄果皮； -所述第一化合物是黄酮醇； -所述第二化合物是叶绿素；-饱和前所述测量辐射的波长在300至400nm之间； -饱和前所述参考辐射的波长在600至700nm之间； -饱和后所述测量辐射的波长在400至500nm之间； -饱和后所述参考辐射的波长在600至700nm之间。
19. 用于确定生物实体的组织(30)中称为第一化合物的非荧光的发色化合物(34)的 含量的系统，所述生物组织(30)还包括称为第二化合物的荧光发色化合物(33)，所述系统包括-发射装置(11， 12)，向所述组织(30)的方向发射称为测量光学辐射的第一辐射(111) 和称为参考光学辐射的第二辐射(121)，所述第一辐射和第二辐射(111,121)中的每个都 选择为产生所述第二化合物(33)的荧光辐射，所述第一辐射和第二辐射(111,121)中的每 个都被所述第一化合物(34)部分吸收；-测量装置(21，22)，测量所述第一辐射和第二辐射(111,121)引发的所述荧光辐射 (112U22);以及-计算装置，根据所述测量确定所述组织(30)中所述第一化合物(34)的含量， 其特征在于，所述系统还包括探测装置，根据所述荧光辐射测量探测由所述第一化合物(34)对所述测量辐射(111) 的过度吸收而产生的至少一次饱和；以及对所述饱和进行补偿的装置，所述补偿包括为所述测量辐射选择对应于所述第一化合 物(34)的吸收光谱中的较低吸收的波长。
全文摘要
用于确定生物实体的组织(30)中称为第一化合物的非荧光的发色化合物的含量的方法，所述生物组织(30)还包括称为第二化合物的荧光发色化合物(33)，所述方法包括以下操作的至少一次迭代向所述组织(30)的方向发射称为测量光学辐射的第一辐射和称为参考光学辐射的第二辐射，所述第一辐射和第二辐射中的每个都选择为产生所述第二化合物的荧光辐射，所述第一辐射和第二辐射中的每个都被所述第一化合物部分吸收；测量所述第一辐射和第二辐射引发的所述荧光辐射；以及根据所述第一测量确定所述组织中所述第一化合物的含量，其特征在于，所述方法还包括对测量饱和的至少一次补偿，所述测量饱和是由于所述第一化合物对所述测量辐射的太高吸收而产生的，所述补偿包括为所述测量辐射选择对应于所述第一化合物的吸收光谱中的较低吸收的波长。
文档编号G01N21/64GK101784884SQ200880018379
公开日2010年7月21日 申请日期2008年5月27日 优先权日2007年6月1日
发明者佐澜·克洛维可, 尼克拉·莫伊斯, 格温达尔·拉托彻, 耶维斯·苟拉斯 申请人:弗斯-A公司;国家科研中心;巴黎南大