胎儿细胞和核酸的鉴定和分离的制作方法

专利名称：胎儿细胞和核酸的鉴定和分离的制作方法
胎儿细胞和核酸的鉴定和分离本申请要求2007年9月21日提交的美国临时申请No. 60/974，392的优先权，在 此完整引入以供参考。
背景技术：
通常进行产前测试或筛选以在妊娠期间确定胎儿性别或检测胎儿中的遗传疾病 和/或染色体异常。如今，已了解一或多种有缺陷的基因导致的逾4000种遗传疾病。一些 例子包括囊性纤维变性、亨廷顿氏舞蹈病、β型地中海贫血、强直性肌营养不良、镰状细胞 贫血、吓啉病、和脆性X染色体综合征。染色体异常是由染色体数异常、染色体质重复或缺 失、以及染色体结构缺陷导致的。染色体异常的例子有三体性，例如16三体性，在妊娠期头 三个月导致流产的主要原因；21三体性(唐氏综合征)；13三体性(帕塔综合征)；18三体 性(爱德华综合征)；克莱恩费尔特(氏)综合征((47、ΧΧΥ)、(47,XYY)、和(47、ΧΧΧ))；染 色体缺失(单体性)，例如特纳综合征(45、Χ0)；染色体易位、缺失和/或微缺失，例如罗伯 逊易位、Angelman综合征、迪乔治综合征和午-希二氏综合征。目前可行的产前遗传测试通常涉及侵入性方法。例如，在怀孕10-12周左右的孕 妇上进行的绒毛膜绒毛采样(CVS)和在14-16周左右进行的羊膜穿刺都包括侵入性方法， 以获得用于测试胎儿内染色体异常的样品。一般用细胞遗传学或荧光原位杂交(FISH)分 析测试通过这些采样过程获得的胎儿细胞以测试染色体异常。虽然这些方法对于检测染色体畸变是有用的，但是已显示它们会引起流产风险。 因此，仅仅会对察觉危险增加的妇女，例如高龄孕妇(> 35岁)、具有异常母体血清筛选结 果的或那些先前已经有过胎儿染色体异常的妇女建议羊膜穿刺或CVS。由于这些测试，35 岁以上的妇女生出患有染色体畸变，例如唐氏综合征的婴儿的百分比大大下降了。然而，缺 乏对于大多数孕妇的合适或相对安全的产前测试或筛选导致了 35岁下妇女中约80%的唐 氏综合征婴儿的出生。因此，需要一种对于孕妇普遍人群的非侵袭性筛选测试，特别是针对鉴定胎儿染 色体畸变和其它遗传变异或缺陷的测试。这需要非侵袭性的检测、分离可用于产前遗传筛 选的胎儿细胞和胎儿核酸的技术。发明简述本发明部分基于核小体表位可用于胎儿细胞或胎儿核酸的标记的发现。因此，本 发明提供了针对这些核小体表位的抗体，含有这些抗体的试剂盒，以及用这些抗体检测或 分离胎儿细胞和/或胎儿核酸的方法。在本发明的一个实施例中，提供了一种特异性结合胎儿核小体表位的抗体。在本 发明的另一个实施例中，提供了含有本发明抗体的试剂盒。在本发明的还有一个实施例中，提供了适用于测试胎儿遗传组成的试剂盒。该试 剂盒含有分离的胎儿核酸样品，该样品是用本发明的抗体分离的。在本发明的另一个实施例中，提供了一种在胎儿的母体获得的生物样品中检测胎 儿核酸和/或胎儿细胞存在的方法。该方法包括使生物样品与本发明的抗体接触，并检测 抗体与生物样品中核小体的结合。抗体与核小体的特异性结合说明胎儿核酸和/或胎儿细胞的存在。在本发明的还有一个实施例中，提供了分离胎儿的核酸的方法。该方法包括通过 使从胎儿母体获得的宫颈粘液样品与本发明的抗体接触，分离核酸。在本发明的还有一个实施例中，提供了富集胎儿核酸的方法。该方法包括通过使 获自胎儿母体的宫颈粘液样品与本发明的抗体接触，分离核酸。在本发明的还有一个实施例中，提供了鉴定胎儿遗传组成的方法。该方法包括根 据本发明的方法分离胎儿核酸，并基于分离的胎儿核酸鉴定遗传组成。在还有一个实施例中，提供了一种组合物，含有一种肽和佐剂，该肽含有与SEQ ID NO 1的序列具有至少80%相同性的氨基酸序列。在本发明的另一个实施例中，提供了制备与胎儿核小体表位特异性结合的抗体的 方法。该方法包括用含有肽和佐剂的组合物免疫动物，该肽含有与SEQ IDNO 1的序列具有 至少80%相同性的氨基酸序列。发明详述本发明部分基于核小体表位可用于胎儿细胞或胎儿核酸的标记的发现。因此，本 发明提供了针对这些核小体表位的抗体，含有这些抗体的试剂盒，以及用这些抗体检测或 分离胎儿细胞和/或胎儿核酸的方法。根据本发明的一个方面，提供了一种与胎儿核小体表位特异性结合的抗体。本文 所用的术语“抗体”包括抗体结合区、CDR、单链抗体、嵌合抗体或人源化抗体。本发明的抗 体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。所述抗体可以是任何同工型，例如IgG、IgM、IgA、IgD、 或 IgE0在一个实施例中，胎儿核小体表位可以是任何与独特的胎儿染色质或胎儿核小体 有关的表位，或与对应母体表位不同的表位。在另一个实施例中，胎儿核小体表位具有与对 应母体表位不同的分子结构(例如一级、二级或三级)。在另一个实施例中，胎儿核小体中 的胎儿核小体表位比母体核小体中的表位更暴露于、或更容易接触抗体。在真核细胞中，有五大类组蛋白，它们是染色质的主要蛋白质组成。这些是Hl (有 时称作接头组蛋白)、H2A、H2B、H3和H4。一般H2A、H2B、H3和H4组蛋白两两装配，通过 使146碱基对的DNA绕蛋白质轴包裹，形成八聚体核小体核心颗粒。接头组蛋白Hl和接头 DNA像把珠穿在线上一样连接各个核小体。H3类组蛋白包括四种不同蛋白质类型主要类 型H3. 1和H3. 2，替换型H3. 3，和睾丸特异性变体H3t。虽然H3. 1和H3. 2密切相关，仅在 Ser96处不同，但H3. 1和H3. 3至少有5个氨基酸位点不同。另外，与在成年组织，包括肝 脏、肾脏和心脏中的存在相比，H3. 1在胎肝中高度富集。在成人组织中，H3. 3变体比H3. 1 变体更多，而对胎肝正相反。这些不同可被本发明的抗体所用，以在同时含有胎儿和母体细 胞和/或胎儿核酸的母体生物样品中检测胎儿细胞和/或胎儿核酸。因此，胎儿核小体表位可以是与组蛋白有关的表位。在一个实施例中，胎儿核小体 表位是与组蛋白H3有关的表位。在另一个实施例中，胎儿核小体表位是与组蛋白H3. 1有 关的表位。在另一个实施例中，胎儿核小体表位是与组蛋白H3. 1有关，但与组蛋白H3. 3无 关的表位。在另一个实施例中，胎儿核小体表位包含或由一表位构成，该表位具有氨基酸序 列Ser-Ala-Val-Met-Ala-Leu-Gln-Glu-Ala-Cys (SEQ ID NO :1)。在另一个实施例中，胎儿 核小体表位包括或由一表位构成，该表位具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列中的2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸残基。在另一个实施例中，胎儿核小体表位包含或由一表位构成，该 表位在含有与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少70%、至少80%或至少90%相同性的 氨基酸序列的肽内。在另一个实施例中，胎儿核小体表位是与组蛋白H3. 1有关的表位，包 含或由一表位构成，该表位在具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列的肽内。本发明的抗体包括 与特异性结合于具有氨基酸序列SEQ ID NO 1的肽内的表位的那些抗体。本发明的抗体还可以针对组蛋白，特别是组蛋白H3. 1的特异性构象或结构特征。 例如，胎儿核小体表位可以是与组蛋白3. 1的一个区域有关的表位，该区域在胎儿核小体 中与母体核小体中对应的H3. 1相比更暴露。也可利用胎儿和母体H3组蛋白中发生的翻译 后修饰(例如甲基化或乙酰化)的不同来靶向要检测的胎儿H3. 1，以检测、富集和/或分离 胎儿DNA。也可用两组抗体分离胎儿核酸，一组设计成与特异性组蛋白构象或序列结合，第 二组设计成与翻译后修饰结合。在一个实施例中，胎儿核小体表位不包括与含有翻译后修饰的组蛋白(例如组蛋 白H3或H3. 1)有关的表位。在另一个实施例中，胎儿核小体表位不包括与含有翻译后磷酸 化、甲基化或乙酰化的氨基酸的组蛋白(例如H3或H3. 1)有关的表位。在另一个实施例 中，胎儿核小体表位不包括与含有翻译后磷酸化的色氨酸(“S”)残基或翻译后被甲基化 或乙酰化的赖氨酸(“K”)或精氨酸(“R”)残基的组蛋白(例如组蛋白H3或H3. 1)有关 的表位。在另一个实施例中，胎儿核小体表位不包括与含有甲基化的N-末端4位赖氨酸 (“K4”)，甲基化或乙酰化的9位赖氨酸残基(“K9”)，或磷酸化的10位色氨酸(“S10”) 的组蛋白(例如组蛋白H3或H3. 1)有关的表位。一般来说，本发明的抗体含有可检测的部分(例如标记)。本领域存在许多可检 测的标记，而且本领域技术人员熟知标记方法。可用于本发明的一般标记类型包括但不限 于，放射性同位素、荧光、化学发光和生物发光分子、生色团、酶、酶底物、酶的辅因子、酶抑 制剂、生色团、染料、金属离子、金属液胶、配体(例如生物素、亲和素、链霉亲和素、地高辛 或半抗原)等。可检测的标记包括那些发荧光的标记，包括能在可检测范围内显示荧光的 那些物质或其部分。可用于本发明的标记的具体例子包括但不限于，放射性标记，包括但不限于1251、 mI、35S、32P、14C和3H;化学发光物质，包括但不限于鲁米诺、异氨基苯二酰胼、theromatic吖 啶酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶盐和草酸酯；生物发光化合物，包括但不 限于荧光素、荧光酶、和水母素；荧光物质，包括但不限于荧光素、FITC、罗丹明、藻红蛋白、 藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛、得克萨斯红、丹磺酰氯、二氯三吖嗪基胺荧光素、绿色荧 光蛋白、和荧光胺；酶，包括但不限于β-葡糖醛酸酶、β-D-糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、 脲酶、过氧化酶(例如辣根过氧化酶(HRP))、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、 己糖激酶和鸟苷二磷酸酶、核糖核酸酶、荧光酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天 冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶、α-磷酸甘油、天冬酰胺酶(aspariginase)、葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶、和β -内酰胺酶。在一个实施例中，本发明的抗体被荧光标记。在另一个实施例中，本发明的抗体是 荧光标记的，而且抗体与胎儿细胞或胎儿核酸的特异性结合可通过流式细胞计数法，例如 通过荧光激活细胞分拣(FACS)检测。在另一个实施例中，本发明的抗体固定在固相载体上。抗体可直接或间接(例如通过接头)固定在固相载体上。使抗体结合于固相载体的方法是本领域技术人员熟知的， 可使用任何已知或将来发现的方法。在一个实施例中，固相载体是一群磁性颗粒、柱(例如 树脂柱)中的颗粒、微通道的表面、微孔、平板、阵列、滤器、膜或载玻片。在另一个实施例中，本发明的抗体可以被固定、或涂布在装置(例如微流装置)表 面。示范性的微流装置包括注入装置、流出装置和在注入装置和流出装置之间延伸的微通 道排列。微通道排列可以是任何为生物样品提供随机流径的微通道。例如，微通道排列可 包括多条整合在微通道基面上并从其伸出的横向分隔柱。所述柱通常排列成能够提供随机 化流径的模式。微流装置的例子如美国临时申请11/458，668和11/331，988所述，两者都 在此完整弓丨入以供参考。可用本发明的抗体部分或完全涂布微流装置的微通道排列表面。根据本发明的另一个方面，提供了含有本发明抗体的试剂盒。在一个实施例中，试 剂盒还包括使用试剂盒检测来自母体生物学样品的胎儿细胞或胎儿核酸的说明书。在一些 实施例中，试剂盒包括涂布有本发明抗体的微流装置或其它固相。根据本发明的另一个方面，提供了适用于测试胎儿遗传组成的试剂盒。该试剂盒 包含使用本发明抗体分离或富集的胎儿的分离或富集的核酸样品。根据本发明的另一个方面，提供了检测胎儿母体获得的生物学样品中胎儿核酸存 在的方法。该方法包括使生物学样品与本发明抗体接触，并检测抗体与生物学样品中核小 体的结合。抗体与核小体的特异性结合表明了胎儿细胞的存在。所述生物学样品可以是任何母体生物学样品，例如体液或其组分，其可能含有胎 儿细胞或胎儿核酸。在一个实施例中，生物学样品是血液、血浆、血清、尿、宫颈粘液、羊水、 绒毛膜绒毛样品、或其组分。在另一个实施例中，生物学样品是血液、血浆、血清、尿或其组 分。在另一个实施例中，生物学样品是宫颈粘液样品。可从胎儿的母体通过任何本领域已 知或将来发现的方法获得生物学样品。在另一个实施例中，检测步骤包括检测本发明的抗体与细胞或其片段(例如凋 亡体)的特异性结合。本发明的抗体与细胞的特异性结合表明胎儿细胞的存在。一般说， 可用流式细胞计数法检测本发明抗体与生物学样品中的核小体或细胞的特异性结合。例 如，当抗体被荧光标记时，可使用的示范性流式细胞计数法，包括但不限于荧光激活细胞分 拣(FACS)。根据本发明的另一个方面，提供了分离或富集胎儿核酸的方法。所述方法包括通 过使生物学样品与本发明抗体接触，分离从胎儿母体获得的生物学样品中的核酸。可在任何时间从胎儿的母体获得生物学样品，例如在妊娠最初三个月的第一、第 二、或第三个月。在一个实施例中，在妊娠头三个月中获得生物学样品。在另一个实施例中， 在妊娠中三个月期间获得生物学样品。在另一个实施例中，在妊娠第4-12周、8-12周、或 10-12周获得生物学样品。在另一个实施例中，在妊娠13-28周、13-24周、13-20周、13-16 周、17-20周、或21-24周获得生物学样品。生物学样品可以是任何上述母体生物学样品。在一个实施例中，生物学样品是血 液、血浆、血清、尿液、宫颈粘液、羊水、绒毛膜绒毛样品、或其组分。在另一个实施例中，生物 学样品是尿液、宫颈粘液、羊水、绒毛膜绒毛样品或其组分。在另一个实施例中，生物学样品 是宫颈粘液样品或其组分。宫颈粘液样品，例如宫颈内粘液样品或经宫颈的粘液样品可用 本领域任何已知或将来会开发的技术获得。这些技术包括但不限于，经宫颈拭子、宫颈内灌洗、刮板、细胞刷、抽吸、子宫内灌洗或其组合。宫颈粘液样品可以是新鲜样品，例如不经过充分保存的，或从新鲜样品保存的样 品，例如保存在合适的水相保存介质中的，或者可以是从一或多个宫颈粘液样品过滤出的 含有核酸的介质样品。本发明的宫颈粘液样品可以维持或储藏在约4-20°C之间，例如在低 钙碱性介质内。在一个实施例中，宫颈粘液样品是处理过的样品，例如用合适试剂处理过，以促使 粘液溶解，从而帮助从样品分离核酸组分的新鲜或保存的样品。例如，本发明的宫颈粘液样 品可以是用粘液溶解剂或粘蛋白酶，例如N-乙酰-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇 (DTT)、盐酸溴己铵(brornhexine hydrochloride)、和任何透明质酸酶，包括透明质酸分解 酶、透明质酸氨基葡糖苷酶(hyaluronoglucosarninidase)和透明质酸葡糖苷酸酶处理过 的样品。在另一个实施例中，本发明的宫颈粘液样品是用酶，例如糖水解酶(例如半乳 糖苷酶或转化酶)；蛋白酶；胃蛋白酶；或其组合处理过的样品。在另一个实施例中，从胎儿母体获得的生物学样品经过凋亡诱导处理，或经处理 促使胎儿核酸从完整的胎儿细胞释放，然后与抗体接触。例如，生物学样品可以是用试剂、 或经过高ΡΗ、剪切或热休克处理的样品。依托泊苷等试剂，包括但不限于VP16和其它相当 的酶可用于促使胎儿核酸释放。在另一个实施例中，处理生物样品以富集胎儿核酸和/或减少母体核酸含量。例 如，可处理生物学样品，以减少或使任何核酸降解，例如母体DNA特征的DNA。这样的核酸的 一个例子是高甲基化的母体DNA。可用任何减少、降解或选择性除去高甲基化母体DNA的方 法，包括但不限于，甲基化特异性限制酶，例如McrBC(BioLabs)，对高甲基化母体DNA特异 性的抗体，例如抗-5’ -甲基-胞嘧啶抗体和/或抗-甲基CpG结合蛋白-2(MeCP2)抗体， 或配体或蛋白(例如与母体DNA中的甲基化CpG岛特异性结合的MeCP2)。还可用胎儿核酸的特异性标记富集胎儿核酸。例如，低甲基化的乳腺丝抑蛋白 (Hiaspin)DNA可用作用于胎儿DNA的标记。在一个实施例中，来自生物学样品的总DNA可以 用亚硫酸氢钠处理，它诱导低甲基化胎儿DNA中的化学改变，从而将胎儿DNA的未甲基化的 胞嘧啶转化成尿苷(U)。可用这种改变优势分离或富集胎儿DNA，例如优势扩增含有从胞嘧 啶转化过来的尿苷的胎儿DNA。根据本发明的另一个方面，提供了鉴定胎儿基因组成的方法。该方法包括根据本 发明的方法分离胎儿核酸，和基于分离的胎儿核酸鉴定胎儿的基因组成。胎儿的基因组成可指示胎儿性别或胎儿中的状况或疾病。在一个实施例中，基因 组成包括但不限于单体性、部分单体性、三体性、部分三体性、染色体易位、染色体重复、染 色体缺失或微缺失、和染色体倒位。一般来说，术语“单体性”指一对染色体中仅存在一条。单体性是一类非整倍性。 当染色体的长或短臂缺失时，部分单体性发生。单体性引起的常见人类遗传病包括xo，仅 有一条X染色体而不是在正常女性中可见的通常两条(XX)，也被称为特纳综合征；猫叫综 合征，由于5号染色体短P (来自单词petit，法语中的“小”)臂末端缺失导致的部分单体 性；和1ρ36缺失综合征，一种由于1号染色体短ρ臂末端缺失导致的部分单体性。相反，术语“三体性”指体内对特别编号的类型(numbered type)存在三条，而不是 正常的两条染色体。因此，额外的21号染色体的存在被称为21三体性。大部分三体性，与大部分其它染色体数目异常一样，导致明显的出生缺陷。许多三体性导致流产或早年死亡。 当一段额外的染色体结合在其它染色体之一上，或者如果染色体之一具有其染色质部分的 两个拷贝时，发生部分三体性。嵌合三体性是这样一种情况，即仅在生物体的一些细胞中存 在额外的染色体物质。虽然三体性可以发生于任何染色体上，具有许多三体性的少数婴儿 活到了出生。在人类中，最常见的存活而没有自发流产的类型包括21三体性(唐氏综合 征)；18三体性(爱德华综合征)；13三体性(帕塔综合征)；9三体性；8三体性(Warkany 综合征2)；和16三体性(在人类中最常见的三体性，发生于以上的妊娠中，虽然常在头 三个月导致自发流产)。涉及性染色体的三体性包括XXX(三X染色体综合征)；XXY(克莱 恩费尔特(氏)综合征)；和XYY (XYY综合征)。在另一个实施例中，基因组成包括等位或基因异常，例如一个或多个突变，例如一 个或多个基因中的点突变、插入、缺失。在另一个实施例中，基因组成包括但不限于一种或多种多态性模式或遗传标记， 例如短串联重复序列(STR)、单核苷酸多态性(SNP)等。在另一个实施例中，基因组成表明疾病或异常。疾病或异常的例子包括但不限于 囊性纤维变性、镰状细胞贫血、苯并酮尿症、Tay-Scahs病、肾上腺增生、范可尼贫血、脊髓 性肌萎缩、进行性假肥大性肌营养不良、亨廷顿氏舞蹈病、Beta地中海贫血、强直性肌营养 不良、脆性X染色体综合征、唐氏综合征、爱德华综合征、帕塔综合征、克莱恩费尔特(氏) 综合征、三X染色体综合征、XYY综合征、8三体性、16三体性、特纳综合征、罗伯逊易位、 Angelman综合征、迪乔治综合征、午-希二氏综合征、RhD综合征、结节性硬化、毛细血管扩 张性共济失调和普拉德_威利综合征。在另一个实施例中，基因组成包括任何不与Y染色体独特相关的基因病况或异常。在另一个实施例中，基因组成包括任何对应于或与胎儿的亲子关系相关的遗传病 况。本发明的遗传测试可以直接使用本发明的分离的核酸样品或将其作为“基于扩 增”的基因组成测试法的模板。这些测试是本领域熟知的，包括但不限于聚合酶链式反应 (“PCR”)，实时聚合酶链式反应(“RT-PCR”)，连接酶链式反应(“LCR”)，自持续序列复制 (“3SR”)，也称为基于核酸的扩增(“NASBA”)，Q-B-复制酶扩增，滚环复制(“RCA”)，转 录介导的扩增(“TMA”)，接头辅助DNA扩增(“LADA”)，多次置换扩增(“MDA”)，和侵入 物和链式置换扩增(“SDA”)。根据本发明的另一个方面，提供了一种组合物，含有肽和佐剂，该肽具有与SEQ ID NO 1的序列具有至少70%、至少80%、或至少90%相同性的氨基酸序列。在一个实施例 中，所述肽含有一氨基酸序列，它与SEQ ID NO :1的序列100%相同。合适的佐剂包括但不 限于弗氏完全佐剂、弗式不完全佐剂、弗式完全佐剂的替换物、明矾、乙烯乙酸乙烯酯共聚 物、L-酪氨酸、二缩甘露醇_油酸酯(manide-oleate)、皂甙/胆固醇微囊、或硝基纤维素 (即肽抗原吸附的硝基纤维素)。根据本发明的另一个方面，提供了一种制备与胎儿核小体表位特异性结合的抗体 的方法。该方法包括用含有肽和佐剂的组合物免疫动物，该肽具有与SEQ IDNO 1的序列具 有至少80%相同性的氨基酸序列。该动物可以是例如哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、山羊、马等)。在一些实施例中，该方法包括从被免疫的动物获得细胞(例如脾细胞)， 产生单克隆抗体，并筛选这些单克隆抗体与胎儿核小体的特异性结合。在其它实施例中，该 方法包括从被免疫的动物获得多克隆抗体，和可任选的从多克隆抗血清纯化胎儿核小体特 异性抗体。
实施例下列实施例是为了说明，而不是为了以任何方法、方式、形式明确或含蓄地限制本 发明。虽然它们是可能使用的方法中典型的例子，但是也可使用本领域技术人员已知的其 它过程、方法或技术。实施例1通过从妊娠中三月早期(或头三个月晚期)的孕妇拭取或灌洗获得宫颈粘液样 品。将收集装置上的宫颈粘液样品置于含有缓冲液的试管中，储藏于约4°C，并转移到处理 实验室中，同时维持样品温度为约4°C。可用合适的冰袋等实现维持在4°C。在到达处理实验室后，登记样品并将其给实验室技术人员进行处理。样品温至室 温，用于随后处理。接着，可将样品置于37°C温箱内的摇床上约15-30分钟，以释放截留在 粘液中的DNA。可用粘蛋白酶进一步溶解粘液，以释放DNA，也可将样品置于例如化学处理等本领 域熟知的条件下诱导样品凋亡，以释放胎儿核小体。除去收集装置，用例如0. 22gm滤膜过 滤缓冲液，以除去污染物，该污染物包括母体细胞和精细胞。另外，可离心来自样品的液体 以沉淀细胞，以从高分子量粘液和细胞中分离游离的DNA。可任选地在缓冲液中的样品内加 入DNA酶I以除去未被保护的高分子量DNA。然后，使清洁的浓缩样品通过美国专利申请11/038,920中公开的那类微流装置， 其具有一收集区，该收集区具有多个随机定位的柱，该柱是通过使组蛋白特异性抗体结合 在其含柱的收集区内制备的。可设计抗体与具有以下氨基酸残基序列的十肽偶联=Ser-Al a-Val-Met-Ala-Leu-Gln-Glu—Ala-CySo如上制备的经处理的粘液样品在真空泵的牵引下，缓慢通过微流装置。抗体通过 与暴露的独特序列偶联，与含有胎儿组蛋白3. 1的样品中的染色质偶联并螯合。然后用缓 冲液洗涤微流装置，洗涤重复2-3次，以除去可能存在于宫颈粘液中的任何非特异性结合 的生物物质。还可使用设计成与翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化和/或甲基化胎儿核酸的抗 体偶联。另外，可用两组抗体，它们设计成与特异组蛋白构象以及上述翻译后修饰偶联。从微流装置上释放抗体螯合的生物材料，并纯化以除去可能存在的盐。然后用市 售DNA抽提试剂盒，例如Roche (罗氏)出售的，从样品抽提DNA。然后将DNA浓缩到合适的体积，即，20-50 μ 1，用实时PCR或基于荧光的PCR进行 分析以检测染色体Y-特异性序列。分析结果显示在DNA中有男性Y-序列的阳性检测结果， 这是胎儿DNA存在于被抗体螯合的生物材料中的证据。用两个位点的定量实时PCR显示在 螯合的DNA材料中以显著程度不存在母体DNA。例如，显示Y-水平与至少一半的第二独特 序列(例如β-球蛋白)的水平相当证明，大部分，或几乎所有DNA是胎儿来源的。或者， 可通过鉴定Η3. 1对Η3. 3在DNA中的相对比例来显示，存在的相对比例是存在于胎儿来源的核小体中的比例，其可确认DNA的胎儿来源。在该确认后，能可靠地分析DNA中的非整倍性或其它遗传异常或疾病，该分析可 提示妊娠并发症。可对分离的胎儿DNA进行分子DNA测序或多态性DNA序列分析。该分析 可利用实时PCR来计量与特异性DNA序列有关的DNA水平，以筛选非整倍性，或用PCR扩增 DNA，然后将其在微阵列或基因-特异性微阵列中温育。本文所弓I用的所有专利和出版物在此完整弓丨入以供参考。虽然本发明已用目前的优选例进行了描述，但是应理解，可在不违背本发明的精 神的前提下进行各种修改。因此，本发明仅以所附权利要求书进行限定。
权利要求
一种与胎儿核小体表位特异性结合的抗体。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述胎儿核小体表位是与组蛋白H3有关的表位。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述胎儿核小体表位是与组蛋白H3.1有关 的表位。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述胎儿核小体表位是与组蛋白H3.1的一 个区域有关的表位，所述区域在胎儿核小体中比在母体核小体中更暴露。
5.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述胎儿核小体表位是与组蛋白H3.1有关， 但与组蛋白3. 3无关的表位。
6.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述胎儿核小体表位是在具有SEQIDNO 1 的氨基酸序列的肽内的表位。
7.一种与胎儿核小体表位特异性结合的抗体，其特征在于，所述抗体与权利要求6所 述的抗体竞争与含有所述表位的肽结合。
8.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述胎儿核小体表位是在肽内的表位，所述 肽具有与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体含有可检测的部分。
10.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体被荧光标记。
11.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体被固定在固相载体上。
12.—种含有权利要求1的抗体的试剂盒。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，还含有用试剂盒检测胎儿细胞或从母 体的生物样品中分离胎儿核酸的说明书。
14.一种适合测试胎儿的基因组成的试剂盒，其特征在于，包括胎儿的分离的核酸样 品，所述样品是用权利要求1所述的抗体分离的。
15.一种在生物样品中检测胎儿核酸存在的方法，包括使生物样品与权利要求1所述的抗体接触，和检测所述抗体与生物样品中的核小体的结合，其中，所述抗体与核小体的特异性结合表明胎儿核酸的存在。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述生物样品是血液、血浆、血清、尿液、 宫颈粘液、羊水或绒毛膜绒毛样品。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述生物样品是宫颈粘液样品。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述检测包括检测抗体与细胞的特异性 结合，所述抗体与细胞的特异性结合显示胎儿细胞的存在。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述检测是用流式细胞计数法进行的。
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述检测是用荧光激活细胞分拣(FACS) 进行的，其中所述抗体被荧光标记。
21.一种从胎儿分离核酸的方法，其特征在于，包括用权利要求1所述的抗体分离获自胎儿的母体的生物样品中的核酸。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物样品是尿、宫颈粘液、羊水或绒 毛膜绒毛样品。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗体被固定在固相表面。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，在与抗体接触前，所述生物样品经过凋亡 诱导处理。
25.如权利要求21所述的方法，其特征在于，在与抗体接触前，所述生物样品经过凋亡 诱导处理，其中，所述凋亡诱导处理包括化学处理、高PH、剪切或热休克。
26.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物样品是在头三个月妊娠期间获 得的。
27.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物样品是宫颈粘液样品，其中，所 述宫颈粘液样品是通过经宫颈拭子、宫颈内灌洗、细胞刷、抽吸、子宫内灌洗或其组合获得 的。
28.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述生物样品是宫颈粘液样品，并且所述 宫颈粘液样品在与抗体接触前经粘液溶解剂处理。
29.一种鉴定胎儿基因组成的方法，其特征在于，包括根据权利要求21所述的方法分离胎儿核酸；和基于分离的胎儿核酸鉴定胎儿的基因组成。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述基因组成选自单体性、部分单体性、 三体性、部分三体性、染色体易位、染色体重复、染色体缺失或微缺失、和染色体倒位。
31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述基因组成指示疾病或异常，所述疾病 或异常选自囊性纤维变性、镰状细胞贫血、苯并酮尿症、Tay-Scahs病、肾上腺增生、范可 尼贫血、脊髓性肌萎缩、进行性假肥大性肌营养不良、亨廷顿氏舞蹈病、地中海贫血、强 直性肌营养不良、脆性X染色体综合征、唐氏综合征、爱德华综合征、帕塔综合征、克莱恩费 尔特(氏)综合征、三X染色体综合征、XYY综合征、8三体性、16三体性、特纳综合征、罗伯 逊易位、Angelman综合征、迪乔治综合征、午-希二氏综合征、RhD综合征、结节性硬化、毛细 血管扩张性共济失调和普拉德_威利综合征。
32.—种组合物，其特征在于，所述组合物含有肽和佐剂，所述肽具有与SEQID ΝΟ:1的 序列有至少80%相同性的氨基酸序列。
33.如权利要求32所述的组合物，其特征在于，所述氨基酸序列与SEQIDNO :1的序列 100%相同。
全文摘要
本发明涉及用于检测存在于获自母体的生物样品中的胎儿细胞和/或胎儿核酸的方法、抗体和试剂盒。还提供了用于从母体宫颈粘液样品分离胎儿核酸，和用于测试或筛选分离的胎儿核酸以诊断胎儿基因异常的方法和试剂盒。
文档编号G01N33/53GK101883851SQ200880108751
公开日2010年11月10日 申请日期2008年9月22日 优先权日2007年9月21日
发明者F·比肖夫 申请人:生物概念股份有限公司