提取体液样本中低分子量蛋白/肽的方法

专利名称：：提取体液样本中低分子量蛋白/肽的方法
技术领域：
：本发明涉及从哺乳动物，包括人类的体液样本，特别是血清和血浆中提取低分子量蛋白/肽的方法，并涉及用于该提取方法的试剂盒。
背景技术：
：近些年来，采用蛋白组学的研究已经作为后基因组研究被积极开展。这是由于与基因相比，作为基因产物的蛋白可能更直接的与疾病状态相关。因此，人们期待蛋白组学能够发现许多未能通过基因组学分析发现的病原性蛋白或疾病相关因子。例如，蛋白组学分析促进特定疾病诱导或删除的生物标记蛋白的发现。该生物标记的表现与疾病状态相关，因此极有可能用作诊断标记或者药物开发/发现中的靶标。此外，该生物标记为患者带来直接的益处，例如药物应答的评估或不良反应发生的预测。最近，由于质谱仪(MS)性能的改善，基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)、MS/MS质谱仪(串联质谱仪)、液相质谱仪(LC-MS质谱仪)等已被实际使用。利用这些先进的技术，蛋白组学分析已经实现了蛋白等的高速结构分析，以及多肽的高通量超微量分析或者之前无法检测的、极低丰度蛋白的鉴定，并成为疾病相关因子研究的强力工具。然而，体液样本(特别是血清和血浆)的蛋白组学分析尽管具有巨大的临床优势，但落后于针对生物组织的分析。这是由于，例如，主要蛋白如白蛋白或球蛋白的丰度超过所有血清或血浆蛋白的99%(非专利文献1)，随着这些蛋白的去除，大部分低分子蛋白/肽成分同样会损失。已经开发了从血清或血浆去除主要蛋白的预处理技术，包括通过去除过量的妨碍低丰度成分检测的蛋白来获得溶液的方法(专利文献1和2)；使用多个电极浓缩分级蛋白溶液的方法(专利文献3)；以及去除血清中主要蛋白的方法，其包括使用有机溶剂沉淀大蛋白，并由此分离低分子量蛋白(非专利文献2)。然而，随着主要蛋白的去除，与其相互作用的低分子量蛋白/肽也会损失。因此，依然需要开发高效和高重现性且不受主要蛋白影响的浓缩体液样本(特别是血清或血浆)中低分子量蛋白/肽的方法。专利文献1日本专利公开号2005-126376专利文献2日本专利公开号2005-156249专利文献3日本专利公开号2007-139759非专利文献1:Tirumalai等人，Mol.Cell.Proteomics2.10，1096-1103，2003非专禾O文献2=Merrell等人，JournalofBiomolecularTechniques15238-248,200
发明内容本发明要解决的问题本发明的目的是提供提取体液样本，特别是血清或血浆中的低分子量蛋白/肽的方法，以及提供用于该方法的试剂盒，其中该方法为高效和高重现性的，且不受大丰度蛋白的影响。解决该问题的手段本发明人已经开发了搜索疾病相关的肽的方法，并建立了高效和高重现性的提取组织中肽成分的方法。该方法包括两个步骤，并实现了包含在正常和疾病组织中的300-500种主要的肽的提取，并采用二维HPLC分离进行了定量比较。随后，本发明人成功地分离并鉴定了糖尿病模型小鼠的肾皮质中存在的糖尿病特异性肽。然而，即便可以检测到组织中的诊断标记物，但当该方法被应用至人类疾病时，这种针对组织的方法会在考察过程中引起患者的大量疼痛或负担。因此，该方法难以实际使用。相反地，如果在体液样本，特别是血清或血浆中检测诊断标记物，则仅施加采集血液的少量疼痛便可对患者进行诊断。此外，该种诊断标记物可用于医学检查，极有可能导致对疾病的早期检测。因此，基于组织肽分析方法的建立获得的技术诀窍，本发明人开发了针对血清的提取低分子量蛋白/肽的方法。与该方法的开发相关的最大问题在于大部分低分子量蛋白/肽成分随着主要蛋白的去除而损失。这可能是由于这些低分子量蛋白等与载体蛋白，例如白蛋白或球蛋白等(血清中的主要蛋白)结合。因此，本发明人研究了各种条件，然后成功开发了从血清或血浆中提取低分子量蛋白等的方法，该方法是高效和高重现性的，且不受载体蛋白的影响。因此，本发明提供了提取包含在体液样本中的低分子量蛋白/肽的方法，该方法包括如下的步骤(a)至(f)(a)向该体液样本中添加含有脲和硫脲的试剂1和含有还原剂的试剂2，将其混合，然后将该混合物滴入含有90%或更多有机溶剂的试剂3，将其混合；(b)低温搅拌步骤(a)中所得的混合溶液；(c)低温离心步骤(b)中所得的搅拌溶液并去除上清液；(d)将含有有机溶剂和酸的试剂4添加至步骤(C)中所得的沉淀，将其混合；(e)低温搅拌步骤(d)中所得的混合溶液；以及(f)低温离心步骤(e)中所得的搅拌溶液并回收上清液。本发明提供了提取包含在体液样本中的低分子量蛋白/肽的方法，其进一步包括步骤(g)冻干步骤(f)中回收的上清液。此外，本发明提供了制备分析样本的方法，其中所述分析样本为包含在体液样本中的低分子量蛋白/肽，该方法包括向通过该提取方法获得的冻干产品中添加含有成分的试剂5，所述成分选自TFA、氢氯酸、甲酸、乙酸和TCA。此外，本发明提供了用于提取包含在体液样本中的低分子量蛋白/肽的试剂盒，该试剂盒包含了含有脲或硫脲的试剂1、含有还原剂的试剂2、含有90%或更多的有机溶剂的试剂3、以及含有有机溶剂和酸的试剂4。定义本文所用的“低分子量蛋白”指分子量为30，000或更低，优选20，000或更低的蛋白。此外，除非另行指明，“低分子量蛋白等”既指低分子量蛋白又指低分子量肽。其例子包括极低丰度的生物活性蛋白(例如，肽激素、白介素和细胞因子)、具有不特定功能的极低丰度生物标记蛋白，以及肽。这些蛋白或肽经肾部分地排泄至尿液。因此，除了血液，尿液也可用作测试的分析物。本文所用的“血浆”指通过离心添加了EDTA或肝素等的血液所获得的上清液，其极少或不受血液凝结系统的作用。本文所用的“血清”指从血液中去除凝结成分后获得的部分。新鲜血液在分离后凝结，并且血细胞和血纤蛋白随后收缩形成凝块，释放透明的琥珀色血清。该血清基本由不含纤维蛋白原的血浆组成。本文所用的血清等中“主要蛋白”和“载体蛋白”指血清中所含的相对大分子量的蛋白。其例子包括白蛋白(分子量66kDa)、免疫球蛋白(150-190kDa)、转铁蛋白(SOkDa)、触珠蛋白(>85kDa)以及脂蛋白(数百kDa)。本文所用的缩写“SDS”指十二烷基硫酸钠。本文所用的缩写“PAGE”指聚丙烯酰胺凝胶电泳。发明效果本发明可以除去体液样本，特别是血清或血浆中包含的相对大分子量蛋白，并可高效和高重现性地提取(或富集)低分子量蛋白/肽。此外，本发明可从高含量主要蛋白(例如，白蛋白)分离未通过试剂1-4去除的中至高分子量(分子量20000-100000或更高)蛋白，并可将这些中至高分子量蛋白转化成为可通过电泳、蛋白组学分析等进行检测和/或定量的形式。实施本发明的最优选实施方式本发明所用的体液样本指从哺乳动物的血清、血浆、尿液、唾液、泪液、脑脊髓液、腹水、腹膜积液以及各种细胞中获得的，并且包含低分子量蛋白和/或肽的溶液等。特别地，该体液样本优选血清或血浆。本发明的步骤(a)是向该体液样本中添加含有脲和硫脲的试剂1和含有还原剂的试剂2，将其混合，然后将该混合物滴入含有90%或更多有机溶剂的试剂3，将其混合。试剂1具有脲浓度l-8mol/l(下文缩写为M)，优选3_8M，且硫脲浓度为0.5_3M，优选1-3M。此外，试剂2包含还原剂，其量优选使得在体液样本、试剂1和试剂2的混合物中的还原剂浓度为lmM-20mM。这样，试剂2包含的还原剂的浓度至少比该混合物中高10-100倍。例如，该还原剂浓度优选为10mM-200mM、10mM-lM、10mM-2M或10mM-10M。试剂2中的还原剂可不受特定限制进行使用，只要它可用于蛋白等生物材料的一般还原。其例子包括选自二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、三(2-羧乙基)膦HCl(TCEPHCl)、三正丁基膦(TBP)、2_巯基乙醇(2-ME)及其混合物的还原剂。当试剂2中的还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、2_巯基乙醇(2-ME)或2-巯基乙醇胺(2-MEA)时，试剂2包含还原剂的量优选使该还原剂在体液样本、试剂1和试剂2的混合物中的浓度为5mM-20mM。这样，试剂2中的还原剂浓度为50mM_10M、优选50mM-lM、更优选50mM-100mM。当试剂2中的还原剂为三(2-羧乙基)膦HCl(TCEPHCl)或三正丁基膦(TBP)时，试剂2包含还原剂的量优选使该还原剂在体液样本、试剂1和试剂2的混合物中的浓度为ImM-lOmM。这样，试剂2中的还原剂浓度为10mM-10M、优选10mM-lM、更优选10mM-200mMo试剂3是包含选自丙酮、乙醇、甲醇、2-丙醇、乙腈及其混合物，优选丙酮的有机溶剂的溶液。试剂3中的有机溶剂的浓度通常为90%或更高、优选95%或更高、更优选98%或更高。滴加中所用的试剂3的体积是该体液样本以及试剂1和2的混合溶液的至少10倍或更多、优选20倍或更多、特别优选30倍或更多。在步骤(a)中，液体样本中的蛋白和肽通过添加试剂1和2进行处理，然后将该混合物滴加至含有90%或更多的有机溶剂(远高于常规丙酮方法或类似方法中的丙酮浓度(50-70%))的试剂3中。通过该步骤，体液样本中的主要蛋白变性，以破坏其原始结构。另一方面，即使试剂3包含了90%或更多的有机溶剂，也没有或极少引起低分子量蛋白/肽的变性。由此，该低分子量蛋白等和该高分子量主要蛋白被认为以易于分离的状态沉淀。本发明的步骤(b)为低温搅拌步骤(a)中所得的混合溶液。步骤(b)中的低温并无特别限制，只要样本中的蛋白等成分在该温度下保持稳定。该低温为，例如，_20°C至10°C、优选0°C至5°C。此外，该搅拌进行1分钟或更长时间、优选60分钟至120分钟、更优选60分钟至90分钟。此外，该搅拌可通过搅拌机械，例如各种涡流混合器和搅拌器进行。本发明的步骤(C)为低温离心步骤(b)中所得的搅拌溶液并去除上清液。步骤(c)中的低温并无特别限制，只要样本中的蛋白等成分在该温度下保持稳定。该低温为，例如，0°c至10°C、优选0°C至5°C。该离心优选在能够沉淀该体液样本中的蛋白和肽的条件下进行，例如，在3000Xg至30000Xg,优选10000Xg至25000Xg下离心1分钟或更长时间、优选5分钟至30分钟。本发明的步骤(d)为将含有有机溶剂和酸的试剂4添加至步骤(c)中获得的沉淀物中，并将其混合。在试剂4中的有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇及其混合物，并优选乙腈。该有机溶剂的浓度为50-99%，优选60-80%。该酸选自氢氯酸、TFA、甲酸、乙酸和TCA，并优选氢氯酸。此外，该酸的浓度为使得主要蛋白通过酸变性而难以溶解的浓度。例如，在使用氢氯酸时，其浓度通常为ImM或更高，优选lmM-300mM，优选5mM-500mM，更优选5mM-25mM。在上下文中，0.1-500体积份数，优选1-200体积份数，更优选10-100体积份数的试剂4可被添加至一(1)体积份数的体液样本中。本发明的步骤(e)为低温搅拌步骤(d)中所得的混合溶液。步骤(e)中的低温并无特别限制，只要样本中的蛋白等成分在该温度下保持稳定状态。该低温为，例如，-20°C至10°C、优选0°C至5°C。此外，该搅拌进行1分钟或更长时间、优选60分钟至120分钟、更优选60分钟至90分钟。此外，该搅拌可通过搅拌机械，例如各种涡流混合器和搅拌器进行。步骤(d)中试剂4的添加以及步骤(e)中的搅拌可溶解体液样本，特别是血清或血浆中的低分子量蛋白/肽，但不溶解高含量蛋白。这是由于如上文所述，含有90%或更多的有机溶剂的试剂3在步骤(a)中使主要蛋白变性以破坏它们的原始结构，而添加试剂3没有或极少引起低分子量蛋白/肽的变性。因此，两种这些蛋白可以容易地彼此分离。然后，添加试剂4处理可溶解该低分子量蛋白等，而不溶解主要蛋白，从而允许彼此分离。此夕卜，在步骤(a)和(d)中被试剂1-4溶化的中至高分子量蛋白也与高含量主要蛋白分离，从而可被分析。本发明的步骤(f)为低温离心步骤(e)中所得的搅拌溶液并回收上清液。步骤(f)中的低温并无特别限制，只要样本中的蛋白等成分在该温度下保持稳定状态。该低温为，例如，0°c至10°C、优选0°C至5°C。该离心优选可在能够沉淀该体液样本中的蛋白和肽的条件下进行，例如，在3000Xg或更高、优选10000Xg至25000Xg下离心1分钟或更长时间，优选5分钟至30分钟。步骤(f)中获得的上清液是通过本发明的方法从体液样本中所获得的低分子量蛋白等的提取物。该上清液可直接用于蛋白组学分析等。本发明的步骤(g)为附加步骤，其为将步骤(f)中回收的上清液冻干的步骤。通过冻干，来自该体液样本的该低分子量蛋白等可被稳定地贮存，同时它们可根据分析方法以期望的浓度溶解在所期望的溶剂中并进行分析。该冻干的使用可不受特定的限制，只要其不破坏本发明提取的该低分子量蛋白等。本发明进一步提供了制备分析样本的方法，所述分析样本为包含在体液样本中的低分子量蛋白/肽，该方法包括向通过该方法获得的冻干产品中添加含有成分的试剂5，所述成分选自TFA、氢氯酸、甲酸、乙酸和TCA。优选地，试剂5含有0.1-20%的TFA。可选择地，试剂5优选含有0.1-20%的甲酸、乙酸、TCA或其混合物。试剂5可包含各种溶剂，包括水、乙醇、甲醇、乙腈、丙醇、丙酮及其混合物。在该制备方法中，可向1体积份数的体液样本中添加0.01-100体积份数、优选0.1-100体积份数、更优选5-100体积份数的试剂5。此外，本发明提供了用于提取包含在体液样本中的低分子量蛋白/肽的试剂盒。该试剂盒包括含有脲和硫脲的试剂1、含有还原剂的试剂2、含有90%或更多的有机溶剂的试剂3以及含有有机溶剂和酸的试剂4。该试剂盒中所用的试剂与上述本发明的方法中所用的试剂1-4相同。具体地，本发明的试剂盒包括试剂1，其具有脲浓度1-8M并且硫脲浓度为0.5-3M；试剂2，其含有上文所述浓度的还原剂；试剂3，其含有90%或更多、优选95%或更多的选自丙酮、乙醇、甲醇、2-丙醇、乙腈及其混合物的有机溶剂；以及试剂4，其含有50-99%的选自乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇及其混合物的有机溶剂以及选自氢氯酸、TFA、甲酸、乙酸和TCA的酸。此外，本发明的试剂盒包括试剂1，其含有浓度为3-8M的脲和浓度为1-3M的硫脲；试剂2，其含有浓度为10-300mM的还原剂；试剂3，其含有浓度为98%或更高的作为有机溶剂的丙酮；以及试剂4，其含有浓度为60-80%的作为有机溶剂的乙腈。此外，本发明提供了用于制备分析样本的试剂盒，其中所述分析样本为包含在体液样本中的低分子量蛋白/肽，该试剂盒包含了试剂1-4和试剂5，即含有成分的试剂5，其中试剂5被添加至提取的低分子量蛋白等的冻干产品中，且该成分选自TFA、氢氯酸、甲酸、乙酸和TCA。接下来，本发明将通过实施例进行详细和具体的描述。下文的实施例目的在于描述本发明，且不以任何方式限制本发明的保护范围。本发明的保护范围通过本申请的权利要求书的描述进行定义。实施例实施例1低分子量蛋白等的提取在本实施例中，采用人血清按照本发明来进行低分子量蛋白等的提取。图1显示了本实施例步骤的流程图。此处所述的“低分子量蛋白等”是指血清中分子量为20，000或更低的蛋白/肽，以及未通过本发明的方法去除的中至高分子量蛋白，且不包括大多数高分子量主要蛋白，如白蛋白。在本实施例中，20μ1的血清被用作体液样本。向该血清中添加36μ1试剂1(7Μ脲和2Μ硫脲)以及4μ1的试剂(200mMDTT)，然后涡流混合。为进行该步骤，所有的血清、试剂1和试剂2被冷却至4°C后使用。然后将该混合的溶液滴入1.8ml的冷却至4°C的试剂3中，所述试剂3含有高纯度丙酮，随后立即涡流混合，并在4°C环境下搅拌1小时。搅拌后，使用冷冻离心机在4°C下将该混合溶液离心(19，OOOXg)15分钟，完全去除所得的上清液。在4°C下，向残留的沉淀中添加400μ1试剂4(70%乙腈，12mM氢氯酸，平衡水)，并在4°C下搅拌1小时。然后，使用冷冻离心机在4°C下将该混合溶液离心(19，OOOXg)15分钟，并回收所得的上清液，作为低分子量蛋白等的溶液。然后，将提取的溶液冻干，并通过添加80μ1的试剂5(99.9%H2O和0.1%TFA)来溶解所获得的冻干产品。通过上述相同的方式，分别处理5μ1血清和4μgSPM的混合物、10μ1血清以及5μ1血清以得到样本用于分析。对于不同量的处理血清，改变该溶剂1-5的量以实现与20μ1血清相同的比例。例如，对于10μ1血清，试剂1-5的每一种的量为18μ1的试剂1、2μ1的试剂2、0.9ml的试剂3、200μ1的试剂4禾口80μ1的试剂5。实施例2通过Tricine-SDS-PAGE来检测本发明实施例1中获得的提取溶液可作为样本来进行检测，其通过低分子量的电泳(Tricine-SDS-PAGE)来分离溶液，并随后进行考马斯染色来检测。所用的样本为通过实施例1的方法获得的血清提取溶液、未处理的血清、标准肽混合物(SPM)以及未处理血清和SPM的混合溶液。本文所用的SPM为马心脏球蛋白的溴化氰降解产物，它是含有分子量为16，949、14，404、10，700,8,159,6,214和2，512的6种肽片段的混合物。SPM是在电泳中被用作分子量标记的试剂(由GEHealthcareBioScience生产)。本Tricine-SDS-PAGE中使用的凝胶具有下文表1所述的组成。[表1]Tricine-SDS-PAGE凝胶的组成分离胶(底层)~1.5MTris-HClpH8.453.3ml~48%丙烯酰胺(3%双丙烯酰胺)3.3ml甘油1.0ml蒸馏水2.4ml~<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>此外，该Tricine-SDS-PAGE在参考文献7所述的条件下进行。然后，取下含有展开样本的凝胶并进行考马斯染色。考马斯染色采用如下试剂和方法进行试剂1(染色溶液30%甲醇、10%乙酸、0.[w/v]考马斯R-350、平衡水)试剂2(脱色溶液30%甲醇、10%乙酸、平衡水)在染色步骤中，从电泳后的凝胶板中取出该凝胶并转移至具有光滑表面的清洁容器中。然后，将试剂ι添加至该容器中以将该凝胶浸泡在试剂1中，并振荡20分钟。振荡后，去除试剂1。然后加入试剂2以将该凝胶浸泡在试剂2中，然后振荡至背景颜色适当变浅。所得的结果显示于图2。泳道(a)显示了由4μgSPM所得到的结果；泳道(b)显示了由0.5μ1未处理的血清所得到的结果；泳道(C)显示了由按照实施例1的方法处理的5μ1血清和4μgSPM的混合物所得到的结果；泳道(d)显示了由通过实施例1的方法处理的5μ1血清所得到的结果；而泳道(e)显示了由通过实施例1的方法处理的10μ1血清所得到的结果。电泳图上方的表显示了血清的量、SPM的量以及是否经过实施例1的处理。泳道(d)显示了按照本发明方法进行处理，多数蛋白成分已被去除，尽管泳道(d)以5μ1血清作为分析物，其中泳道(d)为泳道(b)体积的10倍。此外，在泳道(d)中比泳道(b)中检测到了更高强度的低分子量蛋白等。在泳道(e)中显示了通过本发明方法处理的体积为泳道(d)两倍的血清的结果，低分子量蛋白等的成分检测到的强度约为泳道(d)的两倍。泳道(c)显示了由4ygSPM(与泳道(a)的体积相等)禾Π5μ1实施例1中提取的血清的混合物所得的结果。在比较泳道(c)和(a)的SPM条带时，所有的条带测得了基本相同的强度。这可以证明本发明的方法具有接近几乎100%的低分子量蛋白等的提取效率。由这些结果可知，本发明的方法能够有效回收SPM，并能够高效提取血清中的低分子量蛋白等。此外，通过倍增提取的血清量，提取物中低分子量蛋白等的成分也几乎倍增，这表明样本中的肽可以维持它们的数量信息的方式被提取。因此，本发明的方法表现为一种高效并能保持其数量信息，且不被载体蛋白影响的方式来提取低分子量蛋白等的方法。实施例3通过反相HPLC对本发明进行检测图3显示了通过反相HPLC分析采用实施例1的方法提取的低分子量蛋白等的样本的结果。图㈧显示了在保留时间为20-70分钟时的分析结果，图⑶显示了在图㈧中保留时间为30-40分钟时的色谱峰强度的5X放大图。此外，色谱图中的黑线代表了0.5μ1未处理血清的分析结果，色谱图中的灰线代表了由通过实施例1的方法处理的5μ1血清所得的样本的分析结果。在反相HPLC中，低分子量蛋白等倾向于在较早的保留时间(40分钟或更早)被提取，而高分子量蛋白等倾向于在较晚的保留时间(40分钟或更晚)被提取。色谱图中的灰线显示了低分子量蛋白等的结果，所述低分子量蛋白是从5μ1血清中按照实施例1的方法来提取的，其比色谱图中黑线的体积高10倍。比较色谱图㈧中灰线和黑线，在40分钟或更晚的保留时间中灰线上几乎没有可见的峰。该结果证实了大部分高分子量主要蛋白等(例如白蛋白)已被去除。此外，在色谱图(B)中，在黑线上几乎没有可测的峰，而在灰线上测得了多个峰。该结果证明了血清中的低分子量蛋白等被提取了。实施例4本发明方法的重现性确认为了确认本发明方法对于低分子量蛋白等的浓缩重现性，参照实施例1的方法分别对10μ1每种相同的血清提取6次，所得的提取物分别通过TriCine-SDS-PAGE进行分析。该结果显示于图4。如图4可见，测得的条带在所有的泳道中均相同，且在泳道中的相应条带测得了几乎相同的强度和厚度。该结果证实了本发明的方法可以较高的重现性来提取低分子量蛋白等。实施例5通过本发明的方法提取的低分子量蛋白等的鉴定通过实施例的方法提取的低分子量蛋白等用Tricine-SDS-PAGE显影，并鉴定可作为区分条带检测的主要肽和未去除蛋白。该方法和结果在下文显示。低分子量蛋白等的分离首先，通过Tricine-SDS-PAGE分离由实施例1的方法处理10μ1血清样本所获得的提取溶液。在考马斯染色后，切下待鉴别的条带以获得多个凝胶片。该凝胶片采用含50%乙腈的50mM重碳酸铵进行脱色。用蒸馏水洗涤该凝胶片，然后在100%乙腈中脱色15分钟，并在离心蒸发器中干燥60分钟。向该干燥的凝胶片中添加溶解于25mMTris-HCl(pH9.0)中的10-30μ1的0.5ng/μ1胰蛋白酶(RocheDiagnosticsGmbH)，其在冰上于45分钟内吸收至凝胶片中。然后去除过量的胰蛋白酶溶液，并向其添加50mMTris-HClpH9.0从而将该凝胶浸泡在该溶液中，然后在37°C下凝胶内消化18小时。酶消化完全后，回收该凝胶片周围的所有溶液，并临时储存在冰上。为了进一步回收仍然残留在凝胶中的肽片段，向其添加含50%乙腈的5%甲酸溶液从而将该凝胶浸泡在溶液中，并将该混合物在室温下搅拌20分钟。搅拌后，将上清液添加至事先贮存的前一溶液中。用LC-MS*装置检测该溶液，使用蛋白鉴定软件(SEQUESTSEARCH=ThermoFisherScientificInc.)进行数据库检索。IX-MS液相色谱_质谱液相色谱NanospaceSI-2(ShiseidoFinChemicals)质谱LCQ-DECA(由ThermoFisherScientificInc.生产)分析结果分离的低分子量蛋白等的条带显示于图5，鉴定结果显示于表2。图5左侧显示了条带中低分子量蛋白等的分子量，右侧显示了鉴定的蛋白等的条带号。表2中的条带数量与表5中的对应。在表2中，分子量代表了鉴定的蛋白/肽在数据库中所示的分子量，而蛋白等的名称代表了鉴定的蛋白/肽的名称。如图5的Tricine-SDS-PAGE结果所示，鉴定得到了分子量为20，000或更高的蛋白，以及分子量为20，000或更低的低分子量蛋白等。[表2]血清中肽等的鉴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如表2所示，在每个切除的凝胶片中存在多个实际得到鉴定的蛋白/肽，尽管它们在图5中显示为一个条带。该结果表明所得的提取物包含了大量的低分子量蛋白等。此外，从右侧分子量估计，图5中11号条带表示的分子量应该为约11，000。然而，在该条带号鉴定的多个蛋白包括了分子量47，000的蛋白，其事实上大于估计的分子量。这表明鉴定得到了裂解的蛋白片段。该结果显示在低分子量蛋白等范围内的多数条带包含了裂解的蛋白片段。该蛋白片段包括由于细胞坏死或凋亡而释放到血液中的蛋白片段(参考文献2)。因此，该蛋白片段可反映不同的体内信息。图5中的2号条带通过条带强度证实为约2μg，并含有作为鉴定蛋白的白蛋白。每10μ1健康人体的血清中发现的白蛋白的量约为600μg(参考文献2)。该结果表明约99.7%的作为典型蛋白的白蛋白被去除。此外，表2中低分子量蛋白等区域的条带号13处的载脂蛋白C-II在10μ1健康人体的血清中发现的量仅为约0.3μg(参考文献3)。因此，该载脂蛋白C-II不是血清中的主要成分(参见图1)。在血清中白蛋白和载脂蛋白C-II之间的浓度比较中，白蛋白存在的浓度为载脂蛋白C-II浓度的约2，000倍。作为采用本发明的方法浓缩的结果，浓度相差约2，000倍的白蛋白和载脂蛋白C-II可同时被电泳测得。这表明了大部分白蛋白已被去除，而载脂蛋白C-II被有效地提取。比较实施例1与常规方法(丙酮沉淀法)的比较通过与作为常规的一般肽提取方法(提取方法)的(1)丙酮沉淀和(2)超滤法比较，评估了本发明方法的蛋白去除效率和肽提取效率。丙酮沉淀法在丙酮沉淀法中，蛋白分子表面的结合水由于丙酮的溶解而损失，从而导致蛋白的溶解度迅速下降，并通过蛋白间的结合而沉淀。蛋白通过与溶剂的水合形成了稳定的三维结构，因而易于通过采用高浓度有机溶剂沉淀。相反，肽通常呈不具有三维结构的溶解形式，因而很难沉淀。丙酮沉淀法是一种通过利用有机溶剂存在下的溶解度差异，仅将肽作为可溶组分提取的方法。因此，当血清滴入丙酮溶剂时，蛋白被沉淀。因而仅有肽作为可溶组分被回收。丙酮沉淀法的步骤在本比较实施例中，该丙酮沉淀法可参照Matsuo或Chertov等人(参考文献4和5)的方法实施。图6显示了丙酮沉淀法的流程图。混合SPM的血清和未混合的血清被用作评估肽提取效率的样本。首先，通过11的比例混合血清和7M脲/2M硫脲来稀释血清。将稀释的血清(10μ1)缓慢滴入冷却至4°C的90μ1的75%丙酮，并将混合物在4°C下搅拌1小时。通过4°C下19，OOOXg离心15分钟回收可溶组分，并冻干。将冻干的产物溶解于20μ1用于PAGE的样本缓冲液中，并通过Tricine-SDS-PAGE分析。该用于PAGE的样本缓冲液的组成为50mMTris-HCl(pH6.8)、50mMDTT、0.5%SDS和10%甘油。用7M脲/2M硫脲稀释血清可使血清所含的蛋白变性。这还使蛋白酶灭活，从而减少它的影响(参考文献5)。此外，载体蛋白结合肽的回收被认为是可能的，因为载体蛋白也被变性。结果和评价图7显示了通过丙酮沉淀法从血清提取的肽经Tricine-SDS-PAGE分离后考马斯染色的结果。泳道(a)显示了由8ygSPM得到的分析结果；泳道(b)显示了由0.5μ1未处理的血清得到的分析结果；泳道(c)显示了由经过丙酮沉淀法处理的5μ1血清和8μgSPM的混合物得到的分析结果；泳道(d)显示了由经过丙酮沉淀法处理的5μ1血清得到的分析结果；而泳道(e)显示了由经过丙酮沉淀法处理的8ygSPM得到的分析结果。电泳图上方的表显示了血清的量、SPM的量以及是否经过丙酮沉淀法处理。泳道(d)显示了多数蛋白(分子量20，000或更高)通过丙酮沉淀法的处理而被去除，尽管泳道(d)显示了由5μ1血清(是泳道(b)的体积的10倍)得到的分析结果。该结果进一步表明肽成分(分子量20，000或更低)被提取，因为这些肽成分在泳道(d)中测得的强度高于泳道(b)。另一方面，由于丙酮沉淀，在泳道(d)中缺失了泳道(b)中分子量14，000-17，000范围内观察到的两条条带。此外，泳道(a)、(c)和(e)包含了相同量(Syg)的SPM。仅泳道(c)的样本中添加了5μ1血清。泳道(e)显示了由通过丙酮沉淀法处理的SPM的结果，其证实了所有的SPM成分被有效去除。然而，在显示了添加SPM的血清的结果的泳道(c)中，除了SPM中分子量6，000的成分以外的成分也由于丙酮沉淀法而缺失，从而未被测得。这提示SPM结合至载体蛋白并与其一同被去除，尽管血清已经通过7M脲/2M硫脲稀释。如图5所示，血清中两种主要的肽(分子量14，000和17，000)以及事先添加至血清的SPM由于采用丙酮沉淀法进行的肽提取而损失，这表明载体蛋白结合的肽无法通过丙酮沉淀法提取。特别地，丙酮沉淀法已显示难以以保留其数量信息的方式提取血清中存在的肽。比较实施例2与常规方法(超滤法)的比较超滤法是一种采用允许等于或小于特定大小的分子通过而更大的分子无法通过的超滤膜提取肽的方法。当血清通过超滤膜过滤时，理想情况下蛋白不能通过该过滤膜而被提取，而仅有肽通过该膜。因此，仅有肽成分可作为滤出液被分离。超滤法是一种便捷的高通量方法，因此常用于血清和血浆的肽提取。超滤法步骤在本比较实施例中，该超滤法可参照Tirumalai等人或Harper等人(参考文献2和6)的方法来实施。图8显示了超滤法的流程图。该超滤膜在洗涤后使用。洗涤可通过如下方式进行将25mM重碳酸铵/20%乙腈放在超滤膜(MICR0C0NYM-30,由Millipore公司生产，截留分子量30，000)上，并轻柔搅拌该混合物，然后3，OOOXg离心5分钟，随后去除滤出液。混合SPM的血清和未混合的血清被用作评估肽提取效率的样本。通过将血清与25mM重碳酸铵/20%乙腈按15的比例混合来稀释血清。将稀释的血清放置在如上洗涤的超滤膜上，并在4°C下3，OOOXg离心15分钟。回收所得的滤出液并冻干。将冻干的产物溶解于20μ1用于PAGE的样本缓冲液中，并通过Tricine-SDS-PAGE分析。该用于PAGE的样本缓冲液的组成为50mMTris-HCl(pH6.8)、50mMDTT、0.5%SDS和10%甘油。用25mM重碳酸铵/20%乙腈稀释血清的目的在于减少血清的粘度，并减少肽在过滤膜上的吸附(参考文献6)。结果和评价图9显示了通过超滤法从血清提取的肽的Tricine-SDS-PAGE分析结果。图9(A)显示了考马斯染色结果，而图9(B)显示了银染色结果。银染色的灵敏度比考马斯柒色高20-30倍。泳道(Al)和(Bi)分别显示了由4μgSPM得到的分析结果；泳道(A2)和(B2)分别显示了由0.5μ1未处理血清得到的分析结果；泳道(A3)显示了由通过超滤法处理的5μ1血清和4μgSPM的混合物得到的分析结果；泳道(A4)和(B3)分别显示了由通过超滤法处理的5μ1血清得到的分析结果；泳道(Α5)和(Β4)分别显示了由通过超滤法处理的10μ1血清得到的分析结果；而泳道(Α6)和(Β5)分别显示了由通过超滤法处理的100μ1血清得到的分析结果。电泳图上方的表显示了血清的量、SPM的量以及是否经过超滤法处理。(A)基于考马斯染色的评价泳道(A3)显示了由经超滤处理的4μgSPM(与泳道(Al)的体积相等)和5μ1血清(是泳道(Α2)体积的10倍)的混合物得到的结果。它显示了蛋白和SPM被完全去除，因为它们未被测得。此外，泳道(Α4)、(Α5)和(Α6)分别显示了经过超滤法处理的5μ1、10μ1和100μ1血清所得的结果。在所有这些泳道(Α4)、(Α5)和(Α6)中，蛋白和肽均未被测得。这些结果证实了超滤法具有极高的蛋白去除效率，但具有极低的肽提取效率。(B)基于银染色的评价泳道(Β3)、(Β4)和(Β5)分别显示了经过超滤法处理的5μ1、10μ1和100μ1血清所得的结果。肽仅在泳道(Β5)中的100μ1处理的血清中测得。通过泳道(Β5)和泳道(Β2)(0.5μ1未处理血清)的比较，可以看到泳道(Β5)中的蛋白被完全去除。此外，对肽成分进行比较时，在体积为泳道(Β5)血清体积1/200的泳道(Β2)中测得了更多的条带，显示超滤法的肽提取效率为0.5%或更低。(A)和⑶的结果证明超滤法可以完全去除蛋白，但仅有0.5%或更低的极差的肽提取效率。已知蛋白会由于吸附至超滤膜而损失。因此，超滤法极差的肽提取效率可能的原因是大部分肽由于吸附至超滤膜而无法通过超滤膜以及载体蛋白结合肽与载体蛋白在膜上的浓缩而导致的。讨论(本发明方法、丙酮沉淀法和超滤法的比较)从血清和SPM的混合物提取肽，然后通过Tricine-SDSPAGE分析，以考察肽提取法的蛋白去除效率，并基于SPM残留量评估它们的肽提取效率。在常规丙酮沉淀和超滤法中，尽管这些常规方法具有高蛋白去除效率，但除了通过丙酮沉淀法提取了SPM中分子量6，000的肽这一唯一例外，大部分SPM成分都损失了。损失SPM的可能原因在于，在丙酮沉淀法中，载体蛋白吸收的肽无法回收，而在超滤法中，大部分肽由于超滤膜以及无法回收的情况而损失。为了解决这些问题，开发了本发明的方法并通过(I)Tricine-SDS-PAGE和(2)反相HPLC评估了它的蛋白去除效率和肽提取效率。此外，通过(3)Tricine-SDS-PAGE评估了本发明的方法的重现性。此外，进行了(4)通过本发明方法提取的主要的肽的鉴定。如(I)Tricine-SDS-PAGE的结果所示，本发明的方法具有高蛋白去除效率，并可以回收通过常规方法无法回收的所有SPM成分。这证明了本发明的方法可以高效提取肽，而不受载体蛋白影响。(2)反相HPLC的结果还证明了本发明的方法具有高蛋白去除效率，并可以检测许多肽峰并有效地提取肽。此外，(3)Tricine-SDS-PAGE的结果证明了本发明的方法可以以高重现性提取肽。此外，(4)通过本发明方法提取的主要的肽的鉴定证明了即使仅就主要的成分而言，许多肽存在于通过本发明方法获得的提取物中，且该提取物包含了具有不同体内信息的蛋白片段。进一步证明了本发明的方法可以去除99.7%的白蛋白(血清的主要蛋白成分)，并可有效提取仅有血清中白蛋白体积1/2000的载脂蛋白C-II。由于本发明采用了有机溶剂和酸，人们担心蛋白可被本发明的方法裂解而人工形成其片段。然而，由于SPM可以极高效率提取，这种可能性并不存在。此外，试剂4中的氢氯酸的可能影响也被消除了，因为即使在120mM的氢氯酸浓度下也未观察到裂解。这些结果表明，根据本发明获得了具有高蛋白去除效率并以保留肽的定量信息的方式高效高重现性地提取肽(包括载体蛋白吸附的肽)的方法。这些结果总结于图10中。通过泳道3、8和13之间的比较可见，即使SPM也可通过本发明的方法有效回收。相反地，SPM几乎无法通过丙酮沉淀(A)和超滤(F)法回收。此夕卜，血清中载体蛋白吸附的SPM可能被丙酮沉淀和超滤法随该载体蛋白一同去除。还显示在本发明的方法中，提取了SPM以外的大量血清衍生肽。此外，由泳道4、9和14之间的比较可见，本发明的方法具有比丙酮沉淀或超滤法高得多的血清衍生肽回收率。参考文献[1]Fukutomi等人“Asimplemethodforpeptidepurificationasabasisforpeptidomeanalysis，，，(J.Electrophoresis4915,2005)[2]TirumalaiRS,ChanKC,PrietoDA,IssaqHJ,ConradsTP,VeenstraTD."CharacterizationoftheLowMolecularWeightHumanSerumProteome.，，(M01.Cell.Proteomics2003；21096-103)[3]KogaS,JapaneseJournalofClinicalMedicine,53,extraissue,654,1995[4]MatsuoT禾口NishiN,LectureonNewChemicalExperiments,1,ProteinISeparation/Purification/Properties,3章ExtractionMethodsforUnconventionalProteins禾口第7章FractionalPrecipitation[5]ChertovO,BiragynA,KwakLW,SimpsonJT,BoroninaT,HoangVM,PrietoDA,ConradsTP,VeenstraTD,FisherRJ.“Organicsolventextractionofproteinsandpeptidesfromserumasaneffectivesamplepreparationfordetectionandidentificationofbiomarkersbymassspectrometry.，，(Proteomics2004；41195-203)[6]HarperRG,WorkmanSR,SchuetznerS,TimpermanAT,SuttonJN.“Low-mo1ecu1ar~weighthumanserumproteomeusingultrafiltration,isoelectricfocusing,andmassspectrometry.，，(Electrophoresis2004；251299-306)[7]SchaggerH,vonJagow,G.“Tricine-sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresisfortheseparationofproteinsintherangefrom1to1OOkDa".(Anal.Biochem.1987；166368-379)工业适用性本发明的方法可以有效提取那些难以提取的载体蛋白所结合的低分子量蛋白/肽。因此，本发明的方法允许通过各种色谱技术、质谱、电泳、NMR、ESR、各种光谱技术等来分析体液样本，特别是血清和血浆中的低分子量蛋白等。特别地，本发明地方法可广泛应用于医疗领域，例如针对血清或血浆等中的低分子量蛋白等的诊断、诊断标记物筛选以及药物开发。此外，本发明的方法可容易地进行自动化，从而允许开发用于血液中的低分子量蛋白等的自动化分析仪。图1为显示实施实施例1的步骤的流程图；图2为显示了用Tricine-SDS-PAGE分离实施例1所得的提取溶液，随后进行考马斯染色的结果的图；图3为显示了通过实施例1的方法提取的样本经反相HPLC分析的结果的数据；图4为显示了体现本发明方法的提取重现性的Tricine-SDS-PAGE的图；图5为显示了用Tricine-SDS-PAGE分离实施例1的方法处理的血清样本所得的提取溶液，随后进行考马斯染色的结果的图；在每个条带中鉴定了肽等；图6显示了比较实施例1中开展的丙酮沉淀法的流程图；图7为显示了通过丙酮沉淀法从血清提取的肽经Tricine-SDS-PAGE分离后进行考马斯染色的结果的图；图8显示了比较实施例2中实施的超滤法的流程图；图9为显示了通过超滤法从血清提取的肽经Tricine-SDS-PAGE分离后进行考马斯染色的结果的图；而图10显示了基于Tricine-SDS-PAGE结果对本发明的方法、丙酮沉淀法和超滤法的作用进行比较的结果。权利要求提取包含在体液样本中的低分子量蛋白/肽的方法，所述方法包括如下步骤(a)向所述体液样本中添加含有脲和硫脲的试剂1和含有还原剂的试剂2，将其混合，然后将所述混合物滴入含有90％或更多有机溶剂的试剂3，将其混合；(b)低温搅拌步骤(a)中所得的混合溶液；(c)低温离心步骤(b)中所得的搅拌溶液并去除上清液；(d)将含有有机溶剂和酸的试剂4添加至步骤(c)中所得的沉淀，将其混合；(e)低温搅拌步骤(d)中所得的混合溶液；以及(f)低温离心步骤(e)中所得的搅拌溶液并回收上清液。2.如权利要求1所述的方法，进一步包括步骤(g)冻干步骤(f)中回收的上清液。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述试剂2中的还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、三羧基膦(TCEPHCl)、三丁基膦(TBP)、2_巯基乙醇(2_ME)、2_巯基乙醇胺(2-MEA)及其混合物。4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述体液样本为血清或血浆。5.如权利要求1、2或3所述的方法，其中试剂1中脲的浓度为1-8M，硫脲浓度为0.5-3M，而试剂2包含的还原剂的量使得在体液样本、试剂1和试剂2的混合物中所述还原剂的浓度为lmM-20mM。6.如权利要求5所述的方法，其中试剂1的脲浓度为3-8M，硫脲浓度为1-3M。7.如权利要求5或6所述的方法，其中当试剂2中的还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、2-巯基乙醇(2-ME)、或2-巯基乙醇胺(2-MEA)时，试剂2中还原剂的量使得在体液样本、试剂1和试剂2的混合物中该还原剂的浓度为5mM-20mM，或当所述还原剂为三(2-羧乙基)膦HC1(TCEPHCl)或三正丁基膦(TBP)时，试剂2包含的还原剂使得在体液样本、试剂1和试剂2的混合物中该还原剂浓度为ImM-lOmM。8.如权利要求1、2或3所述的方法，其中试剂3中的有机溶剂选自丙酮、乙醇、甲醇、2-丙醇、乙腈及其混合物。9.如权利要求8所述的方法，其中试剂3中的有机溶剂为丙酮。10.如权利要求8或9所述的方法，其中试剂3包含浓度为95%或更高的有机溶剂。11.如权利要求8或9所述的方法，其中试剂3包含浓度为98%或更高的有机溶剂。12.如权利要求1所述的方法，其中试剂4中的有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇及其混合物，且浓度为50-99%，而所述酸选自氢氯酸、三氟乙酸(TFA)、甲酸、乙酸和三氯乙酸(TCA)。13.如权利要求12所述的方法，其中试剂4中的有机溶剂为乙腈。14.如权利要求12或13所述的方法，其中试剂4中的酸为氢氯酸，且浓度为5mM-500mM。15.如权利要求12、13或14所述的方法，其中试剂4中有机溶剂的浓度为60-80%。16.如权利要求12、13或14所述的方法，其中试剂4中有机溶剂的浓度为65-75%。17.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中，由步骤(a)所得的混合溶液在-20°C至10°C的低温下搅拌1分钟或更长时间。18.如权利要求17所述的方法，其中在步骤(b)中，由步骤(a)所得的混合溶液在0°C至5°C的低温下搅拌60分钟或更长时间。19.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(e)中，由步骤(d)所得的混合溶液在_5°C至20°C的低温下搅拌1分钟或更长时间。20.如权利要求19所述的方法，其中在步骤(e)中，由步骤(d)所得的混合溶液在0°C至5°C的低温下搅拌60分钟或更长时间。21.制备包含在体液样本中的低分子量蛋白/肽的分析样本的方法，所述方法包括向根据权利要求2所述的方法获得的冻干产品中添加含有成分的试剂5，所述成分选自TFA、氢氯酸、甲酸、乙酸和TCA。22.如权利要求21所述的方法，其中试剂5包含0.1-20%的TFA。23.如权利要求21或22所述的方法，其中试剂5包含0.1_20%的甲酸、乙酸、TCA或其混合物。24.用于提取包含在体液样本中的低分子量蛋白/肽的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有脲或硫脲的试剂1、含有还原剂的试剂2、含有90%或更多的有机溶剂的试剂3、以及含有有机溶剂和酸的试剂4。25.如权利要求24所述的试剂盒，其中试剂1的脲浓度为1-8M，硫脲浓度为0.5-3M；试剂2所含的还原剂的量使得在体液样本、试剂1和试剂2的混合物中该还原剂的浓度为lmM-20mM；试剂3中的有机溶剂选自丙酮、乙醇、甲醇、2-丙醇、乙腈及其混合物；试剂4中的有机溶剂选自乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇及其混合物，且浓度为50-99%；并且所述酸选自氢氯酸、TFA、甲酸、乙酸和TCA。26.如权利要求24所述的试剂盒，其中试剂1的脲浓度为3-8M，硫脲浓度为1-3M；当试剂2中的还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、2_巯基乙醇(2-ME)或2-巯基乙醇胺(2-MEA)时，试剂2所含的还原剂的量使得在体液样本、试剂1和试剂2的混合物中该还原剂的浓度为5mM-20mM，或者当所述还原剂为三(2-羧乙基)膦HCl(TCEPHCl)或三正丁基膦(TBP)时，试剂2所含的还原剂的量使得在体液样本、试剂1和试剂2中该还原剂的浓度为ImM-IOmM；试剂3中的有机溶剂为丙酮，且浓度为98%或更高；而试剂4中的有机溶剂为乙腈，且浓度为60-80%。27.用于制备包含在体液样本中的低分子量蛋白/肽的分析样本的试剂盒，其中所述试剂盒包括含有脲和硫脲的试剂1，含有还原剂的试剂2，含有90%或更多的有机溶剂的试剂3，含有有机溶剂和酸的试剂4，并进一步包括含有成分的试剂5，试剂5被添加至通过权利要求2所述的方法获得的冻干产品中，且所述成分选自TFA、氢氯酸、甲酸、乙酸和TCA。全文摘要本发明提供了提取体液样本(特别是血清或血浆)中包含的低分子量蛋白/肽的方法。本发明的方法包括步骤(a)至(e)(a)向该体液样本中添加含有脲和硫脲的试剂1和含有还原剂的试剂2，将其混合，然后将该混合物滴入含有90％或更多有机溶剂的试剂3，并将其混合；(b)低温搅拌步骤(a)中所得的混合溶液；(c)低温离心步骤(b)中所得的搅拌溶液并去除上清液；(d)将含有有机溶剂和酸的试剂4添加至步骤(c)中所得的沉淀，将其混合；(e)低温搅拌步骤(d)中所得的混合溶液；以及(f)低温离心步骤(e)中所得的搅拌溶液并回收上清液。文档编号G01N1/28GK101821618SQ20088011053公开日2010年9月1日申请日期2008年8月8日优先权日2007年8月8日发明者前田忠计,小寺义男,川岛祐介申请人:学校法人北里研究所