生腱蛋白-w用作结肠癌生物标记的用途的制作方法

专利名称：：生腱蛋白-w用作结肠癌生物标记的用途的制作方法
技术领域：
：本发明提供了针对结肠癌的新的血液、血浆或血清生物标记。
背景技术：
：肿瘤发生和发展不仅仅依赖于癌细胞中突变获得和积累所导致的遗传改变(综述请参见U)，还依赖于转化的上皮和肿瘤基质之间的交互应答(cross-talk)，其由多种细胞类型(例如活化的成纤维细胞、血管生成内皮细胞、浸润的炎性细胞)和经修饰的细胞外基质(ECM)组成3’4。最近几年，已经认识到癌细胞能够通过分泌促进允许生长的微环境形成的可溶性因子来改变并活化其邻近的基质，该微环境是完全的肿瘤表现所需的5_7。在大多数实体瘤中活化的成纤维细胞从头表达粘附调节ECM分子生腱蛋白_C7_9。生腱蛋白-C的肿瘤促进活性包括通过阻断多配体蛋白聚糖_4促进癌细胞的增殖w消除癌细胞在纤连蛋白上的铺展“1’11，诱导血管生成12，以及通过上调MMP-12增强细胞侵袭性13。另外，生腱蛋白-C可引发致癌信号发放通路，例如EGFR14’15、ERK/MAPK和Wnt16。重要的是，生腱蛋白-C是鉴定转移性乳腺癌细胞，尤其转移到肺的乳腺癌细胞基因表达特征的一部分17。因为在成年生物体中生腱蛋白-C不存在或者以非常低的水平表达，但是在肿瘤中重新表达18，所以有理由认为在大多数癌症中生腱蛋白-C表达的提高可反映在体液中生腱蛋白-C水平的提高上。事实上，已有报道称在不同癌症类型的患者血清中生腱蛋白-C水平提高，所述癌症类型包括神经胶质瘤、前列腺癌或结肠直肠癌、转移性黑素瘤、头和颈的鳞状细胞癌、以及非小细胞肺癌19_25。但是，癌症患者血清中生腱蛋白-C的值散布在一个宽的范围内，这些患者中有很大一部分具有正常的浓度，导致了生腱蛋白-C测定对检测癌症来说灵敏度较低。此外，高血清生腱蛋白-C水平与非癌症性肝病(包括肝炎和肝硬化)明显相关联26_29，以及与提高水平的C-反应蛋白(CRP)明显相关联21，该蛋白为感染、组织损伤或其他炎症疾病导致表达的急性期蛋白质3°’31。因此，需要可靠的血液或血清癌症生物标记。最初在纹斑鱼中鉴定到生腱蛋白-W，在其中所述蛋白质显示与生腱蛋白-C共表达自神经嵴细胞和体节中32。最近，鼠33和鸡34生腱蛋白-W已有描述，在这两种动物中，生腱蛋白-W在发育中的和成体平滑肌细胞和骨中表达。鸡生腱蛋白-W的功能包括调节颅盖细胞粘附以及体外扩散34。最先将生腱蛋白-W表达与肿瘤存在相关联的研究是在小鼠中进行的。使用致癌基因诱导的乳腺癌模型，显示生腱蛋白-W在肿瘤基质中高表达，其同时显著表达生腱蛋白-C35(也见于W0-A-03/080663)。功能性研究鉴定出小鼠生腱蛋白-W为促进乳腺癌细胞移动的分子35。最近，本发明人确认了在人乳腺癌组织的基质中存在生腱蛋白-w36。
发明内容本发明人出人意料地发现生腱蛋白-W的存在不限于癌症基质，且生腱蛋白-W可用作结肠癌的血液或血清生物标记。此外，在具有较高结肠癌复发风险的患者中生腱蛋白-W的血液或血清水平较高。因此，本发明提供了一种检测、诊断或预后结肠癌的方法，其包括测定获得自个体的血液、血浆或血清样品中生腱蛋白-W蛋白质的浓度，以及(b)将步骤(a)中测定的浓度与健康个体的血液、血浆或血清中生腱蛋白-W蛋白质浓度的标准值进行比较，其中相比于健康个体的血液、血浆或血清中生腱蛋白-W蛋白质浓度的标准值，生腱蛋白-W浓度增加指示结肠癌的存在。本发明还涵盖用于在血液、血浆或血清样品中检测、诊断或预后结肠癌的试剂盒，其包含生腱蛋白-W特异性的抗体或其片段。因此，本发明的一个实施方案是生腱蛋白-W的血液、血浆或血清浓度用作结肠癌生物标记的用途。本发明的另一个实施方案涵盖生腱蛋白-W特异性的抗体或其片段用于通过测定生腱蛋白-W蛋白质血液、血浆或血清浓度来诊断结肠癌的用途。因此，本发明的另一个实施方案是生腱蛋白-W作为结肠癌生物血液、血浆或血清生物标记的用途。图1、抗生腱蛋白-W抗体的综述(a)人TNW结构域结构的示意图。用线显示用作产生多克隆和单克隆抗体之抗原的重组全长TNW及其片段。已使用下列符号来表示所述结构域七残基重复序列(波状线)、EGF样重复(菱形)、FNIII结构域(框)、复制产生的FNIII结构域(黑框)、血纤蛋白原球形结构域(globe，圈)。(b)考马斯染色的凝胶(1-5泳道)和Western印迹(6_10泳道)。(1，6)TNW条件培养基10微升，(2，7)纤连蛋白2.5微克，(3，8)血纤蛋白原2.5微克，(4，9)纯化的TNC2.5微克，(5)纯化的TNW2.5微克以及(10)纯化的hTNW500纳克。免疫印迹分析显示检测抗体PAb(FL)特异性识别TNW，并且不与其他的测试蛋白质交叉反应。(c)可以通过与10微克/毫升纯化的生腱蛋白-W(FLhTNW)—起孵育阻断pAb(FL)与纯化的生腱蛋白-W(W)的反应性，但是与10微克/毫升的细菌表达FNIII3F/4片段一起孵育不阻断，而这两种生腱蛋白-W制备物都可阻断pAb(3F/4)的反应性(d)显示使用mAb29A作为捕获抗体、pAb(FL)作为检测抗体和连续稀释的纯化TNW的典型标准曲线的双对数(log-log)图。达到约0.005mg/lTNW浓度的检出限。图2、生腱蛋白-W血清水平(a)显示健康志愿者(η=25，均值0.389+/-0.145mg/l)和非转移性结肠直肠癌患者(η=17，均值0.794+/-0.38mg/l)的TNW血清水平。相比于志愿者，结肠直肠癌患者中的平均生腱蛋白-W水平(横线)有统计学上显著的增加。(b)显示健康个体和结肠直肠癌患者的血清TNC水平。它们显示，相比于健康个体(η=18，均值0.798+/-0.24mg/l)，平均血清TNC水平(η=17，均值0.98+/-0.24mg/l)增加。(c)显示非转移性乳腺癌患者(η=16，均值0.682+/-0.44mg/l)和健康志愿者中(η=25，均值0.389+/-0.145mg/l)的血清TNW水平。横线显示平均生腱蛋白值。图3、结肠直肠癌的生腱蛋白-W表达(a)通过免疫印迹检测十一个结肠直肠癌提取物(T)和三个正常结肠组织(N)中TNW和TNC的存在。分析显示正常黏膜中TNC低分子量同种型的基础表达，以及肿瘤组织中大多数大TN变体的上调。显示出于比较的目的上样的重组高分子量TNC同种型的位置(箭头)。在大部分的肿瘤组织中可检出TNW，但是在正常结肠黏膜中不可检出。(b)患者L的冷冻切片的免疫组织化学分析证实了免疫印迹的结果，显示肿瘤基质中对两种生腱蛋白都强染色。然而，在正常组织中对TNW没有检出染色，在黏膜肌层中观察到TNC的强染色。校正线250微米。N正常；T肿瘤。图4、冷冻结肠组织微阵列显示所示患者冷冻结肠TMA的使用抗TNC的mAb、抗TNW的pAb(3F/4)以及苏木精伊红染色的切片(H&E)的免疫组织化学(参见表III)。正常结肠黏膜(患者37)是TNW阴性，但是TNC阳性。TNC也在结肠平滑肌中强表达(患者36)。患者26显示为肿瘤与相邻正常组织边界的实例。在所分析的肿瘤患者1-32中(表III)，发现TNW独特地定位于肿瘤基质。在一些患者中，TNW阳性区域似乎是TNC阳性区域的子集(患者12)。患者15和5显示大(+++)区域的生腱蛋白阳性。患者4和13分别显示中等(++)至低(+)区域的生腱蛋白-W染色。一般说来，染色与所存在的肿瘤基质的量相关联。发明详述最近，本发明人评估了生腱蛋白-W在人乳腺癌组织中的存在36。继续对其进行研究，本发明人意外地发现生腱蛋白-W不限于癌症基质以及生腱蛋白-W可用作结肠癌的血液或血清生物标记。此外，本发明人发现在具有较高结肠癌复发风险的患者中生腱蛋白-W的血液或血清水平较高。因此，本发明提供了一种检测、诊断或预后结肠癌的方法，其包括测定获得自个体的血液、血浆或血清样品中生腱蛋白-W蛋白质的浓度，以及(b)将步骤(a)中测定的浓度与健康个体的血液、血浆或血清中生腱蛋白-W蛋白质浓度的标准值进行比较，其中相比于健康个体的血液、血浆或血清中生腱蛋白-W蛋白质浓度的标准值，生腱蛋白-W浓度增加指示可能存在结肠癌。“血液、血浆或血清样品”是所分析或所测定的物质，其可以但不一定接受预处理，以提供可分析形式的生腱蛋白-W。这需要本领域中已知的方法(例如参见ScopesProteinPurification!PrinciplesandPractice,第二版(Springer-Verlag,N.Y.,1987))。在本发明的较宽方面，对血液、血浆或血清样品的收集和操作没有限制，只要保持一致性即可。通过本领域已知的方法获得样品。通过使用多种技术可确保血液、血浆或血清样品中生腱蛋白-W或生腱蛋白-W活性测定的一致性。例如，为了控制每个样品的品质，可使用另一种酶活性比如碱性磷酸酶作为内参。另外，可在样品中与生腱蛋白-W同时测定内标，以作为测定条件的对照。因此，所述分析或测定步骤可包括检测样品中的对照蛋白质，任选地将所得的生腱蛋白-W的值相对于对照蛋白质所得的信号进行归一化。可通过使用本领域中已知的方法检测生腱蛋白-W蛋白质，来检测血液、血浆或血清样品中生腱蛋白-W的存在。在本发明中，对用于测定生腱蛋白-W或生腱蛋白-W活性的测定类型没有限制。例如，可通过使用生腱蛋白-W特异性抗体的免疫测定来检测生腱蛋白-W。所述抗体可用于，例如，双向凝胶的Wetern印迹，其中通过总细胞蛋白质或部分纯化蛋白质的酶联免疫测定或点印迹(抗体夹心法)测定鉴定所述蛋白质。优选地，生腱蛋白-W的血液、血浆或血清浓度以本领域公知的方法通过ELISA进行测定。样品浓缩和蛋白质纯化的方法描述于参考文献中(参见Scopes，1987)。例如，如果需要，可通过用硫酸铵沉淀或通过将血液、血浆或血清样品穿过市售蛋白质浓缩滤器例如Amicon或Millipore超滤单元来浓缩血液、血浆或血清样品中存在的生腱蛋白-W。血液、血浆或血清样品可施用到合适的纯化基质上，例如阴离子或阳离子交换树脂，或者凝胶过滤基质，或接受制备型凝胶电泳。在此情况下，在测定样品中生腱蛋白-W量时需要考虑每个纯化步骤后的生腱蛋白-W和蛋白质产率。在本发明的方法中，相比于健康个体的血液、血浆或血清中生腱蛋白-W浓度的标准值，步骤(a)中所测定的生腱蛋白-W浓度增加至少约两倍指示结肠癌复发的可能性较高。本领域技术人员会理解此阈值可根据情况增加。因此，该增加可以是例如，至少约2.5、3,3.5、4、4.5或5倍。出于本发明的目的，“约”意为+/-10%。在本发明方法的一些实施方案中，也可测定获得自个体的血液、血浆或血清样品中的生腱蛋白-C的浓度，并且与健康个体的血液、血浆或血清中生腱蛋白-C浓度的标准值进行比较。可根据本文对生腱蛋白-W的记载，测定生腱蛋白-C的浓度。可与生腱蛋白-W相类似地测定生腱蛋白-C的浓度。或者，可使用不同的方法测定血液、血浆或血清样品中的两种蛋白质。在本发明的方法中，可使用生腱蛋白-W和/或生腱蛋白-C特异性抗体或其片段测定生腱蛋白-W和/或生腱蛋白-C蛋白质的浓度。例如，可使用生腱蛋白-W特异性的抗体测定生腱蛋白-W，可使用其他生腱蛋白分子特异性的抗体进行对照测定。本发明还提供了用于通过测定生腱蛋白-W蛋白质的血液、血浆或血清浓度来诊断结肠癌的生腱蛋白-W特异性的抗体或其片段。产生抗体的方法是本领域公知的。可通过用免疫原性量的所述多肽免疫动物容易地获得生腱蛋白-W特异性的抗体。因此，本发明的抗体包括通过免疫动物获得的多克隆抗体和抗血清，可通过Western印迹、ELISA、免疫染色或其他本领域已知的常规过程确认其特异性识别生腱蛋白-W。众所周知，如果可通过致敏获得多克隆抗体，则可从致敏动物的淋巴细胞获得杂(H6AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress，1988)。因此，本发明还提供了用于通过测定生腱蛋白_W蛋白质的血液、血浆或血清浓度来诊断结肠癌的生腱蛋白-W特异性的单克隆抗体或其片段。产生多克隆和单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的，其记载于科学和专利文献中，参见，例如Coligan,CurrentProtocolsinImmunology,Wiley/Green,NY(1991)；Stites(编)BasicandClinicalImmunology(7Hjx)LangeMedicalPublications,LosAltos,CA，以及其中引用的文献(Stites)；Goding，MonoclonalAntibodiesprinciplesandPractice(第2版)AcademicPress,NewYork,NY(1986)；禾口Kohler(1975)Nature256495。这些技术包括从在细胞上的噬菌体或类似物中展示的重组抗体文库中选择抗体。参见Huse(1989)Science2461275和Ward(1989)Nature3415440可通过哺乳动物细胞中的瞬时或稳定表达载体表达重组抗体，如Norderhaug(1997)J.Immunol.Methods2M77-87。出于本发明的目的，用于通过测定生腱蛋白-W蛋白质的血液、血浆或血清浓度来诊断结肠癌的生腱蛋白-W特异性抗体还包括其活性片段。活性片段指具有抗原抗体反应活性的抗体片段。这些是活性片段，特别地命名为例如F(ab')2、Fab'、Fab和Fv。例如，如果用胃蛋白酶消化本发明抗体得到F(ab')2，如果用木瓜蛋白酶消化则得到Fab。如果用例如2-巯基乙醇的试剂还原F(ab')2并用一碘乙酸烷基化，则得到Fab'。Fv是其重链可变区与轻链可变区通过接头相连接的单活性片段。通过保存这些活性片段并用另一种动物的片段取代这些活性片段之外的片段获得嵌合抗体。特别地，还设想了人源化抗体。出于本发明的目的，术语“抗体”还涵盖scFv和能够特异性结合生腱蛋白-W的抗体样分子，例如嫁接于替代性支架的CDR的适体，其是本领域技术人员公知的。检测生腱蛋白-W的方法包括，例如，使用如上所述的抗体，任选地使用酶反应。可使用生腱蛋白-W抗体特异性的第二抗体检测识别生腱蛋白-W的抗体，其可任选地例如用放射性标记、酶、亲和素或生物素或者荧光物质(FITC或罗丹明)进行标记。在一个替代性实施方案中，所述识别生腱蛋白-W的抗体或其片段自身带有标记。标记可以是任何可检测的组合物，其中检测可以是光谱法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、物理或化学法。例如，可用标记包括32P，35S,3H,14C,125I，131I，荧光染料(例如FITC、罗丹明和镧系元素磷光体)、电子密集试剂、酶，例如ELISA中常用的(如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶和碱性磷酸酶)、生物素、地高辛(dioxigenin)，或者针对抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质是可用的。所述标记可直接引入待检测靶标化合物，或者可连接到结合所述靶标的探针或抗体。免疫结合测定是本领域已知的。综述参见MethodsinCellBiology，第37卷AntibodiesinCellBiology,Asai,(编著)AcademicPress,Inc.NewYork(1993)。贯穿本发明的测定，每次施用试剂或试剂组合孵育之后可能需要孵育和/或洗涤步骤。孵育步骤可从约5分钟至数小时不等，可能从约30分钟至约6小时。但是，孵育时间通常取决于测定形式、分析物、溶液量、浓度等等。通常，所述测定应在环境温度下进行，尽管它们可以在例如4摄氏度至40摄氏度的范围内进行。一个特别优选的测定形式是酶联免疫吸附测定(ELISA)。但是，本发明的方法和用途可以在体外进行，例如ELISA，以及在离体或体内进行，例如，使用固定在支持物上的抗体进行的在线监测。在一个实施方案中，本发明提供了用于在血液、血浆或血清样品中检测、诊断或预后结肠癌的试剂盒，其包含生腱蛋白-W特异性的抗体或其片段。本发明的试剂盒还可包含生腱蛋白-C特异性的抗体或其片段。这类试剂盒包含可用于进行本发明方法的试剂，例如来自一种或多种物种的生腱蛋白-W和生腱蛋白-C特异性的抗体。还可包含识别一种或两种这类第一抗生腱蛋白抗体的第二抗体，以识别和检测与结合样品的第一抗体。可以例如用荧光团、酶、放射性标记或其他物质标记这些第二抗体用以监测。其他检测标记是本领域技术人员了解的。作为替代地，可标记第一抗生腱蛋白-W抗体用以直接检测。除非另外定义，本发明中所有的技术和科学名词具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所记载的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或试验，但是下文描述了合适的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献在此完整引入作为参考。在有冲突的情况下，以包含定义的本说明书为准。另外，所述材料、方法和实施例仅为举例说明，而不作为限制。实施例材料和方法重组蛋白质如前所述克隆、表达和纯化人生腱蛋白-W和生腱蛋白-C36’37。使用明胶-琼脂糖柱从过滤灭菌的马血清中纯化纤连蛋白。用PBS洗涤柱子之后，用4M尿素洗脱纤连蛋白，最后用PBS进行透析。人血纤蛋白原购自Sigma(Sigma，Buchs，瑞士)。抗生腱蛋白-W抗体产生产生两种识别人生腱蛋白-W的多克隆抗血清。在兔子中产生抗纯化的全长人生腱蛋白-W的第一抗血清称为pAb(FL)36(图la，由长线段表示)。为了在兔子中产生第二多克隆抗血清，克隆、在细菌中表达并纯化人生腱蛋白-W的重组片段。为了克隆所述重组片段，设计特异性引物，以使用扩展高保真PCR系统(ExpandHighFidelityPCRSystem)扩增编码最后两个纤连蛋白III型结构域的序列(Roche，Rotkreuz，瑞士)。全长人生腱蛋白-W(如上所述)的cDNA用作模板，使用弓丨物对5‘-GAGGATCCGAAATTGACGGCCCCAAAAACC-3'/5'-ATAAGCTTATGTGGAGAGGGTGGTGGA-3‘进行PCR。正向引物包含BamHI限制性位点，反向引物包含终止密码子，其后紧接着HindIII限制性位点，以使得能够定向克隆进细菌表达载体PQE30(Qiagen,Hilden,德国)，提供C-端His标签用以纯化重组片段。表达对应于纤连蛋白III型结构域3F/4的重组片段(图la，分子下面的短线段)，并根据供应商的说明通过使用Ni-NTA介质(Qiagen，Hilden，德国)的亲和层析对其进行纯化。在天然条件下进行纯化，通过250mM咪唑(pH6.9)洗脱。然后，使用细菌表达的生腱蛋白-W片段在兔子中通过标准免疫步骤产生多克隆抗血清(pAb(3F/4))。为了在小鼠中产生单克隆抗体(mAb)，如上所述克隆、在细菌中表达并纯化含有最后三个纤连蛋白III型结构域的人生腱蛋白-W重组片段(图la，分子上面的短线段)。为了克隆所述重组片段，从通过Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad,CA，美国)从Saos-2细胞(ATCC#HTB-85)提取总RNA来合成cDNA。扩增最后三个FN类型III结构域的引物用于使用扩展高保真系统(Roche，Rotkreuz，瑞士)的巢式PCR，其使用Sa0S-2cDNA作为模板。使用引物对5'-GGGAAGGAGCAGAGTAGCACTG-3‘/5'-CCGCCTCTGGAAGACAATCC-3‘进行第一反应，使用引物5‘-AGGGATCCGACATTGACAGCCCCCAAAACC-3‘/5‘-CTAAGCTTTCATGTGGAGAGGGTGGTGGATAC-3‘进行第二反应。用于第二PCR的正向引物包含BamHI限制性位点，反向引物包含终止密码子，其后紧接着HindIII限制性位点，以使得能够定向克隆进细菌表达载体PQE30(Qiagen，Hilden，德国)，提供C-端His标签用以纯化重组片段。通过用34.6微克用STIMUNE(ID-Lelystad，InstituteforAnimalSciencesandHealth,Lelystad,NL)乳化的纯化重组生腱蛋白_W片段免疫雌性BALB/c小鼠获得MAb。用25微克生腱蛋白-W片段以4周为间隔注射小鼠两次，用以加强。将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞系P3X63Ag8.653(ATCC#CRL-1580)融合，并根据标准方案进行培养。通过使用构建物在HEK293细胞中表达的生腱蛋白-W片段的ELISA和western印迹来分析杂交瘤上清，所述构建物含有生腱蛋白-W的最后三个FNIII结构域的序列，其融合了含有其分泌信号和良好表征的抗鸡生腱蛋白-C抗体mAb60之表位的鸡生腱蛋白-C之N-端片段38。通过蛋白G琼脂糖(AmershanuOtelfingemCH)从条件培养基纯化来自两个mAb杂交瘤克隆(mAb29A和mAb560)的IgG，并用于本研究。夹心式ELISA用50微升mAb29A(捕获抗体，PBS中10μg/ml)在37摄氏度下涂布Immunolon1平底96-孔平板(DynatechLaboratories,Chantilly，VA，美国)1小时，再在室温下用PBS中的4%牛奶(封闭和洗涤溶液)封闭1小时。将所述平板洗涤两次之后，在37摄氏度下将50微升血清样品或标准品(纯化的人生腱蛋白-W)(两者都在封闭溶液中稀释)孵育1小时。在12至18的2倍系列稀释物中测定每种血清。弃去样品，用洗涤缓冲液彻底洗涤平板4次。与50微升pAb(FL)(检测抗体，在封闭溶液中1500，在37摄氏度下1小时)孵育后，再将平板洗涤4次，与过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(封闭溶液中12000，1小时37摄氏度)一起孵育。用洗涤缓冲液将平板洗涤四次以及用PBS洗涤两次后，通过加入100微升反应缓冲液(0.IM柠檬酸，0.2MNa2HPO4,4mM1，2-邻苯二胺，0.003%H2O2)进行酶显色反应。用50微升4MH2SO4停止反应，用VERSAMAX微板读数器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA，美国)在490nm相对于620nm读取平板。为了监测血清生腱蛋白-C，如前所述进行夹心式ELISA21，其使用抗人生腱蛋白-CmAbB28.13作为捕获抗体，多克隆鸡抗人生腱蛋白-C作为检测抗体(1500)以及过氧化物酶标记的山羊抗鸡IgG(l15，000)，使用纯化的人生腱蛋白-C作为标准品。患者群和血清制备患者在48岁至94岁之间(平均年龄70.3岁)，患有非转移性结肠直肠癌(CRC)并预定进行肿瘤切除。排除标准包括具有低于10g/dl血红蛋白、白细胞减少、血小板减少、最近三个月期间深部静脉血栓形成、长期血管导管、慢性血管或炎症疾病、最近4个月和6个月中分别进行了手术和化疗的患者。健康志愿者是性别混合的，在30至76岁之间，无癌症史、慢性病史或除了激素避孕之外的用药史。尽管43岁的平均年龄低于癌症患者，但是没有指示生腱蛋白-W水平随年龄增加。洛桑大学医院(LausarmeUniversityHospital)的地方道德委员会批准了伦理和科学许可。从所有患者和健康志愿者获得书面知情同意书。对于血清制备，将血液收集到无抗凝剂的管中。在IOOOg下离心10分钟后，提取血清并冷冻在-80摄氏度待用。所有肿瘤的组织学诊断和分级由一名病理学家(SW)根据WHO肿瘤分级进行检查39O使用国际抗癌联合会(恶性肿瘤的M分级)确定肿瘤分级4°。人组织提取和western印迹分析手术后立即在干冰上冷冻新鲜人组织。对于组织处理，在冰上解冻、切碎并在裂解缓冲液中勻菜(IOOmM磷酸盐缓冲液，pH8.0,300mMNaCl，8M尿素，Triton-X-100,IOmMβ-巯基乙醇，50mM盐酸胍以及完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Rotkreuz，瑞士))。将不溶物质沉淀，将还原SDS-PAGE样品缓冲液加入到上清中，在95摄氏度煮沸5分钟。在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，使用半干燥印迹装置(Millip0re，Bedf0rd，MA，美国)将蛋白质电转移至聚二氟乙烯(polyvinyldifluoride)膜上(Millipore，Bedford，MA，美国)。转移之后，用酰胺黑对膜进行染色，以调节相等的蛋白质上样。在含0.05%吐温和5%脱脂奶粉的TBS中室温封闭1小时之后，将膜与多克隆生腱蛋白-W抗血清(pAb(3F/4)；1750)、产生的抗生腱蛋白-W的mAb560(11000)，产生的抗生腱蛋白-C的mAbB28_13(1IOO)21,或者抗黏着斑蛋白的mAb(l2000;Sigma，Buchs，瑞士)一起孵育过夜，然后分别与偶联了辣根过氧化物酶(110，000)的抗兔IgG或抗小鼠IgG—起孵育1小时。使用SuperSignal使印迹显影(Pierce，Rockford,IL，美国)并曝光至KodakBioMaxMRFilm。免疫组织化学和冷冻组织微阵列由32个结肠癌和6个正常结肠黏膜的冷冻组织样品组成冷冻组织微阵列(TMA)。这些样品的病理特征总结于表III中(患者1-38)。如前所述在冷冻组织-TekOCT化合物(MilesLaboratories,Naperville,IL，美国)中构建TMA41。本发明人通过使用0.6mm钻(drill)产生接受孔(recipienthole)以取代常规的中空针优化了市售微阵列装置(BeecherInstruments,SunPrairie,WI,美国)。利用DABMap检测试剂盒(Ventana)，使用DiscoveryXT自动染色仪(VentanaMedicalSystems，Tucson，AZ，美国)进行所有免疫染色。冷冻组织载玻片在室温下干燥1小时，在丙酮中4摄氏度下固定10分钟，然后引入自动染色仪。对任何染色都不需预处理。首先，使用ABBlock试剂(Ventana)将载玻片进行12分钟的两次封闭。然后，将它们在37摄氏度下与抗生腱蛋白-C的mAbB28-13(l2500)和抗生腱蛋白-W的mAb560(l800)一起孵育1小时。之后，在37摄氏度下用生物素化通用二抗(Ventana)处理载玻片32分钟，用苏木精和靛青试剂(Ventana)对染。结果夹心式ELISA的精确性和灵敏度通过夹心式ELISA，使用mAb29A作为捕获抗体以及使用pAb(FL)作为检测抗体分析血清生腱蛋白-W水平(图la)。通过生腱蛋白-W条件培养基、纯化的纤连蛋白、血纤蛋白原、生腱蛋白-C和生腱蛋白-W的western印迹分析评估检测抗体的特异性(图lb)。抗生腱蛋白-W抗血清pAb(FL)特异性地与人生腱蛋白-W条件培养基反应，并且与纯化的生腱蛋白-W反应，但是不显示任何与已知存在于血清中的生腱蛋白-C或任何其他所测试相关蛋白质的交叉反应性(图lb)。为了进一步排除它们的检测抗体识别可能结合生腱蛋白-W的血清杂质，本发明人使用两种不同的多克隆抗人生腱蛋白-W抗体PAb(FL)和pAb(3F/4)进行生腱蛋白-W检测。表Ia显示两种多克隆检测抗体在相同血清样品中测得类似的生腱蛋白-W浓度，使得它们非常不可能与可能结合生腱蛋白-W的杂质血清蛋白质交叉反应。此外，pAb(FL)与pAb(3F/4)识别生腱蛋白-W的不同表位，因为与pAb(3F/4)不同，不能通过加入用于产生pAb(3F/4)的细菌表达片段来阻断pAb(FL)与生腱蛋白-W的反应性(图Ic)。测试了纯化的生腱蛋白-W的连续稀释物，本发明人得出以下结论使用新建立的夹心式ELISA，可检测低至0.005mg/l浓度的血清生腱蛋白-W。在图Id中，生腱蛋白-W的典型标准曲线显示为双对数图。当本发明人测试不同的捕获抗体(mAb560)时，获得与mAb29A相同的结果(数据未显示)，并决定使用mAb29A进行所有其余的夹心式ELISA。在一个测定中通过三次(“组内”，表Ib)或者在两个连续测定中一式两份(“组间”，表Ic)测试4个血清样品估计所述测定的精确性。组内的变异系数(CV)为5.6+/-1.3%，组间为6.52+/"4.9%。因此，本发明人建立了用于检测人血清样品中生腱蛋白-W的特异性且精确的夹心式ELISA。表I表Ia-两种不同检测抗体的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>通过夹心式ELISA使用两种不同检测抗体pAb(FL)和pAb(3F/4)分析的血清TNW水平。根据学生t检验，所测试的所有样品中血清TNW水平在两种不同检测抗体之间没有显著差异(P>0.05)。表Ib-测定精确性组内<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>通过在一个测定中三次测定4个血清样品估计精确性(组内)。SD=标准偏差；CV(%)=变异系数表Ic-测定精确性组间<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>通过在两个连续测定中一式两份测定4个血清样品估计精确性(组间)。SD=标准偏差；CV(%)=变异系数生腱蛋白-W在结肠直肠癌和乳腺癌患者中上调在结肠直肠癌患者的血清样品中显示生腱蛋白-C提高2°’25。然而，没有迹象表明对于生腱蛋白-W来说也是这样。尽管如此，本发明人测定了17个非转移性(在诊断时)结肠直肠癌患者的血清中的生腱蛋白-W水平，并且将其与25个健康志愿者血清中所监测的水平进行比较。对照血清中生腱蛋白-W的均值为0.389+/-0.14mg/l(图2a)。这约为公开的健康个体平均血清生腱蛋白-C水平的一半21’42。结肠直肠癌患者中的血清生腱蛋白-W浓度相比健康个体显著增加(P<0.01)，平均水平为0.794+/-0.38mg/l(图2a)。这对应于健康志愿者的2倍。对血清样品进行免疫沉淀(IP)以及随后的免疫印迹分析得到对单个生腱蛋白-W特异性条带的检测，对应于纯化的全长生腱蛋白-W的大小(数据未显示)。这显示，本发明人测定了血清中的完整成熟生腱蛋白-W蛋白质。本发明人还测定了生腱蛋白-C的相同血清，获得0.775+/-0.25mg/l的健康志愿者平均生腱蛋白-C水平(图2b)，其很好的匹配了文献中所述的范围21’42。结肠直肠癌血清中平均生腱蛋白-C值为0.98+/-0.24mg/1，对应于对照血清的1.2倍(图2b)。可用于该研究的结肠直肠癌症患者的临床病理特征以及其各自所测得的生腱蛋白-W和生腱蛋白-C水平列于表II。尽管这两种生腱蛋白在结肠直肠癌症患者中显示相同的水平增加的趋势，但是相比于志愿者癌血清中生腱蛋白-W均值的差异要显著的多。然而，并不是所有具有高生腱蛋白-C血清水平的患者也含有高水平的生腱蛋白-W(表II)，这表明这两种生腱蛋白在结肠直肠癌患者中并没有严格的相关性。尽管升高的血清生腱蛋白-W水平与结肠直肠癌分期之间没有明显相关性，但是值得注意5个在手术后肿瘤复发的患者中有4个具有高水平的生腱蛋白-W。复发患者的平均血清生腱蛋白-W水平(η=5)为1.02+/-0.34mg/l，其对应于非复发结肠直肠癌患者的1.5倍(η=12，均值为0.700+/-0.37mg/l)以及健康志愿者的2.6倍(表II)。表II-结肠直肠癌患者的临床病理特征和生腱蛋白水平<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>n.a.:不可用；分级=根据WHO肿瘤分类，2000的肿瘤分级；M(肿瘤，淋巴结(node)，转移)=根据UICC分类，2002的肿瘤分期；TNW，TNC通过夹心式ELISA推出的血清中蛋白质水平。a肿瘤辅助放疗(25/11/02-12/12/02)b使用5-氟尿嘧啶(5-FU)的辅助放疗(23/09/03-31/10/03)为了测试生腱蛋白-W是否是结肠直肠癌的特异性血清标记，或者测试生腱蛋白-W是否可以具有广谱的应用，本发明人分析了16个非转移性(在诊断时)乳腺癌患者血清中的生腱蛋白-W，并将其与健康志愿者中所检测的水平进行比较。乳腺癌群体中生腱蛋白-W的平均血清值为0.682+/-0.43mg/l。这相当于统计上显著的(ρ<0.02)增加至健康志愿者的1.75倍(图2c)。从这些数据中，本发明人得出下列结论与健康个体相比，在第一次治疗意图的手术时非转移性乳腺癌和结肠癌患者中生腱蛋白-W的血清水平升高。在正常结肠和癌症组织中的生腱蛋白-W表达为了确定肿瘤组织中的生腱蛋白表达的增加是否可解释结肠直肠癌患者中血清水平的升高，本发明人对11份结肠直肠肿瘤组织提取物进行了免疫印迹。如图3a所示，大部分肿瘤组织样品含有可检出水平的生腱蛋白_C(9/11；82%)0此外，在这些肿瘤提取物中也高表达生腱蛋白-W(9/11；82%)。在两个病例中(患者E和F)，生腱蛋白-W和生腱蛋白-C不存在，或者仅仅可检出，而所检测的所有其他样品显示两种生腱蛋白的共表达(图3a)。除了肿瘤组织之外，对于患者K和L来说相应地正常黏膜可获得，而对于患者J，本发明人仅获得正常组织。在所有测试的正常结肠黏膜中，生腱蛋白-W不可检出，即使相同患者的肿瘤组织提取物显示强生腱蛋白-W表达(患者K和L)。这与生腱蛋白-C相反，其在正常结肠黏膜中也可检出，但是相比于相应肿瘤样品水平低得多。对于生腱蛋白-C，本发明人检测到不同的同种型，而对于生腱蛋白-W，在所测试的提取物中主要观察到单个条带。但是，在患者B和I的肿瘤提取物中可检出第二条模糊的较低生腱蛋白-W条带。此较小的条带有可能代表生腱蛋白-W的降解产物，但是本发明人不排除可能由于低水平的替代性剪接。肿瘤和正常组织之间生腱蛋白-C同种型的表达不同。在正常结肠黏膜中，仅观察到低分子量的同种型，而在肿瘤提取物中，可检出低分子量和高分子量同种型。总之，大多数人结肠直肠癌表达两种生腱蛋白，但是它们的相对量在患者之间有很大不同。为了确认肿瘤组织中生腱蛋白-W和生腱蛋白-C的表达并且在所述组织中对其存在进行定位，本发明人通过免疫组织化学对患者K和L的正常结肠黏膜和肿瘤组织的冷冻切片进行染色。两个患者的染色模式相同。如患者L所示(图3b)生腱蛋白-C以及生腱蛋白-W的染色显示在肿瘤基质中非常强的表达，所述肿瘤基质是围绕癌细胞的特化结缔组织。正常结肠黏膜是生腱蛋白-C阳性的，但是与免疫印迹结果相一致的，非生腱蛋白-W阳性。在黏膜肌层中生腱蛋白-C表达很强，围绕腺体也存在其表达。综上，冷冻切片的免疫组织化学染色证实了相同结肠直肠癌提取物的免疫印迹所得的结果，显示生腱蛋白-W是结肠直肠癌中活化的肿瘤基质的新的标记。为了将此分析扩展到大量样品，本发明人对含有32个癌症点和6个正常结肠点的冷冻结肠组织微阵列(TMA)进行染色。毫无例外，对于生腱蛋白-W和生腱蛋白-C所有癌症组织切片都是染色的，而所有正常组织都是生腱蛋白-W阴性的，但是是生腱蛋白-C阳性的(表III)。所观察到的不同染色模式的实例显示于表4。正常结肠组织中大多数生腱蛋白-C阳性见于平滑肌(图4，患者36)。在一些肿瘤中，生腱蛋白-W和生腱蛋白-C染色看起来完全重叠(图4，患者4、5)，而在其他一些中，生腱蛋白-W阳性区是生腱蛋白-C阳性区的子集(图4，患者12)。如图4所观察到的(患者15)，肿瘤中的生腱蛋白-C阳性和生腱蛋白-W阴性区域也可能是由于平滑肌的存在，如肿瘤和正常组织的边界处所见的(图4，患者26)。染色的程度总是与肿瘤的基质区室重叠，如H&E染色的切片所判定的(图4)。在表III中，概括了患者数据，根据所观察的染色区域对染色模式进行分类。这显示，生腱蛋白-C具有比生腱蛋白-W略微更宽的分布。因为生腱蛋白-C在结肠的平滑肌中强表达，所以这可能反映了癌症基质中平滑肌细胞的存在。表III-冷冻TMA的临床病理特征和生腱蛋白染色<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>分级=根据WHO肿瘤分类，2000的肿瘤分级；M(肿瘤，淋巴结，转移)=根据UICC分类，2002的肿瘤分期；栏目中的分级+++>60%的肿瘤区域被染色；++>20%的肿瘤区域被染色；+<20%的肿瘤区域被染色。参见图4中每个栏目的实例。讨论在2006年，结肠直肠癌是欧洲癌症死亡的第二大死因，造成207，400人死亡(癌症死亡总数的12.2%)43。结肠直肠癌在确定的阶段中发展数年44。如果在早期(息肉或非侵袭性癌症)检测到肿瘤并通过内窥镜息肉切除术或手术切除，则在大多数病例中可防止结肠直肠癌造成的死亡。在此背景下，有效的筛选工具最为重要。由于经典的粪便潜血检测的低准确性和灵敏度，在数年里已经开发并研究了数种针对结肠直肠癌筛选的生物化学标志物，包括癌胚性抗原(CEA)血清水平45、半乳糖-N乙酰半乳糖胺粪便水平46以及人大便中的K-Ras突变47’48，但是没有一种对早期癌症检测足够灵敏且特异。最近，发现肿瘤M2-丙酮酸激酶(催化糖酵解途径最后一步反应的二聚化形式的酶)在胃肠癌(包括结肠直肠癌)患者的血浆和粪便样品中上调49_53。尽管如此，目前可用于预防和检测结肠直肠癌的最有效方法是结肠镜。但是，这种调查是侵入性，耗时，使人不适并且相对昂贵54。此外，每三到五年进行结肠镜检测的频率受到这些因素的限制，并且在两次结肠镜之间观察到癌症出现的情况并不罕见。因此，在血液中可检出的结肠癌替代性标志物可能是筛选及早期癌症检测的便利方法。在对新诊断或预后肿瘤标志物的寻找中，经常分析癌症患者血清中生腱蛋白-C的水平，并且其作为生物标记的潜在价值已经有评价21_23’55’56。尽管在某些癌症中已经发现生腱蛋白-C血清水平升高，但是其仍然是存在疑问的肿瘤标志物21。其水平散布在较宽的范围内，许多癌症患者具有正常的生腱蛋白-C浓度，并且其表达与炎症或感染的部位具有强相关性18。在此实施例中，本发明人评价了生腱蛋白-W作为结肠直肠癌中生物标记的潜力。使用不同的抗生腱蛋白-W抗体以及作为标准品的纯化蛋白建立了灵敏准确并且生腱蛋白-W特异性的夹心式ELISA。本发明人能够在健康志愿者和结肠直肠癌患者的血清中检出并测量生腱蛋白-W。健康个体中平均血清生腱蛋白-W水平为0.389+/-0.145mg/l。对照群体中均勻的低水平是癌症标志物的严格要求。相比之下，对照中生腱蛋白-C的血清水平高两倍并且散布在较宽的范围内。令人感兴趣地，本发明人观察到在结肠直肠癌血清中平均生腱蛋白-W水平明显提高(0.794+/-0.38mg/l)。图2a的柱状图(右)显示在结肠直肠癌患者群体中，有两个子群体一个具有提高的生腱蛋白-W水平(对照均值的约2.5倍)，另一个具有与对照相当的水平。这些组可代表血清中生腱蛋白-W提高的不同动力学，其中“正常”水平会在疾病发展的后期升高。另一个重要的问题是生腱蛋白-W的水平与更不利的疾病发展相关。在这一点上，值得注意结肠直肠癌患者的随访研究表明在治疗后肿瘤复发的5名患者中有4名的血清中具有高生腱蛋白-W水平(即高于均值)(表II)。这另外表明血清中生腱蛋白-W水平在预测复发或发展中的潜在价值。考虑血清中生腱蛋白-W或任何其他生物标记的存在可受到任何共发病(co-morbidity，例如心血管疾病、炎症疾病)或者通过肿瘤对其他器官(例如骨髓、肝脏)的间接作用的影响也很重要。例如，生腱蛋白-C血清水平显示与炎症而不是肿瘤发生相关联21，但是可发现结合的生腱蛋白-W与感染或炎症的存在没有相关性(自己的未公开结果)。本发明人证实生腱蛋白-C在结肠直肠癌患者的血清中以较高水平存在的趋势(0.98+/-0.24mg/l)，但是此提高相比于生腱蛋白-W要小得多。本发明人没有观察到两种生腱蛋白水平之间的相关性，也没有观察到其与原发肿瘤分类和分期的相关性。本发明人还监测到，相比于健康个体，非转移性乳腺癌患者中平均血清生腱蛋白-W水平的显著增加(1.75倍)。这表明生腱蛋白-W不是结肠腺癌特有的生物标记，而是可能具有广谱的应用。为了检测肿瘤中生腱蛋白-W的表达，本发明人通过免疫印迹研究了11个结肠直肠癌患者的肿瘤提取物，以及对于其中一些的相应正常组织。本发明可显示在82%的所述患者的肿瘤组织中可检出生腱蛋白-W以及生腱蛋白-C。因为对不同的结肠直肠癌患者进行肿瘤组织的免疫印迹分析，本发明人无法得出肿瘤中局部生腱蛋白-W表达与相应血清中循环水平的直接相关性。但是，在正常结肠黏膜中不存在生腱蛋白-W，与之相反，生腱蛋白-C在正常组织中也有表达(低水平)。有趣地，在正常组织中，仅存在生腱蛋白-C的低分子量同种型，而在肿瘤组织中，低分子量和/或高分子量同种型都过表达。此结果表明正常和肿瘤性人结肠组织中生腱蛋白-C同种型的差异表达。这与之前的下述报道一致，所述报道显示正常稳定组织中表达小同种型57，而在包括肿瘤、伤口愈合或炎症的患病组织中可检出较大变体58_61。相同患者的冷冻切片免疫组织化学分析表明两种生腱蛋白都有明显的基质染色。在含有32个不同结肠癌切片的冷冻TMA上确认生腱蛋白-C和生腱蛋白-W的基质染色。此研究表明所有肿瘤对两种生腱蛋白均染色，以及所述染色与肿瘤基质存在的量相关联。在人乳腺癌中得到类似的观察结果。生腱蛋白-W和生腱蛋白-C显示在大部分人乳腺癌中高表达。与表达生腱蛋白-C的正常结肠黏膜不同，正常乳腺实质组织对两种生腱蛋白都是阴性36。如本领域技术人员显而易见的，可容易地引入上述方法的改变以实现相同的目的。根据个体偏好可选择多种孵育条件、标签、装置和材料。本文提及的所有出版物如同其单独引入，在此完整引入作为参考。参考文献1.HanahanD,WeinbergRA.Thehallmarksofcancer.Cell2000;100:57-70.2.VogelsteinB,KinzlerKff.Cancergenesandthepathwaystheycontrol.NatMed2004；10:789_99·3.BissellMJ,RadiskyD.Puttingtumoursincontext.NatRevCancer2001；146-54.4.MuellerMM,FusenigNE.Friendsorfoes-bipoiareffectsofthetumourstromaincancer.NatRevCancer2004；4:839_49·5.BeachamDA,CukiermanΕ·Stromagenesis:thechangingfaceoffibroblastlcmicroenvironmentsduringtumorprogression.SeminCancerBiol2005；15:329-41.6.BhowmickNA,MosesHL.Tumor-stromainteractions.CurrOpinGenetDev2005；15:97-101.7.KalluriR,ZeisbergM.Fibroblastsincancer.NatRevCancer2006；6392-401.8.Chiquet-EhrismannR，MackieEJ,PearsonCA,SakakuraΤ.TenascinanextracellularmatrixproteininvolvedintissueInteractionsduringfetaldevelopmentandoncogenesis.Celll986；47131-9.9.OrendG.Potentialoncogenicactionoftenascin-Cintumorigenesis.IntJBiochemCeliBiol2005；371066-83.Epub2005Jan18.10.HuangW,Chiquet~EhrismannR，MoyanoJV,Garcia-PardoA，OrendG.Interferenceoftenascin—Cwithsyndecan-4bindingtofibronectinblockscelladhesionandstimulatestumorcellproliferation.CancerRes2001;61:8586_g4，11.MidwoodKS,ValenickLV,HsiaHC,SchwarzbauerJE.Coregulationoffibronectinsignalingandmatrixcontractionbytenascin-Candsyndecan-4.MolBiolCell2004；15:5670_7.12.ZagzagD，ShiffB，JalloGI，GrecoMA,BlancoC，CohenH，HukinJ，AllenJC，FriedlanderDR.Tenascin-Cpromotesmicrovascularcellmigrationandphosphorylationoffocaladhesionkinase.CancerRes2002；62:2660_8.13.SarkarSiNuttallRKiLiuSiEdwardsDRiYongVW.Tenascin-Cstimulatesgliomacellinvasionthroughmatrixmetalloproteinase-12.CancerRes2006；6611771-80.14.JonesPL，CrackJ,RabinovitchM.Regulationoftenascin-C,avascularsmoothmusclecellsurvivalfactorthatinteractswiththealphaνbeta3integrintopromoteepidermalgrowthfactorreceptorphosphorylationandgrowth.JCellBiol1997;139:279-93.15.SwindleCSiTranKT，JohnsonTDiBanerjeePiMayesAMiGriffithL，WellsA.Epldermalgrowthfactor(EGF)-likerepeatsofhumantenascin-CasligandsforEGFreceptor.JCellBiol2001；154:459_68·16.RuizC，HuangW,HegiME,LangeK，HamouMF,FluriE,OakeleyEJ,Chiquet-EhrismannR，OrendG.Growthpromotingsignalingbytenascin-C[corrected].CancerRes2004；64:7377_85·17.MinnAJ，GuptaGP，SiegelPMiBosPDiShuW，GiriDD，VialeA，OlshenAB，GeraldWLiMassagueJ.Genesthatmediatebreastcancermetastasistolung.Nature2005；436:518-24.18.Chiquet-EhrismannR，ChiquetM.Tenascins!regulationandputativefunctionsduringpathologicalstress.JPathol2003；200488-99.19.HerlynM，GraevenU，SpelcherD，SelaBA，BennicelliJL，KathR，GuerryD.Characterizationoftenascinsecretedbyhumanmelanomacells.CancerRes1991；514853-8.20.RiedlS，BodenmullerH，HinzU，HolleR，MollerP，SchlagP，HerfarthC，FaissnerA.Significanceoftenascinserumlevelastumormarkerinprimarycolorectalcarcinoma.IntJCancer1995；64:65_9·21.SchenkSiMuserJ，VollmerG，Chiquet-EhrismannR.Tenascin-Cinserumaquestionabletumormarker.IntJCancer1995；61443-9.22.PauliC，StieberP，SchmittUM,AndratschkeM，HoffmannK，WollenbergB.ThesignificanceofTenascin-Cserumlevelastumormarkerinsquamouscellcarcinomaoftheheadandneck.AnticancerRes2002；22:3093_7·23.IshiwataT，TakahashiK，ShimanukiY，OhashiR，CuiR，TakahashiF，ShimizuK，MiuraK，FukuchiY.Serumtenascin—Casapotentialpredictivemarkerofangiogenesisinnon-smallcelllungcancer.AnticancerRes2005;25:489-95.24.TakedaA，OtaniY，lsekiH，TakeuchiH，AikawaK，TabuchiS，ShinozukaN，SaekiT，OkazakiY，KoyamaI.Clinicalsignificanceoflargetenascin—Csplicedvariantasapotentialbiomarkerforcolorectalcancer.WorldJSurg2007；31388-94.25.TakedaA，OtaniY，HirookaE，OkadaK，ToriiT，ShinozukaN，KoyamaI.PlasmaIargeTenascin-Csplicedvariantasapossiblebiomarkerforthepredictionofhepaticrecurrenceincolorectalcancer.Surgery2007;141:124-5·26.YamauchiM，MizuharaY，MaezawaY，TodaG.Serumtenascinlevelsinchronicliverdisesse.Liver1994;14:148-53·27.TanakaH,EI-KarefAiKaitoMiKinoshitaNiFujitaNiHoriikeSiWatanabeS，YoshidaT，AdachiY.Circulatingleveloflargesplicevariantsoftenascin—Cisamarkerofpiecemealnecrosisactivityinpatientswithchronichepatiti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