检测系统和方法

专利名称：检测系统和方法
技术领域：
本发明涉及用于检测来自样品的输出辐射的检测系统和检测方法。本发明还涉及 使得可编程设备能够执行该检测方法的计算机程序产品以及用于控制检测系统执行该检 测方法的步骤的控制器。
背景技术：
检测系统的一个实例是基于对样品的激励从而使其引起荧光，该荧光被检测以分 析该样品。此实例已经在核酸测试(NAT)中被使用。在用于检测疾病的遗传倾向性、用于 确定RNA表达水平或者识别例如导致感染的细菌和病毒的病原体的分子诊断中，这是核心 的要素。在许多情形中，特别是在病原体的识别中，在合理的样品体积中存在的目标DNA 的量非常低，且这不允许直接检测。需要扩增技术以获得可检测数量的目标材料。不同扩 增技术已被提出并在日常实践中使用。使用最广泛的扩增技术是基于所谓的聚合酶链式反 应(PCR)。扩增涉及在升高的温度(通常大于90摄氏度)使双链DNA变性，在降低的温度 (大约65度)将引物特异地结合到DNA样品，以及(在大约70度)拷贝从引物位置开始的 原始序列。这个过程被重复且在每个循环中，具有特定序列的DNA的量翻倍(当以100%效 率进行时)。在扩增之后，通过比如在毛细管内电泳分离之后或者在杂化到所谓的捕获探针 (该捕获探针应用在一表面上的多个点处，扩增产物在该表面上流过)之后，在端点测量被 标记的扩增DNA的荧光强度，由此检测目标DNA的存在。这些方法称为端点PCR检测方法。 这些方法通常不允许定量确定具体DNA序列的初始浓度，而是定性地回答某些目标序列是 否存在于样品内。对于目标DNA浓度的定量确定，所谓的定量(q-PCR)或实时PCR技术是可用的。 q-PCR是基于PCR扩增的一般方法，但是其允许在每个扩增循环结束时动态地监视DNA浓 度。这是基于特殊的荧光探针，该荧光探针仅在杂化到扩增DNA产物时发光。不同的方法是已知的，且图1中示意性示出两种方法。在图Ia中，由圆形代表的 CBRgreen荧光团被猝灭，S卩，如果该荧光团不并入到双链DNA分子内，它们不发荧光。它们 在结合到双链DNA时变为是荧光的，如在10处所示。随着在PCR每个循环之后双链DNA浓 度的增加，荧光信号将增加且必须被测量以分析复制情形。可替换的方法使用图Ib示意性示出的所谓Taq Man探针。该方法受约束于变性 之后的单链DNA的特定序列。在这种状态下，能量传递到相邻染料则使荧光团猝灭。当序 列从引物开始被复制时，如示意性所示，探针被切断并从模板除去。荧光信号的量与所释放 探针12的量成比例，所释放探针12的量与DNA分子的数量成比例。已经发展了具有类似特性的若干种可替换探针技术。从引言将清楚明了，对于定性确定具体目标DNA样品的存在而言，以及对于定量确定样品中存在的DNA的量而言，都需要检测荧光。

发明内容
本发明的目的是提供一种能够满足上述要求的检测系统和检测方法。本发明由独立权利要求限定。从属权利要求限定有利实施例。根据本发明，提供了一种用于检测来自样品的分析区域的输出辐射的检测系统和 检测方法，其中分析区域的尺寸可以由操作装置而在不同检测操作模式之间变化，利用该 操作装置，通过在系统的辐射输入端上改变该系统而可以改变该分析区域(或者相当于辐 射输入区域)。输入辐射可通过聚焦来提供。在至少一个所述检测模式中可以使用衍射限制光斑。在本发明的上下文中，分析区域应解读为具有分析体积形状的分析体积。分析体 积可以在笛卡尔坐标系统中限定，该笛卡尔坐标系统的ζ轴取向为沿着与样品表面垂直的 方向。χ和y轴则生成与ζ轴的方向垂直的xy平面。从样品演化出来的输出辐射光束与具 有一些选定ζ坐标且包括在样品内的xy平面的交点限定了分析体积的截面并相应地限定 分析面积。在分析体积内不同ζ坐标处的分析面积在尺寸和/或形状上可以不同。分析区域以及因而分析体积或分析面积可取决于收集布置、聚焦布置或者二者的 构造而具有不同的尺寸和/或形状。例如，如果聚焦布置限定聚焦区域，该聚焦区域也将被 构造成聚焦体积，该聚焦区域完全被包含在分析区域内，即聚焦区域与分析区域完全交叠， 则收集布置限定该分析区域。因而分析面积可以是圆形、椭圆形、或者细长呈线形状。这些具有它们的优点，如 下文的描述中所阐述。分析体积的厚度通常是沿ζ轴测量。使用本发明的系统和方法，有 可能从样品用第一检测模式获得定性信息以及用第二检测模式获得定量信息，或者反之亦 然。例如，该系统提供了这样的可能性，即，改变分析区域，使得用第一模式可实现表面定向 检测而用第二检测模式可进行体积定向检测。可替换地或者附加地，在不同检测模式中，就 其在样品表面上的投影分析区域面积而言或者就不同的分析区域形状而言，可以提供不同 的分析区域。这些不同的检测模式可以例如有利地用于基于使用例如PCR确定寡或聚核苷酸 的传感器或诊断系统，因而本发明使得能够实现通过一种检测模式的端点检测以及通过另 一检测模式的实时PCR测量组合实施。该系统和方法也可用于RCA或NASBA过程。为检测系统提供改变装置用以改变分析区域的尺寸和/或形状，这允许该检测系 统能够在至少两种不同检测模式中操作。第一检测模式具有第一尺寸的分析区域以及第二 检测模式具有第二尺寸的分析区域，该第二尺寸不同于第一尺寸。利用一种检测模式得到 定性样品信息而利用另一种模式得到定量样品信息。取决于样品的属性，分析区域的尺寸改变可以作为显著改变分析面积而不显著变 更分析面积厚度来达成，或者相反，或者这二者。每一种具有如下文所阐述的优点。在本发明中，分析区域是在系统的输入辐射端上被变更，或者在该方法的提供输 入辐射的步骤中被变更。因此，检测设备布置成用于检测由于输入辐射与样品的相互作用引起的输出辐射，其中输入辐射与样品的相互作用产生该输出辐射。为此，在一实施例中， 辐射收集布置例如布置成收集被样品散射、反射和/或透射的输入辐射引起的输出辐射。 在此实施例中，输入辐射的频率范围基本上与输出辐射的频率范围相同。在另一优选实施 例中，辐射收集布置安排成收集形式为发光辐射的输出辐射，该发光辐射包括荧光和磷光 辐射。在此实施例中，输入辐射是激励样品并使得从样品发射发光辐射的激励辐射。通常， 作为发光辐射的输出辐射的频率范围一般不同于作为激励辐射的输入辐射的频率范围。检测系统可以是光学检测系统且辐射收集布置安排成检测例如来自UV和/或可 见光谱的辐射。检测系统适合作为用于检查化学、生物和/或生物化学样品的表征或分析系统。 样品可以是固体、液体和/或气体。它们可以是基本上纯的物质和/或同质或异质混合物。如果在一种模式中只需一次确定样品组成，而在另一种检测模式中需要测量样品 组成随时间的改变或变化，特别是鉴于样品内正在演化的化学反应，该检测系统是有利的。本发明特别感兴趣的应用是生物传感或诊断领域。其允许就定性和定量组成而言 用于样品分析的灵活、可缩放且成本有效的方法。在化学或生物化学应用中，样品可以是包 括一种或多种待检测成份的溶液。该检测系统和方法可适于表征血液、唾液或者其它或者 纯的或者就成份(也称为目标或分析物)而言以任何方式制备的体液，该目标或分析物为 例如病毒、细菌、微生物、蛋白质、酶类、激素或其它监管物质，例如RNA和DNA序列的寡或 聚核苷酸或者药物或药剂。系统可以例如包括寡或聚核苷酸复制设备，例如聚合酶链式反应设备，下文中 的"PCR"设备。这种情况下，基于表面和体扫描模式，该检测系统可以是，但是无须在至少 两种模式中操作，该两种操作模式为用于定性或者端点PCR的第一检测模式，其中分析区 域具有第一尺寸且该系统是共焦的；以及第二检测模式，其中分析区域具有更大的第二尺 寸用以提供定量或实时PCR检测。PCR设备因而可有利地提供对寡或聚核苷酸即就它们的识别或属性而言的定性研 究，且其可提供例如PCR设备的扩增室内部的寡或聚核苷酸浓度的定量确定。其它复制设备包括那些基于例如在Expert Rev. Mol. Diagn. 5 (4)，2005，第 477-478页发表的文章中解释的滚环扩增(RCA)以及基于核酸序列扩增(NASBA)的设备。因而，该系统允许以灵活且成本有效的方式实施(定性和定量分析的)两种技术， 而不重新设计检测系统设备。在一实施例中，本发明是基于例如多种发光检测的多色辐射检测，使得能够多路 复用地确定样品内的两种或者更多种不同成份。多路复用通常由于同时检测而节省时间。 当如下文所阐述地使用例如成像检测，检测也是同时进行时，这尤为如此。在一实施例中，使得实现了在一种独立笛卡尔坐标或者笛卡尔坐标的组合中的样 品扫描选项。为此，检测系统可包括扫描辐射拾取单元，该扫描辐射拾取单元至少包括辐射 收集布置。在一实施例中，改变装置适于为分析区域在第一模式中提供第一分析面积以及在 第二模式中提供比第一分析面积大的第二分析面积。如果样品的属性使得与定性数据的测 量相比，定量样品信息的测量需要较大分析面积，则此实施例是有利的。这可由样品成份浓 度、样品成份动力学或热力学属性确定。例如，当分析面积的尺寸小到超过某一阈值时，对于来自与待检测成份溶液接触的固定表面的分析面积的输出辐射的测量可能不反映固定 在固定表面上时溶液内待检测成份的真实浓度。在一实施例中，检测系统为处于第一和第二检测模式至少其一中的共焦检测系 统。此外辐射检测布置包括共焦成像元件，例如形式为透镜的折射成像元件与孔径的组合， 共焦成像元件将输出辐射聚焦在该孔径上。孔径可以作为针孔布置在输出辐射路径内而位 于检测器之前。可替换地，孔径可以是检测器的像素。对于仅在所述检测模式之一内提供 共焦性的情形，共焦成像元件优选地布置成使得在不需要共焦属性的检测模式中其功能被 除去。这可以例如通过在该非共焦模式中从辐射路径移除孔径或者孔径和共焦成像元件来 完成。共焦检测可以例如被提供到至少该第一检测模式。对于布置成用于表面检测的检测 模式，共焦检测是有利的，因为共焦检测基本上滤波掉沿朝向辐射收集布置方向行进的任 何输出辐射，该方向与被聚焦在孔径上的方向不吻合。因此，共焦性大幅减少了对源于除了 放置在辐射检测布置的焦点处之外样品位置的辐射检测。来自焦点内分析区域之上或之下 的背景辐射因而大幅减少。其有利地被用于布置成在时间上跟随诸如复制过程的化学反应 的诊断系统。具有如此处前文所述的复制。后一种选择可提供在共焦性和体积扫描之间的切换。此外，该单元可以在共焦表 面扫描模式操作和非共焦体扫描模式操作之间切换，共焦表面扫描模式对于检测样品的表 面约束或固定分析物而言是优选的，非共焦体扫描模式对于样品的体积检查而言是优选 的。在模式之间的切换提供了检测系统的改进通用性，该切换是通过如本发明所限定的调 节共焦性来实现的。在本发明的大体上检测系统且特别地在此处前文所述的定性模式中，第一尺寸可 以对应于由聚焦布置形成的衍射极限光斑(例如为约1立方微米)，而第二尺寸大得多，例 如至少10立方微米，至少100立方微米，至少500立方微米或者至少1000立方微米。检测系统可包括诸如透镜的折射元件，该折射元件由辐射聚焦布置和辐射收集布 置共享，且该折射元件布置成用于提供输入辐射到样品并且收集来自样品的输出辐射。优 选地，输入辐射为激励辐射而输出辐射为发光辐射，使得折射元件为共享的激励/收集元 件。这提供了在频率属性方面容易地分离两种类型辐射。如共焦显微镜中所已知的，折射元件优选地是可扫描的以实施对样品的3D扫描。 例如，可以提供在独立笛卡尔坐标中的扫描。用于改变分析区域的尺寸的装置可包括用于改变辐射聚焦布置的焦点深度的装 置。通过提供向后平移聚焦，这可以将交点从点改变为体积。诸如透镜的准直折射元件可 以用于准直辐射源的输出，且分析区域的尺寸随后可以通过相对于辐射源移动准直折射元 件来改变。用于改变分析区域的尺寸的装置可以替代地包括用于在辐射源和分析区域之间 的路径内引入畸变的装置。这种故意的畸变同样可以增大在分析区域处，即在焦点处的体 积。用于引入畸变的装置包括例如波束成形(beam shaping)相位板。畸变可以是光学畸 变，取决于用于检测系统的辐射源。在一实施例中，用于改变分析区域的尺寸的装置包括光纤，其能够插入辐射源和 分析区域之间的辐射路径。这可提供在一面积各处的均勻光强度，且这进而可以限制系统 在样品上能够产生的焦点的最小尺寸或面积。
在一实施例中，用于改变分析区域的尺寸的装置包括散射元件或介质，其能够插 入辐射源和分析区域之间的辐射路径。在一实施例中，检测系统包括折射元件，该折射元件由辐射聚焦布置和辐射收集 布置共享，且安排成用于提供输入辐射到样品以及用于收集来自样品的输出辐射。此实施 例是有利的，因为系统部件通过共享而减少，因而减少制造成本和复杂性以及系统的尺寸。 此外，如果检测模式之一为或者共焦或者非共焦的表面检测模式，其中在输出产生物质的 数目减少的情形中，通常需要收集尽可能多的辐射时，高数值孔径折射元件可被使用。然 而，这种元件不是特别适合用于体积测量，因为分析区域将被约束到通常由这些元件提供 的非常小的聚焦体积。本发明现在使得能够在第二检测模式中扩大分析区域，而不散失在 第一检测模式中使用高数值孔径的优点。因此不需要更换折射元件。另外，在该系统中需 要一个辐射检测路径。辐射检测器可根据需要进行选择。在一个实施例中，辐射检测器包括用于检测辐 射的空间分布的像素，即其包括像素化辐射检测器。被激活的像素的数量和分布可以被恰 当地选择以在例如用于表面检测模式的小检测区域和用于体积检测模式的大检测区域之 间切换。在可替换实施例中，辐射检测器包括单一检测器表面，即，例如某些必需面积的仅 一个像素，检测系统则可进一步包括孔径构件，使得通过使用孔径构件，辐射检测器能够操 作于用于较大分析区域的大面积模式以及用于较小分析区域的小面积模式。辐射检测器可 以是例如电荷耦合器件(CCD)或者二极管阵列检测器。两种不同的成像透镜布置可以替代地被用于使得检测器能够操作于用于较大分 析区域的所期望的大面积模式和用于较小分析区域的所期望的小面积模式。与系统的特征相对应的特征具有相应的优点，本发明的方法可具有被包括在用于 寡或聚核苷酸复制过程内的附加步骤，该过程为例如PCR、RCA和/或NASBA。输入辐射可 以通过聚焦使用衍射极限光斑来提供。该方法可包括通过变更聚焦布置的焦点深度来改变分析区域的尺寸，该聚焦布置 提供输入辐射到样品的分析区域。该方法可包括下述步骤使用准直透镜来准直辐射源的输出，其中改变分析区域 的尺寸包括相对于激励辐射源移动该准直透镜。该方法可包括下述步骤通过在辐射源(24)和分析区域之间的输入辐射路径内 引入畸变，改变分析区域的尺寸。根据本发明还提供了一种计算机程序产品和一种用于控制检测系统以执行本发 明的检测方法的控制器。计算机程序产品可具有由诸如包括在计算机内的标准半导体技术 制作的集成电路的形状。


现在将参考附图更详细地描述本发明的实例，在附图中图Ia和Ib示意性示出在定量PCR技术中在DNA复制期间用于产生荧光的两种技 术；图2示出本发明的PCR设备；图3a和3b用于解释改变图2设备的操作模式的第一种方式；
图4a和4b用于解释改变图2设备的操作模式的第二种方式；图5用于解释改变图2设备的操作模式的第三种方式；图6用于解释改变图2设备的操作模式的第四种方式；图7示出可以在图2设备中使用的检测器布置的第一实例；图8示出可以在图2设备中使用的检测器布置的第二实例；图9示出可以在图2设备中使用的检测器布置的第三实例；以及图10示出本发明的PCR设备的另一实例；
具体实施例方式特别地，使用相同设备可以采用不同的扩增和检测方法。典型地，样品将被存储在 一次性盒内。于是通过改变分析区域的尺寸(即改变系统的控制设置)以及将不同的化学 药品插入盒内，可以实现不同的模式。取决于诊断情景，需要以定性或定量的方式检测大量不同的寡核苷酸。这需要多 路复用扩增，即同时扩增不同的序列。多路复用可通过将样品流体(更精确而言，DNA提取 和纯化的样品预处理之后获得的分析溶液)分布在大量室上来实现，每个室含有针对不同 序列的不同引物集合。可替换地，不同引物可以在单个室内组合且一个接一个地扩增。后 一情形显然要求不同探针和目标序列之间不存在干涉。取决于不同目标序列的相似性，可以在单个室内实施许多种扩增。对于实时PCR 的情形，存在附加限制，因为每个序列需要由独特的荧光团特性和独特的探查序列识别以 进行选择性杂化。因此对于实时PCR的情形，单室多路复用更受限制。此外，为了高度多路 复用，所需要的非常特殊的试剂使得这种方法比端点(定性)检测更昂贵。取决于需要同时检测的序列的数目，基于上述DNA扩增过程的分子诊断设备目前 是基于具有不同益处的不同技术。对于商业设备而言，期望是可扩展的并服务需要不同多路复用程度的不同应用。 例如，诊断仪器理想地应能够解决不同的诊断问题，提供平台方法。对于小的多路复用程 度，实时PCR是优选的方法，且对于更大的多路复用程度或者非常关键的目标组合，端点检 测是优选的。本发明涉及一种能够实施检测样品的定量和定性属性的不同检测模式的系统。为 了实现这一点，在本发明的系统(和方法)中，发光(荧光)辐射的检测可以在(准)共焦 和非共焦布置之间切换。对于通过用经过物镜的光辐射激励荧光团并且例如在反射模式中经过同一透镜 收集发光，以检测设备内的荧光团的浓度，定量方法是已知的。发光辐射在经过滤波器设备 以选择恰当的波长范围之后，被投影在传感器设备上。透镜可由不同致动装置以受控方式沿三个方向运动，从而能够在感兴趣的样品上 扫描。对于定量分析，非共焦布置是期望的，而对于端点分析(即，对于目标存在的检测)， 共焦布置是期望的。图2示出基于DVD光学系统的已知荧光扫描器的基本部件。待研究的样品被限制 在衬底20中的给定体积内。由诸如激光器的光源24产生的光被用于激励荧光。该光由准直透镜Ll准直且随
9后借助激励透镜26被聚焦在样品内。透镜26可以相对于样品运动，优选地沿全部三个维度运动。这种相对运动可以被 任意地解耦，例如样品在x-y平面内运动且透镜可以沿ζ方向运动。可替换地，样品可以保 持固定，且透镜自身具有全部的三个自由度(χ-y-z)。任何其它布置也是可能的。激光被偏振分束器21 (即偏振相关反射器)反射，并通过四分之一波片22和第一 带通滤波器23。二向色分束器25 (即波长相关反射器)将激光引导至激励透镜26。由于被聚焦到样品内的激励光而引起的荧光由收集透镜收集，在此实例中该收集 透镜与激励透镜26是同一部件；并且该荧光被引导朝向检测器28。任何被反射但未被吸收的激光被分束器25再次反射，而荧光通过分束器25。第二 带通滤波器27提供进一步的滤波，且该光随后被成像透镜L2聚焦在检测器28上，该成像 透镜L2将样品成像在检测器28上。可以使用诸如光子检测器的许多不同类型的检测器。直到上文所述为止，图2的设备是常规的，且出于此原因，将不给出对光学部件的 详细讨论。本发明提供了在共焦检测模式和非共焦检测模式之间转换的能力。共焦检测模式对于端点检测(表面固定类型的测定)是优选的方法，而对于实时 PCR，体积检测会是恰当的。在共焦模式中，激励体积保持为最小，理想地保持在激励透镜26可以形成的衍射 极限光斑。典型的共焦体积为立方微米量级，取决于激励透镜26的强度(数值孔径，NA)。 在此体积内形成的荧光由收集透镜收集且被成像在检测器上。在共焦方法中，焦点与检测 路径内的点共焦。在检测路径内的这一点处，通常放置小的针孔以滤波掉任何来自焦点以 外的位置的光。穿过针孔的光被引导朝向检测器。检测器本身有可能起到针孔的作用，这样的约 束为检测器的横向尺寸必须匹配由成像透镜L2的数值孔径除以收集透镜26的数值孔径来 缩放的焦点尺寸。由于端点生物实验的结果，此共焦模式最适合于研究表面固定测定。表面被扫描 以分析整个样品。相反，对于实时PCR监视的情形，期望相对大的体积激励和检测。待监视 的反应在空间上分布在大的体积内，因此共焦扫描不再是时间有效的选择。激励光需要在给定时间内采样更大的统计学上相关的体积。此给定时间为与荧光 测量结果提供关于扩增水平的相关信息这段时间相对应的PCR循环的一部分(fraction)。 理想地，使用高NA收集透镜，高效率的荧光收集是期望的。在透镜性能和成本之间存在折 发。检测器布置优选地设计成使得成像透镜L2的透镜场匹配采样体积。检测透镜场 为可由透镜以最小畸变成像在物平面内的部分物平面。因此，检测器的横向维度与由成像 透镜28和收集透镜26的NA比例来缩放的收集透镜26的场匹配。激励体积对应于此采样 体积。控制布置29将物镜的焦点精确地保持在与分析物接触的分析设备的内表面处， 同时扫描该表面。物镜的焦点也可以故意偏移。通过实例的方式，由数值孔径强度为0. 6的非球面单透镜的透镜场限定的体积约为60X60X60微米。通常随着透镜的数值孔径增加，透镜的场减小，但是这也依赖于具体 透镜设计。为了最优地在共焦操作模式和非共焦操作模式之间切换，系统的激励路径和检测 路径均需要调整。所需的激励体积扩张的第一种方法示于图3，并提供激励透镜的焦点30向后平 移。这可以通过调整入射(激励光)波前的平面平行性来实现。图2中的准直透镜Ll可以 用于实现这个结果。理想地准直透镜Ll相对于激光器放置在与其焦距相等的距离处。在 此设置中，激励光的波前(在通过Ll之后)为平面平行的，如图3a所示。透镜Ll略微偏 移此位置则使激励束波前变为发散束(当更远离地放置Ll时)或者会聚束(当更靠近激 光器放置Ll时)。由于入射光从平面平行的改变为发散的，形成发散束的效应示于图3b，其中焦点 30向后平移。相对于当激励光是平面平行时的情形，当投射在激励透镜上的激励光是发散时， 激励光的焦点30向后偏移。激励光被聚焦成紧密(tight)光斑(在激励/收集透镜26的 焦平面之前或之后)，且应注意的是，该光斑不产生PCR室内荧光团的褪色。这可以通过在 室内部提供水平扫描而得到保证。按此方式，有可能合理地均勻地激励在激励/收集透镜焦点周围的大体积32。将准直透镜Ll放置在机动(小型)台上使得能够在两种配置之间容易地切换。可 替换地，诸如电润湿透镜的可调透镜可以用于不使用机械致动而在不同模式之间切换。所需的激励体积扩张的第二种方法示于图4，图4示出相位板40可以如何在光束 内引入大的畸变由此加宽焦点光斑。相位板因而提供了在锐焦点激励(sharp focus excitation)和宽焦点激励之间 切换的可替换解决方案。相位板的使用在多色系统中是普遍的，其中相位板通常用于对波 束成形，以改善在系统中使用的所有颜色的波前质量。与此相反，在此实施例中，相位板起 到相反的作用，即相位板在投射波前内引入畸变，因此尽管被激励/收集透镜聚焦，该光将 形成宽光斑。图4a示出具有衍射极限焦点的共焦布置，图4b示出具有更大畸变占主导的聚焦 体积42的布置。当期望共焦测量模式时，相位板40不位于光路径内。为了激活大体积激励，相位 板40放置在光束路径内。相位板也可以是可切换相位板，该可切换相位板通过电控制而接 通或调节。与将相位板机械地移入和移出光路径相比，这会是更为期望的。所需的激励体积扩张的第三种方法示于图5，图5示出如何可以将光纤50用于此 目的。投射光被耦合到合理长度的多模光纤内。在光纤50中，入射平面波前经由模式转换 被转换为多种允许在光纤内传播的模式。光纤的输出被往回准直并引导至激励透镜。由于光纤内的模式转换，从光纤出射的光均勻地分布在光纤截面上，且在光纤的 NA内是发散的。因此，光无法被激励/收集透镜聚焦成比光纤直径小的光斑(用两个透镜 NA的比例来缩放)。按此方式，宽焦点的尺寸是由光纤直径控制。两个透镜和光纤的整个 系统优选地形成单一模块，该单一模块可以移入/移出光束，使系统在共焦和大体积激励 之间切换。在图5中，聚焦体积52同样是畸变占主导。
所需的激励体积扩张的第四种方法示于图6，图6示出如何可以将散射介质60用 于此目的。该方法同样是改变波前的质量，直接的后果是扩大焦斑。当光被聚焦在散射介质 上时，光在散射介质内被散射(重新分布)，且当波前传播经过散射介质时，光斑的尺寸增 大。主要是正向散射的介质是优选的，因此光被散射到有用的光学路径之外的损耗是最小 的。由激励/收集透镜形成的焦斑62的尺寸可以由散射介质厚度或者散射介质属性(散 射效率)调节。电致动的可调漫射器，比如液晶凝胶(LC-gel)或者聚合物分散液晶(PDLC)，可用 于此目的。将散射介质移入或移出光束或者将散射介质接通或截止，这使系统操作模式在 大面积激励和紧密焦点光斑激励之间切换。 检测系统需要能够在两种模式中正确地操作。实施这一点的第一种方式是通过使用大面积像素化检测器，如图7所示。这使得 除了大面积激励，还能够进行大体积检测。在大体积检测模式中，荧光到达检测器并在检测 器的许多或者全部像素内形成显著的信号。理想地，检测器的尺寸对应于激励体积的尺寸 (考虑到光学缩放因子)。系统可以无缝地切换到共焦成像模式。当激励光形成样品体积内的紧密焦点时， 荧光仅到达有限数目的检测器像素。这种方法是特别有吸引力的，因为不需要对准；检测器 平面内的感兴趣的共焦面积可以在测量之后经由信号处理来确定，或者可以基于系统校准 而提前知晓。成像光学器件可以选择为使得共焦体积不被成像在同样小于检测器像素的检 测器平面内。图7的左部示出共焦成像模式中的系统，其具有衍射极限焦点；图7的右部示出大 面积成像模式中的系统，其具有畸变主导焦点。大面积检测器会是优选的例如以简化大体积检测模式中的检测。“大面积检测 器"是指具有单一光接收表面的检测器，其中检测器无法区分在表面的不同部分接收到的 信号。这种方法的实例示于图8。在这种设计中，系统可以通过将针孔80放置在检测器的 前方而切换到共焦模式成像。针孔的尺寸和位置必须与激励/收集透镜的焦点共焦。图8的左部示出共焦成像模式中的系统，其具有衍射极限焦点并使用针孔(或者 其它孔径布置)，图8的右部示出大面积成像模式中的系统，其具有畸变主导焦点。替代机械针孔80，可以使用电快门(electrical shutter)，该电快门可以被接通 和截止和/或该电快门的直径可被调节。成像透镜和收集透镜之间的焦距比例确定物体/像的放大倍数。当检测器尺寸固 定时，通过改变检测器前方的成像透镜L2，有可能在共焦成像和宽体积成像之间切换。这种 方法的实例示于图9。理想地，对于大体积检测，透镜应位于与收集透镜布置对应的检测器的前方。按此 方式，许多畸变项由于系统对称性而被消除，且有效成像场被最大化。可选地，检测器的尺 寸与透镜场的尺寸匹配。这在图9右部示出。为了将系统切换到共焦成像模式，检测器前方的透镜可以更换为提供大的放大倍 数(即具有长焦距)的透镜，因此由激励/收集透镜激励的紧密焦点光斑被成像在全部检 测器尺寸上。按此方式，在两种模式下，全部检测器面积均用于光收集。除以上所述之外，存在其它方式来改变焦点腰部。例如，通过将衍射或折射光学元件引入激励光路径或者在激励光路径内切换这种元件的属性，可以故意增大焦点腰部。本发明设备的非共焦操作模式可以用于解决测量速度慢的问题。当前的q-PCR仪 器的一个主要限制是仍然低的速度。典型的扩增需要30至40个循环，每个循环持续大约1 分钟。对于护理点应用，半个小时太长。因此重要的是加速该过程。此时在速度上存在两 个限制，即循环时间和循环数目，循环时间是由用于加热和冷却的热传递限制，循环数目是 由检测灵敏度限制。减小设备的尺寸可以改善热传递但是也将减小灵敏度。因此需要一种 检测技术，其允许使设备小型化同时增大灵敏度。第一种措施是将荧光信号的高数值孔径(NA)收集与PCR反应体积的有效采样组 合。检测的灵敏度以NA2缩放。当前的典型NA为0.1或更小，但是NA可以增大至0.65或 更大。这导致所收集荧光的量增加40倍。图10示出对激励光以及被提供到检测器的光使用多模光纤。与图2对应的部件 使用相同的参考数字，且不重复对它们的描述。系统不同之处在于，光纤IOOa和IOOb被提 供在激光器24的输出处和检测器28的输入处。如上文所解释，从多模光纤出射的光不是 点源，而是具有由光纤核心给出的有限尺寸。这具有的效应为，光不能被完全准直且其随后 由激励/收集透镜聚焦成有限尺寸的光斑。理想地，光纤核心维度选择为使得在激励/收 集透镜26的焦平面内产生的光斑与该透镜的视场相当。通过光纤IOOa导入激励光以及也通过光纤IOOb将所收集的荧光发送到检测器的 优点在于，激励/收集单元可以构建为小且鲁棒的，且其可以容易地在PCR反应室阵列之上 扫描。可替换地，LED(发光二极管)可被用作激励源。在第一实施例中，LED(发光二极 管)可简单地替换激光器并被准直到光纤内，且随后当LED(发光二极管)从光纤的另一端 出射时被准直。在另一实施例中，LED可以直接放置在准直透镜Ll的焦平面内。这是可能 的，因为LED不是点源，光是从大约100 μ mX 100 μ m或更大的有限表面发射的。这种情况 下，LED的有源区将理想地匹配激励/收集透镜26的视场(除以准直器和激励/收集透镜 Li,26的焦距的比例)。收集/激励透镜26可以安装在致动器内，该致动器允许透镜的垂直扫描。使用仅 垂直致动，激励光斑穿过PCR室并有效地激励圆柱形体积，同时激励光斑收集所激励的荧 光并经由收集光纤将所激励的荧光引导到检测器。在垂直扫描期间检测到的总荧光与标记 DNA的量成比例。理想地，所扫描的体积代表PCR体积的显著部分。这是通过使焦点尺寸尽 可能匹配室的面积来实现的。透镜26可具有比室的深度小的焦点深度。垂直扫描可用于识别室的壁。取决于PCR体积的几何，横向扫描可以替代地是探查PCR体积(或者至少其显著 部分)的优选实施例。当然，垂直扫描和横向扫描的组合也可以用于对PCR室采样。收集体积的横向维度(为了有效的荧光收集)是由激励/收集透镜26的视场给 出，该横向维度理想地匹配激励光纤的核心以及激励/收集透镜26和准直透镜Ll的焦距。理想地 其中
dexc为激励光斑在横向维度上的直径；fexc/col为激励/收集透镜26的焦距；fcollifflator为准直透镜Ll的焦距；dfiber为激励光纤IOOa的直径。重要的是，光被有效地扫描穿过PCR体积，而不产生将使得荧光团标记褪色的实 焦点。应通过在若干PCR循环期间动态地监视荧光来避免褪色。激励/收集透镜具有高的NA且是轻和小的，例如典型尺度是在5mm的范围。即使 对于非常简单的透镜设计、小的直径和高的NA，视场可以在直径为50微米的范围内。通过使收集荧光的光纤IOOb的核心匹配激励/收集透镜26的视场以及两个透镜 26,Ll的焦距比例，实现了准共焦滤波情形。这使得该荧光检测不易出现杂散光以及在PCR 体积以外的位置被激励的不希望荧光背景(例如约束PCR体积的材料的自动荧光)。对于例如几克的轻透镜的情形，(例如在DVD播放器的光学拾取单元"0PU"中使 用的)典型致动器可允许在几十毫秒内或更快地垂直扫描1毫米。荧光采集，即每个PCR 室的采样，可以在一个垂直扫描或者多个垂直扫描内进行，且可以在几十毫秒的时间段内 完成。这是绰绰有余的，因为一 PCR循环所需的时间为约几十秒或更长。唯一的要求为荧 光采集扫描与PCR循环的关联部分同步，当荧光团是活性时，该关联部分经常为PCR循环的 末端。优选地，如果PCR室的大的阵列将被扫描，则OPU的扫描与阵列的温度循环同步。 理想地，OPU可以在热循环的正确时刻到达每个PCR室。按此方式，阵列的完整扫描可以扩 展到与PCR循环的时间相当的时间间隔(几十秒)上，而不增添由于该扫描(既在横向又 在垂直方向)引起的任何额外延迟。PCR扩增的典型最小输入体积是在几个纳升的范围内，该范围是由待扩增DNA的 初始浓度给出。纳升为IO6 μ m3的体积且在皮摩尔浓度的活性标记(在几个扩增步骤之后 的典型浓度)，一纳升将含有IO3个荧光团，并且它们受激励的荧光信号用此处描述的方法 (其中PCR体积的显著部分被探查)是可以容易检测到的。如上所述，设备可以与多个光源和多个滤波器布置使用以允许同时监视不同荧光 团的发光。物镜可具有高的数值孔径，这允许对发光的非常有效的收集；以及在共焦读出的 情况下对激励的强约束，这使得实现强的表面选择性。对发光的测量可以与比如由温度变化等引起的、在分析设备内部进行的反应过程 同步。通过按序跳到不同的井孔，可以在大量的反应体积内探查荧光强度。识别代码可 以被合并到井孔内，该识别代码可由同一激励光束读出以再现相应发光强度的坐标。可以 多次测量相同的位置以导出分析溶液中的时间相关的性能。本发明的优选应用是在分子诊断领域临床诊断、护理点诊断、先进生物分子诊断 研究_生物传感器，特别地涉及DNA检测与诸如PCR、q-PCR等的扩增方法组合。本发明的优选应用因而在于基于对扩增后的核酸检测的分子诊断，其将扩增期间 的实时检测(rt-PCR)与随后通过杂化而固定到捕获探针的扩增(端点检测)组合在单个 设备内。仅仅通过在盒上使用不同的化学药品以及调节对仪器的控制(可由操作员经由仪 器上的软件来控制)，该设备可以在两种技术之间选择。
通过对透镜(该透镜传输激励和发光辐射)的组合x、y高分辨率致动与快速步进 致动模式相组合，该设备可用于扫描杂化点的大阵列以及大量用于扩增的反应室。基于聚焦透镜的高数值孔径(这确保对由附着到寡核苷酸的标记发射的发光的 有效收集)，该系统可提供高灵敏度和高空间分辨率。本发明使得实现分子诊断的高灵活性 以及反应体积的任何多路复用程度和小型化的成本有效解决方案，这使其特别适合于(微 流体)紧凑集成设备。在上面的实例中，系统用于荧光检测。然而，更一般而言本发明更为大体上涉及对 样品的激励以及对所得到的光的检测。这种激励可简单地包括照射，所引起的发光则是反 射。因而"激励"应理解为包括照射，“由激励引起的光"应理解为包括反射。所引起的 发光还可包括磷光。在上面的实例中，使用二向色分束器DBS作为优选的解决方案。然而还可以使用 正常(非二向色)分束器，不过一些激励功率以及所收集的荧光将被浪费。上述实施例说明而非限制本发明，且本领域技术人员将能够设计许多可替换实施 例而不背离所附权利要求书的范围。例如，尽管未画出，如上所解释的系统可以被调整为具有与收集布置分离的聚焦 布置。本领域技术人员将能够增添标准收集布置到根据本发明的聚焦布置。该布置可以仍 然具有基本上相同的设计，但是不共享任何元件。可替换地，与上述实施例中所解释相比， 更少的元件被共享。在权利要求书中，任何置于括号之间的参考符号不应理解为是限制该权利要求。 词“包括”并不排除未在权利要求中列出的元件或步骤的存在。在元件之前的词“一”或“一 个”并不排除多个这样的元件的存在。在枚举若干装置的设备权利要求中，这些装置中的若 干装置能够利用一个并且相同的硬件来实施。在互不相同的从属权利要求中列举了某些措 施并不表示不能有利地使用这些措施的组合。
1权利要求
一种检测系统，包括辐射源(24)，用于提供输入辐射；辐射聚焦布置(26)，用于提供该输入辐射到样品(20)的分析区域；辐射收集(26)布置，用于收集由于该输入辐射与该样品的相互作用引起的、来自该样品的分析区域的输出辐射；辐射检测器(28)，用于检测所收集的输出辐射；操作装置(40，50，60)，用于在第一检测模式和第二检测模式中操作该检测设备，其中在该第一检测模式中，该分析区域具有第一尺寸和/或形状，其中在该第二检测模式中，该分析区域具有与该第一尺寸和/或形状不同的第二尺寸和/或形状。
2.如权利要求1所述的检测系统，其中该操作装置适于为该分析区域在该第一检测模 式中提供第一分析面积以及在该第二检测模式中提供第二分析面积，该第二分析面积大于 该第一分析面积。
3.如权利要求1或2所述的检测系统，包括用于对该第一检测模式和第二检测模式的 至少一个提供共焦检测的共焦成像装置。
4.如前述权利要求任意一项所述的检测系统，其中该操作装置适于为该分析区域在该 第一检测模式中提供第一分析体积厚度以及在该第二检测模式中提供第二分析体积厚度。
5.如前述权利要求任意一项所述的检测系统，其中该操作装置包括用于沿z方向扫描 样品的装置。
6.如前述权利要求任意一项所述的检测系统，其中该操作装置(40，50，60)包括用于 改变该辐射聚焦布置的焦点深度的装置。
7.如权利要求6所述的检测系统，进一步包括用于准直该辐射源的输出的准直折射元 件，其中该操作装置包括用于相对于该辐射源移动该准直折射元件的装置。
8.如权利要求1至5任意一项所述的检测系统，其中该操作装置包括用于将畸变引到 该辐射源和该分析区域之间的输入辐射内的装置(40)。
9.如权利要求8所述的检测系统，其中该操作装置包括辐射光纤(50)，该辐射光纤能 够插入该辐射源(24)和该分析区域之间的输入辐射路径。
10.如权利要求8所述的检测系统，其中该操作装置包括散射元件(60)，该散射元件能 够插入该辐射源(24)和该分析区域之间的输入辐射路径。
11.如权利要求9所述的检测系统，其中该操作装置进一步包括布置在该光纤和该分 析区域之间的输入辐射路径内的准直元件，其中该检测系统进一步包括成像元件(诸如透 镜的折射元件)和另一光纤，该另一光纤能够插入该成像元件(L2)和该辐射检测器(28) 之间的输出辐射路径。
12.如前述权利要求任意一项所述的检测系统，包括折射元件(26)，该折射元件由该 辐射聚焦布置和该辐射收集布置共享且布置成用于提供输入辐射到该样品并用于收集来 自该样品的输出辐射。
13.如前述权利要求任意一项所述的检测系统，包括第一和第二成像透镜布置，使得该 检测器能够操作于结合该第一检测模式的第一面积模式以及结合该第二检测模式的第二 面积模式。特别合适的是，在该第一和第二检测模式中使用不同的分析区域面积。
14.如前述权利要求任意一项所述的检测系统，其中该辐射检测器(28)包括用于检测辐射的空间分布的像素。
15.如权利要求1至13任意一项所述的检测系统，其中该辐射检测器(28)包括单一检 测器表面，该检测系统进一步包括检测器孔径，使得通过调节检测器孔径，该辐射检测器能 够操作于结合该第一检测模式的第一面积模式以及结合该第二检测模式的第二面积模式。 特别合适的是，在该第一和第二检测模式中使用不同的分析区域面积。
16.一种用于检测来自样品的输出辐射的检测方法，该检测方法包括下述步骤 提供输入辐射，聚焦该输入辐射，由此在样品上形成分析区域，收集由于该输入辐射与该样品的相互作用引起的、来自该样品的分析区域的输出辐 射，以及检测所收集的光，改变该尺寸或者该分析区域，并重复该方法的前三个步骤。
17.一种计算机程序产品，其用于使得可编程设备能够实施权利要求16的方法。
18.—种控制器，其适于控制检测系统以执行权利要求11的方法的步骤。
全文摘要
一种检测系统，包括辐射源(24)，用于提供输入辐射；辐射聚焦布置(26)，用于提供该输入辐射到样品(20)的分析区域；辐射收集(26)布置，用于收集由于该输入辐射与该样品的相互作用引起的、来自该样品的分析区域的输出辐射；辐射检测器(28)，用于检测所收集的输出辐射；操作装置(40，50，60)，用于在第一检测模式和第二检测模式中操作该检测设备，其中在该第一检测模式中，该分析区域具有第一尺寸和/或形状，其中在该第二检测模式中，该分析区域具有与该第一尺寸和/或形状不同的第二尺寸和/或形状。
文档编号G01N21/64GK101903761SQ200880121688
公开日2010年12月1日 申请日期2008年12月10日 优先权日2007年12月19日
发明者E·M·H·P·范迪克, M·I·博亚姆法, R·威姆伯格-弗里德尔 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司