专利名称：Vegf多态性和抗血管发生疗法的制作方法
技术领域：
一般而言，本申请涉及与抗血管发生疗法有关的人类疾病和病症的治疗。具体 而言，本发明涉及癌症的抗血管发生疗法，其或是单独施用的或是与其它抗癌疗法组合 施用的。
背景技术：
癌症仍然是人类健康的最致命威胁之一，在美国每年影响超过1百万新患者。 实体瘤对那些死亡大多负有责任。虽然某些癌症的医学治疗取得了显著进展，但是当前 的治疗方法相对没有选择性手术切除患病组织；放射疗法缩小实体瘤；及化学疗法杀 死正在快速分裂的细胞。这些治疗方法可导致众多副作用，在有些情况中严重到限制可 给予的剂量并如此排除潜在有效药物的使用。血管发生是重要的细胞事件，其中血管内皮细胞增殖、消减和重新组织，从而 从现有的血管网络形成新血管。血管发生对于大多数原发瘤的生长及其后续转移是至关 重要的。血管内皮细胞生长因子(VEGF)，也称作VEGF-A或血管通透因子(VPF)，被 报道成正常和异常血管发生二者的枢轴调节物。Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18 4-25 ； Ferrara (1999) J.Mol.Med.77 527-543。抗VEGF 抗体“贝伐单抗”(Bevacizumab)，也称作 “BV”、 “rhuMAbVEGF”、或“Avastin ，，，是依照 Presta et al. (1997)Cancer Res.57 4593-4599
生成的一种重组人源化抗VEGF单克隆抗体，当前在美国获得批准用于治疗转移性结肠 直肠癌、非小细胞肺癌、和转移性乳腺癌。与其它癌症治疗方法一样，Avastin 疗法与 某些副作用有关，包括升高的高血压的风险。当特定基因中的不同等位基因导致不同表型时，群体中存在遗传多态性。此类 多态性可以在决定治疗性药物的功 效和安全性中发挥作用。例如，已经显示了 VEGF中 的特定多态性与乳腺癌的发病率有关。Schneider et al. (2008) Breast Cancer Research and Treatment 111 157—63。别的预示特定疗法的功效或安全性的多态性的鉴定可用于更好地为那些会最佳 地受益于该疗法的患者调整该疗法。发明概述本发明部分基于VEGF中如下的多态性的鉴定，所述多态性在正在经历抗VEGF 疗法(包括用Avastin )的患者中预示升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性和/或 升高的高血压的风险。一方面，本发明提供一种预测患者是否处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选选自VEGF(-1498C/ Τ)和VEGF(_634G/C)的基因组多态性，其中若相应的基因型包含VEGF(_1498C)或 VEGF(_634G)，则患者处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险。在一些实 施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体，例如贝伐单抗。在一些实施方案中，所 述治疗进一步包括施用抗肿瘤组合物。在一些实施方案中，所述患者正在治疗癌症，例 如乳腺癌。另一方面，本发明提供一种用于预测患者是否处于升高的与VEGF拮抗剂治疗 有关的高血压的风险的试剂盒，包括对VEGF中选自下组的多态性特异性的第一寡核苷 酸和第二寡核苷酸VEGF(_1498C/T)和VEGF(_634G/C)。在一些实施方案中，所述 试剂盒中的所述寡核苷酸对于扩增VEGF中包含这些多态性之一的区域是有用的。另一方面，本发明提供一种预测患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗 剂治疗的可能性的方法，包括对自所述患者分离的样品筛选VEGF(_2578C/A)或 VEGF(-1154G/A)处的基因组多态性，其中若相应的基因型包含VEGF(-2578AA)或 VEGF(1154AA)，则患者具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性。在一些实施方 案中，所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体，例如贝伐单抗。在一些实施方案中，所述治 疗进一步包括施用抗肿瘤组合物。在一些实施方案中，所述患者正在治疗癌症，例如乳 腺癌。另一方面，本发明提供一种用于预测患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗剂 治疗的可能性的试剂盒，包括对VEGF中选自下组的多态性特异性的第一寡核苷酸和第 二寡核苷酸VEGF(_2578C/A)和VEGF(_1154G/A)。在一些实施方案中，所述试剂盒 中的所述寡核苷酸对于扩增VEGF中包含这些多态性之一的区域是有用的。发明详述除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物 学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这 些技术在文献中有充分解释，诸如“Molecular Cloning ALaboratory Manual”，第二版 (Sambrook et al.，1989) ； “Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait 编，1984); "Animal Cell Culture”(R.I.Freshney 编，1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.) ； "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M.Ausubel et al.编，1987，及其周期 性的更新)；“PCR: The Polymerase Chain Reaction”(Mullis et al.编，1994)。除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人 员通常的理解具有相同的含义。以下文献为本领域技术人员提供了本申请中所使用的许 多术语的——般性指导Singleton et al.， Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 第 二版，J.Wiley&Sons (New York，N.Y. 1994)，和 March，Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure,第四版，John Wiley&Sons (New York, N.Y.1992)。通过述及完整收录本文中所引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)。定义如本文中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”、“该”包括复 数，除非上下文另有明确说明。例如，“一个/种”细胞还会包括“多个/种细胞”。术语“包含”意图指组合 物和方法包括所叙述的要件，但是不排除其它要件。
术语“VEGF”和“VEGF-A”可互换使用，指165个氨基酸的血管内皮细胞 生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如Leung et al.，Science 246 1306(1989)和Houck et al.，Mol.Endocrin.5 1806(1991)所述，及其天 然存在等位形式和加工形式。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮 细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如
“VEGF(8-109)，，、"VEGF (1-109)"或 “VEGF165” 来鉴别任何此类形式的 VEGF。 “截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然 VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短 的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-I受体的结合亲和力。“VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。优选的是，本发 明的抗VEGF抗体可在靶向和干扰其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患时用作治疗剂。抗 VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其 它生长因子，诸如P1GF、PDGF或bFGF。优选的抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。更优选的是， 抗VEGF抗体是依照Presta etal.，Cancer Res.57 4593-4599(1997)生成的重组人源化抗 VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为bevacizumab(贝伐单抗；BV; Avastin )的抗 体。“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性， 包括其与一种或多种VEGF受体的结合的分子。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其抗 原结合片段、受体分子及特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的衍生 物、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂。术语“抗体”以最广义使用，包括单克隆抗体(包括全长的或完整的单克隆抗 体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要 它们展现出期望的生物学活性。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即 构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗 体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同 抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单 克隆”不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克 隆抗体可通过最初由Kohler etal.，Nature 256 495 (1975)记载的杂交瘤方法来制备，或 者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No.4,816,567)。 “单克隆抗体”还 可使用例如 Clackson etal.，Nature 352 624-628 (1991)或 Marks et al.，J.Mol.Biol.222 581-597(1991)中记载的技术从噬菌体抗体库分离。“病症”指任 何会受益于使用抗体的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾 病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制 性例子包括良性和恶性肿瘤；白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质 细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症；及炎症疾病、血管发 生性疾病和免疫学病症。术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情况中，治疗有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度 的减缓，优选阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)肿 瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症 状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制 性的和/或细胞毒性的 。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估总体存活(OS)、无 进展存活(PFS)、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活 质量来测量。“治疗”指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早 就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控 的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此 类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺 癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌)、 胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀 胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾 液腺癌、肾癌(kidney or renal cancer)、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺 癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各种类型的头和颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/ 滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级 弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性 NHL>贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特 伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞 性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症 (PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs) 综合征有关的异常血管增殖。术语“抗肿瘤组合物”指在治疗癌症中有用的组合物，其包含至少一种能够抑 制或阻止肿瘤生长或功能和/或引起肿瘤细胞破坏的活性治疗剂。适合在抗肿瘤组合物 中用于治疗癌症的治疗剂包括但不限于化疗剂、放射性同位素、毒素、细胞因子诸如干 扰素、和靶向细胞因子、细胞因子受体或与肿瘤细胞有关的抗原的拮抗剂。优选的是， 所述治疗剂是化疗剂。“化疗剂”指在癌症治疗中有用的化学化合物。“分离的”核酸分子指已经鉴定且与多肽核酸的天然来源中通常与之关联的至 少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的 形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分 离的核酸分子包括通常表达该多肽的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在 所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。术语“多态性”指基因的序列中在群体内变化的位置。多态性由不同的“等 位基因”构成。这样的多态性的位置通过其在基因中的位置及在那里找到的不同碱基来 鉴别。例如，VEGF-1498C/T指示VEGF基因中第-1498位处有C和T之间的变异。 这两种可能的变体(C和T)是两种不同等位基因。因为基因型由两种分开的等位基因构成，所以在任何一名个体中 可观察到数种可能变体之任一(例如，这个例子是CC、CT、 或 TT)。术语“基因型”指细胞或组织样品中某种基因的特定等位基因。在上文的例子 中，CC、CT>或TT是VEGF-1498C/T多态性处可能的基因型。术语“样品”包括取自患者的细胞或组织样品。例如，样品可包括肿瘤样品、 与肿瘤类型对应的正常组织的样品、取自肿瘤周围区域的组织样品、或血细胞。样品中特定基因型的鉴定可通过本领域技术人员公知的多种方法任一来实施。 例如，使用本领域公知的技术，通过克隆等位基因并对它测序，可实现多态性的鉴定。 或者，可以自基因组DNA扩增基因序列，例如使用PCR，并对产物测序。下文描述了用 于对患者DNA分析给定遗传基因座处突变的数种非限制性方法。可使用DNA微阵列技术，例如DNA芯片装置和用于高通量筛选应用的高密度 微阵列和低密度微阵列。用于制作微阵列的方法是本领域已知的，而且包括各种喷墨 (inkjet)和微量喷射沉积(microjet deposition)或点样(spotting)技术和工艺、原位或芯片 上光刻(photolithographic)寡核苷酸合成工艺、和电子DNA探针寻址工艺。DNA微阵列 杂交应用已经在基因表达分析及短串联重复(STR)、单核苷酸多态性(SNP)、点突变的 基因型分析领域中成功应用。别的方法包括干扰RNA微阵列及微阵列与其它方法诸如激 光捕捉显微解剖(LCM)、比较性基因组杂交(CGH)和染色质免疫沉淀(ChiP)的组合。 参见例如 He et al. (2007) Adv.Exp.Med.Biol.593 117-133 和 Heller (2002) Annu.Rev.Biomed. Eng.4 129-153。其它方法包括PCR、xMAP、侵入者测定法、质谱术、和焦磷酸测序 (Wang et al. (2007) 593 105-106)。另一种检测方法是使用与多态性位点交叠且在多态性区域周围具有约5个、或 约10个、或约20个、或约25个、或约30个核苷酸的探针的等位基因特异性杂交。例 如，将能够特异性杂交至等位变体的数种探针附着至固相支持物，例如“芯片”。可以 通过多种工艺(包括平板印刷术(lithography))将寡核苷酸结合至固体支持物。使用这些 包含寡核苷酸的芯片(也称作“DNA探针阵列”)的突变检测分析记载于例如Cranin et al. (1996) Human Mutation7 244。在其它检测方法中，必须首先至少扩增基因的一部分，之后鉴定等位变体。扩 增可通过例如PCR和/或LCR或本领域公知的其它方法来实施。在一些情况中，来自受试者的DNA中特定等位基因的存在可通过限制酶分析来 显示。例如，特定核苷酸多态性可导致包含限制性位点的核苷酸序列，该限制性位点在 其它等位变体的核苷酸序列中不存在。在又一个实施方案中，可使用针对切割剂(诸如核酸酶、羟胺或四氧化锇及哌 啶)的保护来检测RNA/RNA、DNA/DNA、或RNA/DNA异源双链体中的错配碱基(参 见例如Myers et al. (1985) Science 230 1242)。一般而言，“错配切割”技术如下开始， 即提供通过将包含基因等位变体核苷酸序列的对照核酸(任选经过标记的，例如RNA或 DNA)与自组织样品获得的样品核酸(例如RNA或DNA)杂交而形成的异源双链体。用 切割双链体中单链区的试剂处理双链的双链体，其中双链体诸如基于对照和样品链间碱 基对错配形成的双链体。例如，可以用RNA酶处理RNA/DNA双链体、用Sl核酸酶处理 DNA/DNA杂合物以酶促消化错配区域。或者，可以用羟胺或四氧化锇及哌啶处理DNA/DNA或RNA/DNA双链体以消化错配区域。在消化错配区域后，在变性聚丙烯酰胺凝胶 上根据大小将所得材料分开以确定对照和样品核酸是否具有相同核苷酸序列或它们有哪 些核苷酸不同。参见例如美国专利 No.6,455,249 ； Cotton et al. (1988)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85 4397 ； Saleeba et al. (1992) Meth.Enzymol.217 286-295。电泳迁移率的改变也可用于鉴定特定等位变体。例如，可使用单链构象多态性 (SSCP)来检测突变型与野生型核酸之间的电泳迁移率差异(Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad.Sci USA 86 2766 ； Cotton (1993) Mutat.Res.285 125-144 和 Hayashi (1992) Genet. Anal.Tech.Appl.9 73-79)。将样品和对照核酸的单链DNA片段变性并让其复性。单链核 酸的二级结构随序列而变化，所得电泳迁移率改变能够检测甚至单个碱基的变化。DNA 片段可以标记或用经过标记的探针检测。通过使用RNA(而非DNA)，其中二级结构对 序列中的变化更加敏感，可增强该测定法的灵敏度。在另一个优选的实施方案中，该方 法基于电泳迁移率变化利用异源双链体分析将双链异双链体分子分开(Keen et al.(1991) Trends Genet.7 5)。等位变体的身份还可如下获得，即分析包含多态性区域的核酸在含有变性剂 梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动，这使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)来测定(Myerset al. (1985)Nature 313 495)。当使用DGGE作为分析方法时，会修饰DNA以确保它不会 完全变性，例如通过PCR添加解链温度高的、富含GC的DNA的大约40bp的GC夹。 在另一个实施方案中，使用温度梯度代替变性剂梯度以鉴定对照和样品DNA的迁移率差 异(Rosenbaum 和 Reissner (1987) Biophys.Chem.265 1275)。用于检测2条核酸间至少一个核苷酸的差异的技术的例子包括但不限于选择性 寡核苷酸杂交、选择性扩增、或选择性引物延伸。例如，可以制备寡核苷酸探针，其中 将已知的多态性核苷酸放置在中心(等位基因特异性探针)，然后在只在找到完美匹配才 容许杂交的条件下杂交至靶 DNA(Saiki et al. (1986)Nature 324 163) ； Saiki et al. (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 6230)。此类等位基因特异性寡核苷酸杂交技术可用于检测 基因多态性区域中的核苷酸变化。例如，将具有特定等位变体核苷酸序列的寡核苷酸附 着至杂交膜，然后将此膜与经过标记的样品核酸杂交。然后，对杂交信号的分析会揭示 样品核酸的核苷酸的身份。或者，可以与本发明组合使用依赖于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技 术。作为引物用于特异性扩增的寡核苷酸可以在分子的中心中(使得扩增依赖于差异 杂交)(Gibbs et al. (1989)Nucl.Acids Res. 17 2437-2448)或在一条引物的 3，末端尽头 处(在适宜的条件下，可防止错配或缩短聚合酶延伸)(Prossner(1993)Tibtech 11 238 禾口 Newton et al. (1989)Nucl.Acids Res. 17 2503)携带感兴趣等位变体。此技术也称作
“PROBE”，即探针寡聚物碱基延伸(Probe Oligo Base.Extension)。另夕卜，可能想要在 突变区域中引入新的限制性位点以创建基于切割的检测(Gasparini et al.(1992)Mol.Cell. Probes 6 1)。在另一个实施方 案中，等位变体的鉴定使用寡核苷酸连接测定法(OLA)来进 行，如例如美国专利 Νο.4,998,617 及 Laridegren，U.et al.Science241 1077-1080 (1988) 中所记载的。OLA方案使用设计成能够杂交至靶物单链邻接序列的两种寡核苷酸。将 所述寡核苷酸之一连接至分离标志，例如生物素化的，并可检测标记另一寡核苷酸。如果在靶分子中找到精确互补的序列，那么所述寡核苷酸会杂交，使得它们的末端邻近， 并创建连接底物。然后连接容许经过标记的寡核苷酸使用亲合素或其它生物素配体来回 收。Nickerson，D.A.等人描述了组合PCR和OLA特性的核酸检测测定法(Nickerson， D.A.etal. (1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 8923-8927)。在此方法中，使用 PCR 来实现 靶DNA的指数扩增，然后使用OLA来检测。本发明提供用于检测VEGF中单核苷酸多态性(SNP)的方法。因为单核苷酸多 态性侧翼为不变序列的区域，所以它们的分析只需要检测单个变异核苷酸的身份，而且 不必为每名患者测定完整基因序列。已经开发了数种方法来推动SNP的分析。通过使用专门化外切核酸酶抗性核苷酸，可检测单碱基多态性，如例如美国专 利Νο.4,656,127中所披露的。依照该方法，容许与紧挨多态性位点3’的等位序列互补 的引物杂交至自特定动物或人获得的靶分子。如果靶分子上的多态性位点含有与存在的 特定外切核酸酶抗性核苷酸衍生物互补的核苷酸，那么该衍生物会掺入到杂交引物的末 端上。此类掺入使得引物对外切核酸酶有抗性，并由此容许其检测。因为样品中外切核 酸酶抗性衍生物的身份是已知的，所以引物变得对外切核酸酶有抗性的发现揭示靶分子 的多态性位点中存在的核苷酸与反应中使用的核苷酸衍生物互补。此方法的优点在于它 不需要测定大量的无关序列数据。一种基于溶液的方法也可用于测定多态性位点的核苷酸的身份 (W091/02087)。如上所述，采用与紧挨多态性位点3’的等位序列互补的引物。该方 法使用经过标记的双脱氧核苷酸衍生物来测定该位点的核苷酸的身份，如果与多态性位 点的核苷酸互补的话，该双脱氧核苷酸衍生物会掺入到所述引物的末端上。一种备选方法记载于WO 92/15712。此方法使用经过标记的终止物和与多态性 位点3’的序列互补的引物的混合物。所掺入的经过标记的终止物由所评估的靶分子的 多态性位点中存在的核苷酸决定且与该核苷酸互补。该方法通常是异相测定法，其中将 引物或靶分子固定化至固相。用于测定DNA中多态性位点的许多其它引物指导核苷酸掺入规程已有记 载(Komher，J.S.et al. (1989)Nucl.Acids.Res.l7 7779-7784 ； Sokolov, B.P.(1990) Nucl.Acids Res. 18 3671 ； Syvanen, A-C., et al. (1990) Genomics8 684—692; Kuppuswamy, M.N.et al. (1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA88 1143-1147 ； Prezant, T.R.et al.(1992)Hum.Mutat.l 159-164 ； Ugozzoli, L.et al. (1992) GATA 9 107-112 ； Nyren, P.et al. (1993) Anal.Biochem.208 171-175)。这些方法都依赖于掺入经过标记的脱氧核苷 酸以区分多态性位点处的碱基。此外，可以理解，上述任何用于检测多态性变体或基因产物或基因改变的方法 可用于监测疗程或疗法。本文所述方法可以通过例如利用预包装的诊断试剂盒来实施，诸如下文所描述 的那些，其包含至少一种探针或引物核酸，它们可方便地用于例如测定受试者是否处于 形成与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险。供上述诊断和预后方法中使用的样品核酸可以自任何细胞类型或受试者组织获 得。例如，可以通过已知技术获得受试者的体液(例如血液)。或者，可以对干样品(例 如毛发或皮肤)实 施核酸测试。
本文所述发明涉及用于测定和鉴定VEGF基因座处存在的等位基因的方法和组 合物。此信息对于预测形成与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险水平是有用的。探 针可用于直接测定样品的基因型，或者可以与扩增同时或序贯使用。术语“探针”包括 天然存在的或重组的单链或双链核酸或化学合成的核酸。它们可以通过切口平移(nick translation)、Klenow补平反应、PCR或本领域知道的其它方法来标记。本发明的探针、 它们的制备和/或标记记载于Sambrook et al. (1989)见上文。探针可以是适 合于选择性 杂交至含有本发明多态性区域的核酸的任何长度多核苷酸。所使用的探针的长度会部分 取决于所使用的测定法的性质和所采用的杂交条件。经过标记的探针还可以与多态性的扩增联合使用(Holland et al. (1991)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 88 7276-7280)。美国专利No.5,210,015记载了用于在PCR期间提供扩增
产物实时测量的基于荧光的办法。此类办法或是采用嵌入染料(诸如溴化乙啶)来指示存 在的双链DNA的量，或是采用含有荧光-淬灭剂对的探针(也称作“Taq-Man”法)， 其中探针在扩增期间遭到切割以释放荧光分子，其浓度与存在的双链DNA的量成正比。 在扩增期间，当杂交至靶序列时，探针受到聚合酶的核酸酶活性的消化，从而释放荧光 分子，与淬灭剂分子分开，由此引起来自报告分子的荧光出现。Taq-Man法使用与靶多 核苷酸含有多态性的区域退火的含有报告分子_淬灭剂分子对的探针。可以将探针附着于表面，以用作“基因芯片”。通过本领域技术人员知道的多 种技术，此类基因芯片可用于检测遗传变异。在一种技术中，在基因芯片上排列寡核苷 酸，通过以杂交法进行的测序，诸如美国专利No.6,025,136和6,018,041中概述的，用于 测定DNA序列。还可以将本发明的探针用于遗传序列的荧光检测。此类技术已有记载， 例如美国专利No.5,968,740和5,858,659。还可以将探针附着于电极表面，用于核酸序列 的电化学检测，诸如美国专利No.5,952,172及Kelley，S.O.et al. (1999)Nucl.Acids Res.27 4830-4837中所记载的。另外，可修饰用于探针或引物的分离的核酸以使其变得更加稳定。例示性的修 饰的核酸分子包括DNA的氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硫代磷酸酯(phosphothioate) 和甲基膦酸酯(methylphosphonate)类似物(还可参见美国专利No.5,176,996 ； 5,264,564 和 5,256,775)。如上所述，本发明还提供用于测定VEGF中存在的多态性区域的等位变体类型 的诊断方法。在一些实施方案中，所述方法使用包含与该VEGF多态性区域互补的核苷 酸序列的探针或引物。因而，本发明提供用于实施这些方法的试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供用于测定受试者是否处于形成与VEGF拮抗剂 治疗有关的高血压的风险的试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供用于测定受试者是 否具有受益于抗VEGF疗法的较大可能性的试剂盒。此类试剂盒含有一种或多种上文所 述组合物和使用说明书。仅作为例子，本发明还提供用于测定患者是否处于形成与VEGF 拮抗剂治疗有关的高血压的风险的试剂盒，包含对例如下述VEGF多态性区域特异性的 第一和第二寡核苷酸VEGF(-2578C/A)、VEGF(-1498C/T)、VEGF(_1154G/A)或 VEGF(_634G/C)。又例如，本发明还提供用于确定受试者是否具有受益于抗VEGF疗法 的较大可能性的试剂盒，包含对例如下述VEGF多态性区域特异性的第一和第二寡核苷 酸VEGF(_2578C/A)或VEGF(_1154G/A)。 “对(遗传基因座)特异性的”寡核苷酸结合所述基因座的多态性区域或在所述基因座的多态性区域的附近结合。对于要用作扩 增引物的寡核苷酸，若引物足够接近以用于生成包含多态性区域的多核苷酸，则说它们 是附近的。在一个实施方案中，若寡核苷酸在距离多态性约l_2kb内，例如少于Ikb结 合，则说它们是附近的。特异性的寡核苷酸能够杂交至序列，而且在合适的条件下会不 结合相差单个核苷酸的序列。 试剂盒可包含至少一种能够特异性杂交至VEGF多态性区域的探针或引物和使 用说明书。所述试剂盒通常包含至少一种上文所述核酸。用于扩增VEGF至少一部分的 试剂盒一般包含两种引物，其中至少一种能够杂交至等位变体序列。此类试剂盒适合于 通过例如荧光检测、电化学检测、或其它检测来检测基因型。试剂盒中所包含的寡核苷酸(用作探针或引物)可以可检测标记。标记物可以 直接(例如荧光标记物)或间接检测。间接检测可包括本领域技术人员知道的任何检测 方法，包括生物素-亲合素相互作用、抗体结合等等。荧光标记的寡核苷酸还可包含淬 灭分子。寡核苷酸可结合至表面。在一些实施方案中，所述表面是硅土或玻璃。在一 些实施方案中，所述表面是金属电极。本发明的其它试剂盒包含实施所述测定法所必需的至少一种试剂。例如，所述 试剂盒可包含酶。或者，所述试剂盒可包含缓冲液或任何其它必需试剂。试剂盒可包括本文中为测定受试者在VEGF多态性区域中的基因型而描述的所 有或一些阳性对照、阴性对照、试剂、引物、测序标志物、探针和抗体。下面的实施例仅仅意图例示本发明的实践，而非作为限制而提供。通过述及明 确收录将本文中所引用的所有专利和科学文献的完整公开内容。
实施例实施例1 : VEGF中的遗传多态性及它们与后果的关联E2100是一项III期组间试验，其在将贝伐单抗添加至帕利他塞(paclitaxel)来治 疗具有先前未治疗的转移性乳腺癌的女性时证明了无进展存活(PFS)和响应率(RR)的改 善。在接受贝伐单抗的女性中看到了显著更多的高血压和蛋白尿。样品我们对来自E2100乳腺癌Avastin试验的数据实施了回顾测试。该数据集包括 673名符合条件的患者及623例疾病进展事件和483例死亡。其中，我们对来自363例符 合条件的病例(随访中值43个月)的石蜡包埋肿瘤块测定了基因型。另外，377例符合 条件的病例可用于VEGF IHC,而341例可用于VEGFR-2IHC。所有标本是在没有患者 标识符或临床结果信息的情况中“盲”分析的。多态性表1显示了我们所测试的多态性。表1 所测试的单核苷酸多态性(SNP)
权利要求
1.一种预测患者是否处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险的方法， 包括对自所述患者分离的样品筛选VEGF(_1498C/T)处的基因组多态性，其中若相应的 基因型包含VEGF(_1498C)，则患者处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险。
2.—种预测患者是否处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险的方法，包 括对自所述患者分离的样品筛选VEGF(_634G/C)处的基因组多态性，其中若相应的基 因型包含VEGF(_634G)，则患者处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险。
3.权利要求1或2的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
4.权利要求3的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
5.权利要求1或2的方法，其中所述患者正在用VEGF拮抗剂治疗癌症。
6.权利要求5的方法，进一步包括施用抗肿瘤组合物。
7.权利要求5的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
8.权利要求5的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
9.权利要求8的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
10.权利要求8的方法，进一步包括施用抗肿瘤组合物。
11.一种用于预测患者是否处于升高的与VEGF拮抗剂治疗有关的高血压的风险的 试剂盒，包括对VEGF中选自下组的多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸 VEGF (-1498C/T)和 VEGF (-634G/C)。
12.权利要求11的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸可用于扩增包 含VEGF中选自下组的多态性的部分VEGF基因VEGF (-1498C/T)禾Π VEGF (-634G/ C)。
13.一种预测患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性的方法，包括对 自所述患者分离的样品筛选VEGF(_2578C/A)处的基因组多态性，其中若相应的基因型 包含VEGF (-2578AA)，则患者具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性。
14.一种预测患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性的方法，包括对 自所述患者分离的样品筛选VEGF(_1154G/A)处的基因组多态性，其中若相应的基因型 包含VEGF(_1154AA)，则患者具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性。
15.权利要求13或14的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
16.权利要求15的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
17.权利要求13或14的方法，其中所述患者用VEGF拮抗剂治疗癌症。
18.权利要求17的方法，进一步包括施用抗肿瘤组合物。
19.权利要求17的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
20.权利要求17的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
21.权利要求20的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。
22.权利要求20的方法，进一步包括施用抗肿瘤组合物。
23.—种用于预测患者是否具有升高的受益于VEGF拮抗剂治疗的可能性的试 剂盒，包括对VEGF中选自下组的多态性特异性的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸 VEGF (-2578C/A)和 VEGF (-1154G/A)。
24.权利要求11的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸可用于扩增包含VEGF中选自下组的多态性的部分VEGF基因VEGF (-2578C/A)禾Π VEGF (-1154G/ A)。
全文摘要
通过对自患者分离的样品筛选特定基因组多态性，确定患者是否处于与抗VEGF疗有关的高血压的特定风险或是否具有较大可能性受益于抗VEGF疗法的方法。
文档编号G01N33/50GK102016579SQ200880125826
公开日2011年4月13日 申请日期2008年11月26日 优先权日2007年11月30日
发明者乔治·W·斯莱奇, 布赖恩·P·施奈德, 米兰·拉多维科 申请人:健泰科生物技术公司