专利名称：一种使用冷冻干燥技术对生物样品进行前处理的方法
技术领域：
本发明属于医学、药学领域，具体涉及一种使用冷冻干燥技术对生物 样品进行前处理的方法。
背景技术：
冷冻真空干燥也叫干燥。升华干燥或简称冻干。它是干燥方法之一， 目的是为了贮存物品。
物品之所以会损坏、腐烂、变质，主要是由于外因和内因二个因素引
起的，外因者，空气、水、温度、生物等的作用；内因者，主要是生物物 质自身的新陈代谢作用。如果能使外因和内因的作用减小到最低程度，则 能达到物品在一定时间内保持不变的目的。
干燥法就是驱除物品内部所含的水份，因为水份是一切生物生长的必 要条件之一。生物体水份减少到一定程度，则生物不易或不能生长繁殖。 因而能较长时间的贮藏保存；另外，当有水份存在时， 一些酸碱溶解其内 还会发生一些化学作用而使物品变质。
干燥的方法很多，如晒干、烘干、煮干、晾干、喷雾干燥、真空干燥、 冷冻干燥等。其中唯有冷冻干燥法是干燥生物活性物质的最理想方法。
冷冻干燥技术是将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在 较高真空下将冰直接转变为蒸气而除去的干燥方法。物料可先在冷冻装置 内冷冻，再进行干燥。但也可直接在干燥室内经迅速抽成真空而冷冻。升 华生成的水蒸气借冷凝器除去。升华过程中所需的汽化热量， 一般用热辐射供给。其主要优点是(1)干燥后的物料保持原来的化学组成和物理性 质(如多孔结构、胶体性质等)；(2)热量消耗比其他干燥方法少。主要用于 千燥抗生素、蔬菜和水果等。
含水的生物样品，经过冷冻固定，在低温高真空的条件下使样品中的 水分由冰直接升华达到干燥的目的，在干燥的过程中不受表面张力的作 用，样品不变形。
冷冻干燥技术是在第2次世界大战期间，因大量需要血浆和青霉素而 发展起来的。现在已广泛应用于化学、制药工业、食品工业和科学研究等 方面，特别是应用于含有生物活性物质的生物药品方面最为普遍。
冷冻干燥属于边缘科学，它涉及到物理、化学、生物学等知识，包括 制冷、真空、电工、仪表等技术。因此也是一门综合性的专业科学技术。
在临床医学、基础医学、法医学、药学等研究领域，生物样品中的药 物浓度检测是一项十分重要的技术，广泛应用于毒物分析、药物分析等研 究中。
传统的对于全血、血浆、血清、尿液、粪便、组织或组织匀浆液等生 物样品的处理方法为有机溶剂沉淀蛋白离心后使用氮气或空气流在加热 条件下吹干有机溶剂再定容后进行分析，或者使用与生物样品不相混容的 有机溶剂如乙酸乙酯、乙醚等进行液液萃取后使用氮气或空气流在加热条 件下吹干有机溶剂定容后进行分析。
在基础研究或临床药物浓度监测的过程中，常常会有大量的待检测样 品，使用传统的样品前处理方法，样品中的内源性成分容易对目标药物的 测定产生干扰，并且操作步骤较多，尤其是待测药物为热不稳定化合物时， 处理过程需要在低温或室温条件下进行，这必然会增加样品处理所需要的时间。
传统的生物样品前处理方法存在操作步骤多、花费时间长、存在较多 内源性干扰等弊端。
发明内容
本发明的目的在于提供一种将成熟的冷冻干燥技术应用到生物样品 的前处理过程当中，能够同时处理大量生物样品，使对热不稳定化合物在 生物样品中的测定更简便和可靠的生物样品进行前处理的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是将生物样品进行冻干处 理后，再使用有机溶剂对生物样品冻干粉进行目标化合物提取。
其具体步骤如下
1) 取待测生物样品移至容器中，冷冻干燥技术是指将含水物料冷冻 到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的 干燥方法。物料可先在冷冻装置内(冷阱)冷冻，再进行干燥。但也可直接 在干燥室内经迅速抽成真空而冷冻。升华生成的水蒸气借冷凝器除去。升 华过程中所需的汽化热量， 一般用热辐射供给。将装有待测物的容器置于
冷冻干燥机的冷阱中预冻至-45。C并维持2 6小时后将其从冷阱中转移至 冻干箱中，打开真空泵，经0.5 3小时使真空度达到0.3mbar以下，对物 料盘进行加热，第一步根据待测生物样品的共熔点加温使待测生物样品的 温度低于共熔点的温度，待生物样品内水份干完后进行第二步加温，加热 至生物样品允许的温度并保持2 6小时，即可结束冻干；
2) 冻干结束后，取出样品恢复至室温后，加入冻干前待测生物样品 体积0.2 1倍的有机溶剂作为提取溶剂，涡旋混合1 2分钟后于12000 16000xg以上，离心10 30分钟或通过0.22,的滤膜后，取上清液或滤液进行相关分析测试。
冻干结束后根据测定目标，也可以不使用溶剂萃取，而采用其他处理 方法进行处理测定。
本发明的生物样品为全血、血浆、血清、尿液、粪便、组织或组织匀
浆液；萃取有机溶剂为乙醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿 或乙腈。
生物样品的最高允许温度指的是保证生物样品活性的最高温度，其最 高允许温度视生物样品而定， 一般为1(TC 4(TC左右。病毒性样品的允许' 温度为25°C，细菌性样品的允许温度为30°C，血清、抗菌素的允许温度 为40。C。
本发明将冷冻干燥技术应用到生物样品的前处理过程中，将生物样品 (全血、血浆、血清、尿液、粪便、组织或组织匀桨液等)在冻干机中冻干 后加入提取有机溶剂(甲醇、乙腈等)混匀离心后即可进行含量分析，由于 生物样品(全血、血浆、血清、尿液、粪便、组织或组织匀浆液等)的冻干 粉中没有水分，有机溶剂中也不含水分，大部分7JC溶性的内源性物质不会 进入提取有机溶剂中对目标药物的测定产生干扰，同时由于冻干粉的颗粒 小，具有多孔性结构，比表面积大，提取溶剂对药物的提取率明显高于传 统的样品前处理方法。整个处理过程不需要加热处理，尤其适合对生物样 品中热不稳定化合物进行分析。
具体实施例方式
实施例l:以血浆样品为例
分离待测血液样品中的血浆，移取0.1 ml至1.5ml的ependoff管中， 置冷冻干燥机中预冻至-45。C并维持2小时，转移至冻干箱中，打开真空泵，经2小时后真空度达到0.3mbar，对物料盘进行加热并按照预定程序 升温至10°C，冻干程序完成，恢复冻干箱压力为大气压后取出冻干后的血 浆样品，迅速盖上ependoff管的盖子，恢复至室温后加入O.lml甲醇作为 提取溶剂，涡旋混合1分钟后12000xg离心10分钟取上清液进行液相分 析。
例如血浆和组织匀桨，进行冻干处理后，使用有机溶剂提取后进行临 床治疗药物监测、药物代谢研究、药代动力学研究、法医学毒物分析等。
有些分析技术，如加速器质谱(accderator mass AMS)技术，可以将冻 干样品不经溶剂萃取直接进行其氧化、还原等前处理进行分析，应用于临
床治疗药物监测、药物代谢研究、药代动力学研究、法医学毒物分析。 实施例2:
1) 取尿液移至容器中，将装有尿样的容器置于冷冻干燥机的冷阱中 预冻至-45。C并维持4小时后将其从冷阱中转移至冻干箱中，打开真空泵， 经l小时使真空度达到0.3mbar以下，对物料盘进行加热，第一步加热保 持尿样的温度低于共熔点的温度，待尿样内水份被除去后进行第二步加 温，至20T保持3小时，即可结束冻干；
2) 冻干结束后，取出样品恢复至室温后，加入冻干前尿液体积1/2 的乙醚作为提取溶剂，涡旋混合1分钟后于12000xg以上，离心10分钟 取上清液进行相关分析测试。
实施例3:
1)取组织移至容器中，将装有组织的容器置于冷冻干燥机的冷阱中 预冻至-45。C并维持5小时后将其从冷阱中转移至冻干箱中，打开真空泵， 经1小时使真空度达到0.3 mbar以下，对物料盘进行加热，第一步保持组织的温度低于共熔点的温度，待水份干完后进行第二步加t显，加热至io°c
保持5小时，即可结束冻干；
2)冻干结束后，取出样品恢复至室温后，加入冻干前组织体积1、 5 的乙酸乙酯作为提取溶剂，涡旋混合2分钟后于12000xg以上，离心20 分钟，取上清液进行相关分析测试。
实施例4:
1) 取组织匀浆液移至容器中，将装有组织匀浆液的容器置于冷冻干 燥机的冷阱中预冻至-45。C并维持6小时后将其从冷阱中转移至冻干箱中， 打开真空泵，经3小时使真空度达到0.3mbar以下，对物料盘进行加热， 第一步保持组织匀浆液的温度低于共熔点的温度，待产品内水份干完后进 行第二步加温，加热至10。C保持4小时，即可结束冻干；
2) 冻干结束后，取出样品恢复至室温后，加入冻干前组织匀浆液体 积1/3的乙腈作为提取溶剂通过0.22 u m的滤膜后，取滤液进行相关分析 测试。
权利要求
1、一种使用冷冻干燥技术对生物样品进行前处理的方法，其特征是，将生物样品进行冻干处理后，再使用有机溶剂对生物样品冻干粉进行目标化合物提取。
2、 根据权利要求1所述的使用冷冻干燥技术对生物样品进行前处理 的方法，其具体步骤如下1) 取待测生物样品移至容器中，将装有待测物的容器置于冷冻干燥 机的冷阱中预冻至-45。C并维持2 6小时后将其从冷阱中转移至冻干箱 中，打开真空泵，经0.5 3小时使真空度达到0.311*犯以下，对物料盘进 行加热，第一步根据待测生物样品的共熔点加温使待测生物样品的温度低 于共熔点的温度，待生物样品内水份干完后进行第二步加温，加热至生物 样品最高允许温度并保持2 6小时即可结束冻干；2) 冻干结束后，取出样品恢复至室温后，加入冻干前待测生物样品 体积0.2 1倍的有机溶剂作为提取溶剂，涡旋混合1 2分钟后于12000 16000xg以上，离心10 30分钟或通过0.22jom的滤膜后，取上清液或滤液进行相关分析测试。
3、 根据权利要求1或2所述的使用冷冻干燥技术对生物样品进行前 处理的方法，其特征是所说的生物样品为全血、血浆、血清、尿液、粪 便、组织或组织匀浆液。
4、 根据权利要求1或2所述的使用冷冻干燥技术对生物样品进行前 处理的方法，其特征是所说的有机溶剂为乙醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、 乙醇、丙酮、氯仿或乙腈。
全文摘要
本发明涉及一种使用冷冻干燥技术对生物样品进行前处理的方法。利用冻干机将生物样品制成冻干粉后使用有机溶剂提取样品中目标化合物后进行分析。该方法完全除去了样品中的水分，减少内源性物质的干扰，并且使样品成为疏松的多孔性粉末，增大其比表面积，提高有机溶剂对目标化合物的提取率，简化了操作步骤，由于冻干机能够同时处理多个样品，对大量生物样品的分析检测步骤得到了简化，能够节省样品前处理所需时间。
文档编号G01N1/42GK101545839SQ20091002163
公开日2009年9月30日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者鑫 宋, 张继业, 曾爱国, 杨广德 申请人:西安交通大学