专利名称：：一种同时检测牛奶中多种酞酸酯的液质联用测定方法
技术领域：
：一种同时检测牛奶中多种酞酸酯的液质联用(LC-ESI-MS/MS)测定方法，具体是一种可同时对牛奶中9种酞酸酯进行定量测定的LC-ESI-MS/MS方法，属于食品检测
技术领域：
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背景技术：
：酞酸酯类化合物(Phthalaticacidesters,PAEs)，多为无色油状粘稠液体，易溶于脂肪和有机溶剂，难溶于水，不易挥发，含有较弱的雌激素成分，影响生物体内分泌、导致突变、致畸和癌细胞增殖，是一类环境激素。可通过呼吸、饮食和皮肤接触进入人体内，对人体健康造成危害。PAEs不仅具有一般毒性，还具有特殊毒性，如生殖毒性、胚胎毒性和遗传毒性等。PAEs是塑料工业的主要增塑剂和软化剂，主要用于生产橡胶、塑料、润滑剂、粘合剂、涂料、高分子助剂、印刷油墨用软化剂及电容器油等，由于它们的兼容性和软化能力，尤其广泛地应用在软质的聚氯乙烯(PVC)产品中。PAEs可广泛应用于食品包装材料、容器、医疗用品及人造革等的制造，还可用作农药载体，驱虫剂、化妆品和香料的调配剂，以及涂料和润滑剂的成分。由于PAEs与塑料基质之间没有形成化学键，而是以氢键和范德华力连接，接触到合适的有机溶剂便会溶解出来，对环境、生物和食品造成污染。PAEs在全球主要工业国的生态环境中已达到了普遍检出的程度。PAEs对环境的污染已经受到世界各国的普遍重视。其中DMP(邻苯二甲酸二甲酯)，DEP(二乙酯)，DBP(二丁酯)，BBP(丁基卞基酯)，DNOP(二正辛酯)，DEHP(二-(2-乙基己基)酯)等已被美国环保局(EPA)列为首选检测污染物。欧盟的1999/815/EU指令也规定儿童用PVC玩具中含有的DBP，BBP，DEHP，DNOP,DINP(二异壬酯)，DIDP(二异癸酯)等6种对人体和环境有害的物质，其总检出量必须低于0.1%。由于PAEs在环境中残留期较长，生物对其具有富集作用，我国也己将PAEs族系中的邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)和邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)确定为环境优先控制的污染物。目前有关酞酸酯类化合物的检测报道在环境方面比较多，涉及食品方面的相对较少。大多数食品均采用塑料制品进行内包装或内衬。邻苯二甲酸酯类化合物能从塑料包装袋中向食品、特别是含油脂食品，如牛奶、肉类中迁移，食品在塑料包装材料中储存的时间越长，或用于包装食品的塑料材料中增塑剂含量越高，都会加大增塑剂向食品中迁移的量，即对食品的污染程度越大。国内在1984年后才陆续出现有关PAEs污染情况的报道，但数量很少。近十年PAEs的测定方法也逐渐成熟。早期的方法有滴定法、比色法、分光光度法、薄层色谱法等，但都不够灵敏，选择性都不够好。目前多采用气相色谱法和液相色谱法，尤其是气质联用和液质联用法。目前基于气质联用的PAEs确证方法己有报道。但气质联用要进行比较复杂的衍生化处理，因此，液质联用法(LC-ESI-MS/MS)显示出一定的优势。
发明内容本发明的目的针对现有检测酞酸酯的技术中只能测定一种或几种酞酸酯的不足和缺陷，提供一种可有效地检测出牛奶中多种酞酸酯含量的液质联用方法，该方法旨在将基本包括现有牛奶所可能涉及的各种主要酞酸酯，使其能更加快速、灵敏、简便地检测酞酸酯残留，以满足实际工作的需要。本发明的技术方案本发明建立的液质联用HPLC-ESI-MS/MS测定方法，经过样品处理、液相分离、质谱检测三个步骤，同时检测牛奶中多种酞酸酯的含量，包括牛奶中邻苯二甲酸二甲酯、苯二甲酸二乙酯、苯二甲酸二丁酯、苯二甲酸二戊酯、苯二甲酸二环己酯、苯二甲酸二辛酯、苯二甲酸二异葵酯、苯二甲酸二异辛酯和苯二甲酸丁基苄基酯等9种酞酸酯类化合物。(1)样品前处理及提取净化称取蒙牛液态纯牛奶2g加到50mL的玻璃离心管中，加入200ng的9种酞酸酯等量混合标准溶液，即加标100ppb，然后涡旋混匀。再加入10mL的乙腈涡旋，接着再加0.8gNaCl进行涡旋并超声10min，然后以2000rpm低速离心10min。取上层乙腈清液到另一空的玻璃离心管中进行真空旋转蒸发至干，然后加入色谱纯的甲醇涡旋溶解旋干物并定容至lmL，转入至进样瓶进样。(2)液相分离液相条件为1、色谱柱SymmetryC18，5|im，100mmX2.1腿；2、流动相A:999/1000体积比的511111101醋酸铵重蒸水溶液+1/1000体积比的甲酸，流动相B:甲醇；3、流速0.25mL/min;4、梯度洗脱程序0-2min20%B;2-3.5min20%-95%B;3.5—11min95%B;11-12min95%-20%B;12-13.5min20%B;各洗脱时间段中均以流动相A补足余下的M数；5、柱温常温；6、进样量25pL;(3)、质谱检测质谱条件为1)离子源电喷雾离子化电离源(ESI)，正离子监测(即ESI+);2)扫描方式选择离子检测(SRM);3)电离源温度80°C，去溶剂温度300DC;4)雾化气、鞘气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；5)喷雾源气体流速20L/h;去溶剂气体流速350L/h;6)喷雾电压、碰撞电压均自动优化至最佳灵敏度；选择离子条件见表1。保留时间见图1。表1LC-ESI-MS/MS法测定酞酸酯的电喷雾离子源的设置<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(4)、浓度计算方法和检测限按外标法以峰面积法计算牛奶中这9种酞酸酯的浓度。本发明方法的检测限为大约在520ppb之间(信噪比》3)，回收率在65.28。/。~98.33%，变异系数(RSD)为5.35%~11.22%。本发明的有益效果本发明方法灵敏度高、准确度和精密度好，专属性及确证性可靠，而且非常简便并可易于实际检测应用，且可非常好地满足实际检测中的需要。采用LC-ESI-MS/MS方法对上述9种有可能造成牛奶污染的酞酸酯进行同时检测的方法，目前尚未见有相应的报道。图l、9种酞酸酯标准品色谱图。图2、9种酞酸酯的LC-ESI-MS/MS总离子色谱图。图3、牛奶加标色谱图。具体实施例方式1材料1.1主要试剂和材料甲醇色谱纯乙腈色谱纯Merk公司Merk公司南京化学试剂公司国药集团上海化学试剂有限公司蒙牛纯牛奶国家环保总局标准品研究所自制三氯乙酸分析纯氯化钠(AR)液态牛奶酞酸酯标准品重蒸水1.2主要仪器Accela高效液相(包括autosampler禾口accelapump)及TSQQuantumAccess质BP211D型电子分析天平德国赛多利斯公司KQ-250DE型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司BUCfflRotavaporR-200真空旋转蒸发仪1.3标准品储备液9种酞酸酯分别配成lmg/mL的甲醇溶液，再混合成各酞酸酯含量从Ing/mL~lpg/mL—系列稀释浓度的混合储备液。2方法2.1仪器条件2丄1液相色谱条件流动相A:999/1000体积比的511111101醋酸铵重蒸水溶液+1/1000体积比的甲酸，流动相B:甲醇；流速0.25mL/min;梯度洗脱程序(以体积百分比计):0-2min20%B;2-3.5min20%-95%B;3.5-11min95%B;11-12min95%-20%B;12-13.5min20%B;各洗脱时间段中均以流动相A补足余下的。/。数；色谱柱SymmetryC18,5(im,100mmx2.1mm;进样量25|iL。2丄2质谱条件采用电喷雾离子化电离源(ESI)，正离子监测(即ESI+);选择离子检测(SRM)扫描方式；电离源温度80°C，去溶剂温度300°C;雾化气、鞘气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；喷雾源气体流速20L/h;去溶剂气体流速350L/h;喷雾电压、碰撞电压均自动优化至最佳灵敏度；选择离子对见表1，保留时间见图1。谱仪涡旋混合仪RJ-LD-IIB低速离心机天平AB135-S型FinniganTSQQuantumThermoScienctific公司上海沪西仪器公司无锡市瑞江分析仪器有限公司上海梅特勒-托利多公司62.2样品预处理方法称取蒙牛液态纯牛奶2g到50mL的玻璃离心管，加入200ng的9种酞酸酯等量混合标准溶液，即加标100ppb，然后涡旋混匀。再加入10mL的乙腈涡旋，接着再加0.8gNaCl进行涡旋并超声10min，然后以2000rpm低速离心10min。取上层乙腈清液到另一空的玻璃离心管中进行真空旋转蒸发至干，然后加入色谱纯的甲醇涡旋溶解旋千物并定容至lmL，最后转入至进样瓶进样检测。LC-ESI-MS/MS检测结果见图3和表2。表2、牛奶中W冲酞酸酯fiA检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、一种经过样品处理、液相分离、质谱检测三个步骤，，(1)样品前处理及提取净化称取蒙牛液态纯牛奶2g加到50mL的玻璃离心管中，加入200ng的9种酞酸酯等量混合标准溶液，即加标100ppb，然后涡旋混匀，再加入10mL的乙腈涡旋，接着再加0.8gNaCl进行涡旋并超声10min，然后以2000rpm低速离心10min，取上层乙腈清液到另一空的玻璃离心管中进行真空旋转蒸发至干，然后加入色谱纯的甲醇涡旋溶解旋干物并定容至1mL，转入至进样瓶进样；(2)液相分离液相条件为①色谱柱SymmetryC18，5μm，100mm×2.1mm；②流动相A999/1000体积比的5mmol醋酸铵重蒸水溶液+1/1000体积比的甲酸，流动相B甲醇；③流速0.25mL/min；④梯度洗脱程序0-2min20％B；2-3.5min20％-95％B；3.5-11min95％B；11-12min95％-20％B；12-13.5min20％B；各洗脱时间段中均以流动相A补足余下的％数；⑤柱温常温；⑥进样量25μL；(3)质谱检测质谱条件为1)离子源电喷雾离子化电离源ESI，正离子监测即ESI+；2)扫描方式选择离子检测SRM；3)电离源温度80℃，去溶剂温度300℃；4)雾化气、鞘气为高纯氮气，碰撞气为高纯氦气；5)喷雾源气体流速20L/h；去溶剂气体流速350L/h；6)喷雾电压、碰撞电压均自动优化至最佳灵敏度；选择离子条件正离子SRM扫描分析时，各酞酸酯的离子选择通道m/z分别为邻苯二甲酸二甲酯195/163、邻苯二甲酸二乙酯223/149、邻苯二甲酸二丁酯279/149、邻苯二甲酸二戊酯307/149、邻苯二甲酸二环己酯331/149、邻苯二甲酸二辛酯413/301、邻苯二甲酸二异葵酯447/149、邻苯二甲酸二异辛酯391/149、邻苯二甲酸丁基苄基酯313/149；(4)、浓度计算方法和检测限按外标法以峰面积法计算牛奶中这9种酞酸酯的浓度。全文摘要一种同时检测牛奶中多种酞酸酯的液质联用(LC-ESI-MS/MS)测定方法，属于食品检测
技术领域：
。本发明牛奶样品用乙腈和氯化钠直接提取；液相色谱分离采用甲酸醋酸铵水溶液-甲醇体系作为流动相，梯度洗脱；质谱检测器检测，采用外标法以峰面积法进行定量检测。本发明方法灵敏度高、准确度和精密度好，专属性及确证性可靠，而且非常简便并可易于实际检测应用，且可非常好地满足实际检测中的需要。文档编号G01N30/34GK101551363SQ20091002760公开日2009年10月7日申请日期2009年5月14日优先权日2009年5月14日发明者涛丁,徐丽广,李灼坤,胥传来申请人:江南大学