专利名称：一种富集阪崎肠杆菌的试剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于食品微生物安全监测领域，具体地是涉及一种富集阪崎肠杆菌的试剂及其制 备方法。
背景技术：
阪崎肠杆菌(^7tero6scter幼hzsh7)是奶粉中近儿年引起广泛关注的一种致病菌。 阪崎肠杆菌原称黄色阴沟肠杆菌，直到1980年才被认为是一个新的菌种，并以日本微生物学 家——RiichiSakazakii的名字命名，即阪崎肠杆菌。2008年，食品卫生法典委员会同意考 虑创建一个新属Cro/w》scter， Cro/7otecter包括阪崎肠杆菌和相关种。阪崎肠杆菌是人和动 物肠道内寄生的一种革兰氏阴性致病菌，其周生鞭毛、能运动、无芽孢和兼性厌氧。
阪崎肠杆菌在自然界的污染源仍然不清楚(Friedemann等，2007; Lin等，2007)，在 多起暴发事件中发现，阪崎肠杆菌的感染与婴幼儿配方奶粉密切相关(Iversen等，2004)。 从大多数病例看，婴幼儿(主要是l岁以下)特别是出生28天以内、早产儿、低体重儿或免 疫缺陷的婴幼儿更容易被阪崎肠杆菌感染，虽然有抗生素的治疗，但总体死亡率高达80%。 不仅如此，阪崎肠杆菌也能引起成人的骨髓炎、菌血症和恶性肿瘤。2002年国际食品微生物 标准化委员会(ICMSF)把阪崎肠杆菌列为"严重危害特定人群，危害生命或慢性实质性后遗 症或长期影响"的一种致病菌。FA0/WH0把阪崎肠杆菌列为婴儿配方奶粉中的A类致病菌。
自从阪崎肠杆菌造成的危害得到频频报道后，食品中特别是婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆 菌的检测就显得非常重要。目前大部分实验室都参考美国食品及药品管理局(FDA)于2002 年制定的阪崎肠杆菌分离和计数方法，这是国际上颁布的第一个官方方法。2006年，ISO和国际乳品联盟(IDF)联合公布了 "乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测"方法即IS0/TS 22964 1 IDF/RM210。近年来国内外还发展了针对阪崎肠杆菌的分子生物学检测方法(李兆辉等， 2006; Hassan ctal' 2007)。由于阪崎肠杆菌在奶粉中的污染水平很低(0. 36-66 CFU/100g)， 而且奶粉不是无菌产品，可能会存在各种杂菌的污染，从而在检测阪崎肠杆菌时候会有其他 菌的千扰或者竞争，影响检出率。因此，迫切需要建立新的样品前处理方法，用于富集奶粉 中的阪崎肠杆菌，提高检出率。
免疫磁珠是由直径3 5微米，有一定磁性，且分散度良好的微珠经不同单克隆抗体包被 而成的颗粒，而免疫磁珠分离方法(i咖uno-magnetic s印aration, IMS)是于70年代中期 发展起来的一项免疫学技术。IMS用于食源性致病菌检测领域的原理是用特异性抗体包被 在磁珠表面来捕获检样(或增菌液)中的目标致病菌，然后在磁场的作用下被吸附沉淀，使 目标致病菌与影响和干扰检测灵敏度的检样残渣和其他杂菌分离开，起到浓縮作用，从而提 高检测的灵敏度和检出率。如在李斯特氏菌检测中，采用免疫磁珠技术的检出率显著高于标 准培养法，后者检出率仅为前者的36%。
IMS方法操作简便，只在检测样品或者增菌液中加入免疫磁珠，室温振荡混匀一定的时 间后，在磁场作用下反复用缓冲液洗涤即可，捕获目标菌的免疫磁珠不用与目标菌分离，直 接进行后续实验。由于IMS方法具有许多优点1、分离速度快，效率高、可重复性好；2、 操作简单，不需要昂贵的仪器设备；3、不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功 能等，因此在微生物检测方面具有很大的优势。目前，用IMS检测食品中常见的沙门氏菌 (Salehi et al， 2007)、单增李斯特菌(Uyttendaele et al， 2000; Yang et al， 2007) 和大肠杆菌0157 (Jenkins et al， 2003; Lee J H et al， 2006)等已渐渐成熟，并且已得到越来越多的应用。而且IMS也己成功用于从实际样品中检测志贺氏菌(Islam et al， 1992)、 副溶血性弧菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、粪链球菌、白色念珠菌、空肠 弯曲菌以及白色葡萄球菌，但尚未有阪崎肠杆菌的免疫磁珠富集方法报道。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种富集阪崎肠杆菌的试剂，该试剂可以直接从样品 中或前增菌培养液中富集目标微生物，起到浓缩作用，解决了样品前处理的瓶颈问题，提高 了检测灵敏度和检出率。
解决上述技术问题的技术方案如下
一种富集阪崎肠杆菌的试剂，包括包被有阪崎肠杆菌多克隆抗体的免疫磁珠。优选地，
效价为1: 49000 — 51000的90—110ul含阪崎肠杆菌多克隆抗体的兔免疫血清包被于 浓度为10mg/ral的17 — 23 u 1的She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠中制备得到。
本发明的另一需要解决的技术问题是提供上述富集阪崎肠杆菌的试剂的制备方法。 解决上述技术问题的技术方案如下
一种制备上述富集阪崎肠杆菌的试剂的方法，包括以下步骤
(1) 取浓度为lOmg/ml的17 —23 ul She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠于l.O ml洗涤 缓冲液中，混匀，置于磁力架上4土2 min，弃液体；重复洗涤2 — 5次后，加20 y 1洗涤缓
冲液使磁珠重悬其中，得磁珠重悬液；
(2) 在步骤(1)所述的磁珠重悬液中加入90 — 110nl (效价为1: 49000 — 51000)含 有阪崎肠杆菌多克隆抗体的兔免疫血清，室温混匀；用洗涤缓冲液容至20 y 1即得所述包被有阪崎肠杆菌多克隆抗体的免疫磁珠。
优选地，步骤(1)中，She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠的量为20yl;步骤(2)中 含有阪崎肠杆菌多克隆抗体的兔免疫血清量为100 y 1。
本发明首次建立了阪崎肠杆菌免疫磁珠分离方法。首先，制备阪崎肠杆菌兔免疫血清， 获得多克隆抗体；然后利用多克隆抗体包被免疫磁珠制备阪崎肠杆菌免疫磁珠；最后，对免 疫磁珠的特异性和敏感性进行验证，建立起的高效的样本前处理技术——阪崎肠杆菌免疫磁 珠富集方法，可与传统检测方法、分子检测方法和特异性生化显色检测方法等相结合对阪崎 肠杆菌进行检测，能大大提高检测的灵敏度和检出率，具有更广泛的应用前景。本发明所述 的试剂用于富集阪崎肠杆菌，分离简单、有效、省时和省力，为微生物快速检测样品前处理 提供了新的途径。
图1为阪崎肠杆菌标准株纯菌验证富集阪崎肠杆菌免疫磁珠敏感性的示意图。
具体实施例方式
实施例l:制备富集阪崎肠杆菌的试剂 1、阪崎肠杆菌免疫血清的制备
按常规方法制备含阪崎肠杆菌多克隆抗体的阪崎肠杆菌免疫血清。纯化的阪崎肠杆菌分 别以0.2%、 0.3%的甲醛灭活12 h、 24 h，在固定时间各取1 ml倾注TSA平板37。C培养24
h，观察菌的灭活情况。取完全灭活的阪崎肠杆菌，调整浓度至108CFU/ml，取0. 1 ml与等体积的福氏完全佐剂 乳化均匀，皮下多点注射新西兰兔(为了保证成功率，以3只兔子同时做实验)，每隔2周重 复注射一次。最后一次免疫后一周(血清效价达l:50000)给兔子放血取血清，-2CTC保存
备用o
免疫血清特异性的验证
分别取阪崎肠杆菌免疫血清未稀释、2倍稀释及生理盐水各20 u 1置无菌平板不同区域。 实验菌株划线接种NA平板，取单菌落加于各个区域，用无菌牙签不停混合，2min左右观察 凝集现象。
取未稀释及l: 2稀释(稀释液无菌生理盐水)的多克隆免疫血清20 11 1,对下列实验
室保存菌株做玻片凝集实验，每种菌设阳性对照(阪崎肠杆菌ATCC 51329)和阴性对照(生
理盐水)。玻片凝集实验证明该血清对阪崎肠杆菌两个标准株(ATCC 51329和ATCC 29544)
和15个实验室分离株产生强凝集反应；赫氏肠杆菌和阴沟肠杆菌的分离株产生弱凝集反应；
大肠杆菌(ATCC 25922)、大肠杆菌0157 : H7 (NCTC 12900)、鼠伤寒沙门氏菌(CMCC 50115)
和宋内氏志贺氏菌(CMCC 51592)没有凝集。结果如表1。
表1阪崎肠杆菌免疫血清玻片凝集实验
菌株 来源 _ifti清稀释麼_
_^_未稀释_Ll2_
阪崎肠杆菌 ATCC 51329 ++' ++ 阪崎肠杆菌 ATCC 29544 ++ ++ 阪崎肠杆菌 分离株(15株) ++ ++ 阴沟肠杆菌 分离株 + + 赫氏肠杆菌_分离株_t_1_
7大肠杆菌 ATCC 25922 - -伤寒沙门氏菌 CMCC 50115 - -大肠杆菌0157 : H7 NCTC 12900- -宋内氏志贺氏菌_CMCC 51592_=_=_
a++,强凝集；+,弱凝集； -，未凝集
2、富集阪崎肠杆菌的免疫磁珠的制备
取20 n 1 Dynabeads M-280 She印anti-Rabbit IgG磁珠液(10mg/ml)于1. 0 ml洗涤 缓冲液中，混匀，置于磁力架上4min,弃液体；重复洗涤3次后，加20 u 1洗涤缓冲液使 磁珠重悬其中。加入100 ul (效价l: 50000)阪崎肠杆菌兔免疫血清，室温轻缓水平振荡 30 min;用1.0 ml洗涤缓冲液清洗3次，4 min/次，以洗涤缓冲液定容至20 y 1，得到包 被有阪崎肠杆菌多克隆抗体的免疫磁珠，即富集阪崎肠杆菌的免疫磁珠，4'C保存备用。 富集阪崎肠杆菌免疫磁珠纯菌敏感性验证
阪崎肠杆菌标准株ATCC 51329和ATCC 29544过夜培养，按10倍梯度稀释，取10°-106 CFU/ml菌做阪崎肠杆菌免疫磁珠分离实验，分别计数上清中的菌数。免疫磁珠捕获百分比计 算(％):(各稀释度菌数一上清中菌数)Z各稀释度菌数。独立样品t检验显示两标准株间 无统计学意义上的显著差异(t=0. 100, sig=0. 922X3.05)。分离实验后涂显色培养基，免疫 磁珠最低捕获限为10 CFU/ml。结果如图1。
其他杂菌对富集阪崎肠杆菌免疫磁珠敏感性的影响.-
阪崎肠杆菌标准株ATCC 51329过夜培养，按10倍梯度稀释，取10°-106 CFU/ml菌做竞 争菌抑制实验，竞争菌选择沙门氏菌和阴沟肠杆菌(各106CFU/ml)。阪崎肠杆菌免疫磁珠吸 附后定容至IOO ul，稀释或者不稀释，涂显色培养基平板，37'C培养后计数典型蓝绿色菌落数。结果如表2。由表2可见在干扰菌沙门氏菌和阴沟肠杆菌存在条件下，阪崎肠杆菌 吸附率下降，但最低吸附限仍为10 CFUAnl，没有影响富集阪崎肠杆菌免疫磁珠的最低吸附限。
表2竞争菌对免疫磁珠吸附阪崎肠杆菌的影响
阪崎肠杆菌接种阪崎肠杆菌吸附率
量(CFU/ral)悬液菌数(CFU/ml)吸附率(%)
3. 5X1061. 34X10638
3. 5X1051. 73X10549
3. 5X1042.8X10480
3. 5X1032X10357
3. 5X10220057
3. 5X1012057
实施例2
1、 奶粉样品增菌后采用免疫磁珠富集阪崎肠杆菌
采用实施例1所述的富集阪崎肠杆菌的试剂(阪崎肠杆菌免疫磁珠)富集奶粉样品增菌 液后取100 yh稀释或者不稀释，涂显色培养基平板，37。C培养后观察典型蓝绿色菌落。 在显色培养基上，可见菌落清晰，分散，易于观察及分离纯化后鉴定。
2、 富集阪崎肠杆菌免疫磁珠与显色培养基法联用检测奶粉中阪崎肠杆菌
对37份疑似阳性奶粉样品增菌后，利用所建立的免疫磁珠进行富集，取悬浮液涂布阪 崎肠杆菌显色培养基平板，结果有ll份样品为阳性，并经API 20E系统鉴定获得确证；而 直接用显色培养基检测的阳性样品仅为9份。因此，应用免疫磁珠富集方法可以提高奶粉中 阪崎肠杆菌的检出率，2种检测方法的结果比较见表3。表3 2种检测方法结果比较
序列号疑似阳性样品编号8免疫磁珠+ 显色培养基显色培养基
1133
2167+
3285++
4289
5290
6292
7298
8302
9304
106
1111
128—
1318一
1488
15217—
16255—
17259—
18262—
19264—
20265—
21272—
22275—
23278——
24279一
25284一
26286一
27287
28291一—293
30296
31297
32299
33300
34301
35303
36305
37327
a婴幼儿奶粉样品号码；
b+:阳性结果；-阴性结果。
权利要求
1. 一种富集阪崎肠杆菌的试剂，其特征是，包括包被有阪崎肠杆菌多克隆抗体的免疫磁珠。
2. 根据权利要求l所述的富集阪崎肠杆菌的试剂，其特征是，包被有阪崎肠杆菌多克隆 抗体的免疫磁珠是由90 — 110u 1的效价为1: 49000 —51000的含阪崎肠杆菌多克隆抗体的 兔免疫血清包被于浓度为10mg/ml的17 — 23 y 1 She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠中制备的。
3. —种制备权利要求1所述的富集阪崎肠杆菌的试剂的方法，包括以下步骤(1) 取浓度为10mg/ml的17 — 23 y 1 She印anti-Rabbit IgG免疫磁珠于1.0 ml洗涤 缓冲液中，混匀，置于磁力架上4土2 min，弃液体；重复洗涤2 — 5次后，加20 y 1洗涤缓 冲液使磁珠重悬其中，得磁珠重悬液；(2) 在步骤(1)所述的磁珠重悬液中加入90—110u 1的效价为1: 49000_51000的含 有阪崎肠杆菌多克隆抗体的兔免疫血清，室温混匀；用洗涤缓冲液洗涤，再以洗涤缓冲液定 容至20 ixl，即得所述包被有阪崎肠杆菌多克隆抗体的免疫磁珠。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，步骤(1)中所述She印anti-Rabbit IgG 免疫磁珠的量为20ul;步骤(2)中所述含有阪崎肠杆菌多克隆抗体的兔免疫血清量为 lOOu 1。
全文摘要
本发明公开了一种富集阪崎肠杆菌的试剂及其制备方法，该试剂包括包被有阪崎肠杆菌多克隆抗体的免疫磁珠。该试剂可以直接从样品中或前增菌培养液中富集目标微生物，起到浓缩作用，解决了样品前处理的瓶颈问题，提高了检测灵敏度和检出率。
文档编号G01N33/569GK101482563SQ200910037189
公开日2009年7月15日 申请日期2009年2月13日 优先权日2009年2月13日
发明者吴清平, 周艳红, 张菊梅, 徐晓可 申请人:广东省微生物研究所