专利名称：利用荧光光谱拟合定量测量荧光共振能量转移效率的方法
技术领域：
本发明涉及荧光共振能量转移效率的测量方法，具体涉及一种利用荧光光谱拟合定量测量荧光共振能量转移效率的方法。
背景技术：
基于荧光的各种技术已经成为在活体细胞中实时检测细胞信号转导、细胞凋亡和增殖的分子调控机制的重要技术。荧光光谱技术被广泛应用于化学合成物以及蛋白质成分和结构的分析，也被广泛应用于肿瘤特征、中药成分以及中药作用机理的分析。荧光共振能量转移(FRET)技术是一种用于定量测量两个不同发光基团间距离的技术。FRET是通过分子间的电偶极相互作用将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，它是一种非辐射的能量越迁。当FRET发生时，供体荧光减弱，而受体荧光增强，如果能够准确测量受体增加的荧光强度和供体减少的荧光强度，就可以准确测量FRET效率。但是，由于供体和受体的发射光谱通常交叉在一起，并且目前广泛应用于生物研究的激光共聚焦扫描显微镜的最短波长为458nm，会将供体和受体同时激发，导致实际测量时很难将激发串扰和发射串扰消除，所以必须对测量的数据进行处理以便消除各种串扰带来的影响。目前已有多种计算FRET效率的方法，Gordon[Gordon G W，Berry G，Liang X H，Levine B，Herman B.Quantitative fluorescence resonanceenergy transfer measurements using fluorescence microscopy.BiophysicalJournal，1998，742702-2713.]提出了一种可以修正发射串扰的定量计算FRET效率的方法，采用三组不同的滤光片，分别测量分离的供体和受体以及供体-受体对在三组滤片组时的荧光强度，所以该方法非常复杂。另外，此方法不适用于固定的供体-受体对，因为很难得到分离的供体和受体。陈[Chen T S，ZengS Q，Luo Q M.Fitting of fluorescence resonance energy transfer efficiencyby means of emission spectra of donor-acceptor pair. Acta PhotonicaSinica，2001，30300-303.]提出了一种定量测量FRET效率的方法，该方法利用选择性激发供体时供体-受体对的发射谱信息，通过拟合定量获得FRET效率。但目前广泛应用于生物领域研究的激光共聚焦扫描显微镜等通常配置氩离子激光器，其最短激发波长为458nm，该激发光难以选择性激发供体，因此以上方法不适用于存在激发串扰的情况。
发明内容
针对现有FRET效率测量方法中存在的激发串扰和发射串扰问题，本发明的目的是提供一种新颖的通过拟合供体-受体对的荧光光谱来定量测量FRET效率的方法。
本发明通过以下的技术方案来实现一种利用荧光光谱拟合定量测量荧光共振能量转移效率的方法，包括以下具体步骤 一种利用荧光光谱拟合定量测量荧光共振能量转移效率的方法，包括以下具体步骤 (1)测量活细胞在供体-受体对转染前后的荧光发射光谱，得到纯的供体-受体对的荧光发射光谱SPmeasure(λ)； 测量荧光发射光谱时的激发波长438±20nm，发射光谱在470-580nm范围扫描； (2)分别测量供体和受体的荧光发射光谱，并归一化得到受体标准发射光谱SPa(λ)和供体标准发射光谱SPd(λ)，利用以下公式得到理论发射光谱SPnorm(λ) SPnorm(λ)＝SPnew(λ)/max(SPnew(λ))， 其中， SPnew(λ)＝xφASPa(λ)+(1-x)φD[(1-E)*b*SPd(λ)+EφA*SPa(λ)/φD]， 其中， E是能量共振转移效率，x为激发串扰，φD是供体的量子产额(对于ECFPφD＝0.40)，φA是受体的量子产额，(对于VenusφA＝0.57)， (3)然后计算不同E和x时，SPnorm(λ)和SPmeasure(λ)之间的标准偏差，E和x从0遍历至1，固定取值步长，当标准偏差最小时即得到荧光能量共振转移效E和激发串扰x。
为更好的实现本发明 上述供体-受体对使用SACT3。基于FRET原理构建的SACT3质粒由一个青色荧光蛋白(ECFP)供体、一个黄色荧光蛋白(YFP)的突变体(Venus)受体以及二者之间连接的一段包含caspase-3切割底物DEVD的序列组成，主要用于检测caspase-3的活化。
所述步骤(1)中，扫描光谱的步长为2nm，每一个点连续测量25次取平均。
本发明的基本原理如下 对于激光共聚焦显微镜，通常其最短激发波长为458nm，会导致供体和受体同时激发，而我们通常需要选择性的激发供体。在本发明中，我们利用了归一化的供体和受体的荧光发射谱，通过拟合测量得到的荧光光谱定量来分析能量共振转移效率。
首先，我们设总的激发光强为I0，而用于激发受体的光强为xI0，因此通过直接激发受体得到的荧光强度为Ia-d Ia-d＝xI0φA(1) 这里φA是受体的量子产额，(对于VenusφA＝0.57)。而直接激发供体产生的荧光强度Id+a Id+a＝(1-E)Id-a+φAEId-a/φD(2) 这里Id-a是没有受体存在时激发供体产生的荧光强度，E是能量共振转移效率，φD是供体的量子产额(对于ECFPφD＝0.40)。因为Id-a＝(1-x)I0φD，把它代入(2)，我们得到 Id+a＝(1-x)I0φD[(1-E)+φAE/φD](3) 因此存在激发串扰时，总的荧光强度为 I＝Ia-d+Id+a ＝Ia-d+(1-x)I0φD[(1-E)+φAE/φD](4) 通过(1)式，我们得到I0＝Ia-d/(xφA)，代入(5)式 我们设归一化的供体和受体的标准谱为SPd (λ)和SPa(λ)。并且标准谱的波长间隔为2nm。通过(5)得到存在激发串扰时的荧光发射谱为 这里 由于(6)式两边的积分范围相同，所以我们可以设定如下式子成立 由于在我们的发明中仅仅需要考虑归一化的发射谱，所以在(6)式两边同时乘以xφA，而不会改变光谱SP(λ)的形状。我们用SPnew(λ)代替SP(λ)，因此SPnew(λ)可以表示为 SPnew(λ)＝xφASPa(λ)+(1-x)φD[(1-E)*b*SPd(λ)+EφA*SPa(λ)/φD](8) 我们通过max(SPnew(λ))来归一化(7)式，这里max(SPnew(λ))代表SPnew(λ)的最大值，因此归一化的发射光谱可以表示为SPnorm(λ) SPnorm(λ)＝SPnew(λ)/max(SPnew(λ))(9) 然后我们计算不同E和x时SPnorm(λ)和实验得到的荧光发射谱SPmeasure(λ)之间的标准偏差(E和x都是从0到1)。通过最小二乘法拟合我们能够得到荧光能量共振转移效E和激发串扰x。拟合时E和x都是从0遍历到1，固定取值步长，当标准偏差最小时，此时对应的E和x的值就是荧光能量共振转移效E和激发串扰率x。
相对于现有技术，本发明具有如下的有益效果 本发明可以有效解决由于光谱激发串扰和发射串扰而导致很难定量测量FRET效率的问题。通过实时测量供体-受体的荧光光谱，运用本方法可以定量获得供体-受体对之间的FRET效率，从而可以监测蛋白的激活程度。另外由于FRET效率还可以反映蛋白之间的结合程度，运用本发明可以定量监测活细胞中蛋白质之间的相互作用。
图1是未经过星孢菌素处理的活细胞中SCAT3的光谱。
图2是经过星孢菌素处理12小时后活细胞中SCAT3的光谱。
图3是未转染SCAT3的活细胞的光谱。
图4是未经过星孢菌素处理的活细胞中SCAT3减去背景光谱之后的光谱。
图5是经过星孢菌素处理12小时后活细胞中SCAT3减去背景光谱之后的光谱。
图6是归一化的供体的荧光光谱。
图7是归一化的受体的荧光光谱。
图8是表示未经过星孢菌素处理的活细胞中SCAT3的光谱减去背景光谱并归一化得到的SPmeasure(λ)与公式(8)拟合得到的结果，其FRET效率为25.4％。+++表示实验数据，---表示拟合数据。
图9是表示经过星孢菌素处理12小时的活细胞中SCAT3的光谱减去背景光谱并归一化得到的SPmeasure(λ)与公式(8)拟合得到的结果，其FRET效率为4.5％。+++表示实验数据，---表示拟合数据。
具体实施例方式 下面结合附图和实施例进一步描述本发明，但本发明的实施方式不限于此。
1、质粒来源 质粒SCAT3质粒购自德国默克公司。
2、细胞培养 人类肺腺癌细胞(ASTC-a-1)生长在含10％新生牛血清，50units/ml的青霉素和50g/ml的链霉素的DMEM培养液中，待生长到70-85％汇合后用胰蛋白酶消化传代，以1×104个细胞/孔间隔接种于细胞培养皿中，每皿500μl培养液，接种后放入培养箱(37℃，5％CO2)继续培养。通过脂质体将SCAT3质粒转然到ASTC-a-1细胞中，利用G418对转染了SCAT3的细胞进行筛选，获得稳定表达SCAT3的ASTC-a-1细胞[Wu Y X，Xing D，Chen W R.Single cell FRET imagingfor determination of pathway of tumor cell apoptosis induced byphotofrin-PDT.Cell Cycle，2006，5729-734.；Wu Y X，Xing D，Luo S M，Tang Y H，Chen Q.Detection of caspase-3 activation in single cells byfluorescence resonance energy transfer during photodynamic therapyinduced apoptosis.Cancer Letter，2006，235239-247.]。
3、荧光共振能量转移效率的测量。
利用G418对转染了SCAT3的细胞进行筛选，获得稳定表达SCAT3的ASTC-a-1细胞。将稳定转染表达了SCAT3的ASTC-a-1细胞接种到96孔板中培养24h，然后更换培养液后每孔加入100L浓度为1mol/L的星孢菌素。然后用自动微孔检测仪(infinite M200，Tecan，Austria)测量活细胞内供体-受体对的荧光发射光谱。激发波长438±20nm，发射光谱在470-580nm范围扫描，扫描光谱步长为2nm，每一个点连续测量25次取平均。测量得到的光谱如图1和图2所示图1是未经过星孢菌素处理的活细胞中SCAT3的光谱。图2是经过星孢菌素处理12小时后活细胞中SCAT3的光谱。
(1)测量没有转染SCAT3细胞的对应发射光谱作为背景光谱。激发波长438±20nm，发射光谱在470-580nm范围扫描，扫描光谱步长为2nm，每一个点连续测量25次取平均。测量所得的背景光谱如图3所示。
(2)将稳定转染表达了供体-受体对的细胞的荧光光谱减去背景光谱并归一化，即得到了纯的供体-受体对的荧光光谱SPmeasure(λ)，如图4和5所示。
(3)测量供体和受体的发射光谱，并归一化得到受体标准发射光谱SPa(λ)和供体标准发射光谱SPd(λ)，供体和受体的归一化发射光谱如下图6和图7所示。
利用以下公式得到理论发射光谱SPnorm(λ) SPnorm(λ)＝SPnew(λ)/max(SPnew(λ))， 其中， SPnew(λ)＝xφASPa(λ)+(1-x)φD[(1-E)*b*SPd(λ)+EφA*SPa(λ)/φD]， 其中E是能量共振转移效率，x为激发串扰，φD是供体的量子产额(对于ECFPφD＝0.40)，φA是受体的量子产额，(对于VenusφA＝0.57) 本实例中b＝0.60.所以 SPnew(λ)＝0.57x*SPa(λ)+0.4(1-x)
SPnorm(λ)＝SPnew(λ)/max(SPnew(λ)) (4)然后计算不同E和x时SPnorm(λ)和实验得到的荧光发射谱SPmeasure(λ)之间的标准偏差(E和x都是从0到1)。拟合时E和x都是从0遍历到1，取值步长为0.01，当标准偏差最小时即得到荧光能量共振转移效E和激发串扰x。
基于以上计算，测量得到的未经过STS处理以及经STS处理12小时的活细胞中SCAT3的光谱减去背景光谱并归一化得到的SPmeasure(λ)与SPnorm(λ)拟合得到的结果如图8和9所示。
从本实例看出，经过星孢菌素处理12小时后的细胞中的SCAT3的FRET效率E更小，说明经过星孢菌素处理后，细胞内的caspase3被激活，导致SCAT3被切割，使SCAT3的FRET效率E降低。而caspase3被激活，则细胞会不可逆转的进入凋亡，所以可以通过本发明可以检测细胞的凋亡。
另外，本实例的结果可以通过荧光寿命成像显微镜证实。对稳定表达SCAT3的活细胞的用星孢菌素进行处理，在未处理和处理12小时后进行荧光寿命成像实验，得到的FRET效率E分别为24.4％和3.7％，与用本发明得到的结果基本一致。
权利要求
1、一种利用荧光光谱拟合定量测量荧光共振能量转移效率的方法，包括以下具体步骤
(1)测量活细胞在供体-受体对转染前后的荧光发射光谱，得到纯的供体-受体对的荧光发射光谱SPmeasure(λ)；
测量荧光发射光谱时的激发波长438±20nm，发射光谱在470-580nm范围扫描；
(2)分别测量供体和受体的荧光发射光谱，并归一化得到受体标准发射光谱SPa(λ)和供体标准发射光谱SPd(λ)，利用以下公式得到理论发射光谱SPnorm(λ)
SPnorm(λ)＝SPnew(λ)/max(SPnew(λ))，
其中，
SPnew(λ)＝xφASPa(λ)+(1-x)φD[(1-E)*b*SPd(λ)+EφA*SPa(λ)/φD]，
其中，
E是能量共振转移效率，x为激发串扰，φD是供体的量子产额，φA是受体的量子产额，
(3)然后计算不同E和x时，SPnorm(λ)和SPmeasure (λ)之间的标准偏差，E和x从0遍历至1，固定取值步长，当标准偏差最小时即得到荧光能量共振转移效E和激发串扰x。
2、根据权利要求1所述的利用荧光光谱拟合定量测量荧光共振能量转移效率的方法，其特征在于所述供体-受体对为SACT3，其包括青色荧光蛋白ECFP作为供体和黄色荧光蛋白YFP的突变体Venus作为受体。
3、根据权利要求1所述的利用荧光光谱拟合定量测量荧光共振能量转移效率的方法，其特征在于所述步骤(1)中，扫描光谱时的步长为2nm，每一个点连续测量25次取平均。
全文摘要
本发明涉及荧光共振能量转移效率的测量方法，具体提供了一种利用荧光光谱拟合定量测量荧光共振能量转移效率的方法。该方法的步骤包括首先测量得到细胞内供体-受体对的荧光发射谱；进而利用归一化的供体、受体的荧光发射谱，得到供体-受体对的拟合荧光光谱；最后计算实验光谱与拟合光谱在最接近时的荧光共振能量转移效率。通过本发明的方法可以有效解决由于光谱激发串扰和发射串扰而导致很难定量测量FRET效率的问题，从而可以更准确地监测蛋白的激活程度以及活细胞中蛋白质之间的相互作用。
文档编号G01N33/566GK101551332SQ20091003947
公开日2009年10月7日 申请日期2009年5月14日 优先权日2009年5月14日
发明者陈同生, 王龙祥 申请人:华南师范大学