高迁移率族蛋白b2用作肝细胞癌标志物的应用的制作方法

文档序号:6148978阅读:207来源:国知局
专利名称:高迁移率族蛋白b2用作肝细胞癌标志物的应用的制作方法
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地说,涉及高迁移率族蛋白B2的应用,更具体地 说,涉及高迁移率族蛋白B2作为肝细胞癌的蛋白质分子标记的应用。
背景技术
肝细胞癌是世界范围内第四位、我国第二位的常见恶性肿瘤,每年大约有250,000 名患者死于肝细胞癌。肝细胞癌恶性程度高,容易复发和转移,预后差,而且早期诊断较困 难,往往延误了最佳治疗时期。西方发达国家肝癌的发病率较低,国际上对肝癌的基础研究 仍较为薄弱,而我国是肝癌高发国家,发病率和死亡率呈现上升趋势,且发病年龄构成年轻 化,每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加,肝癌成了严重危害我国人民生命财产安全的 头号敌人,并且是影响社会经济发展的一个重要因素,加大力度进行我国肝癌的基础研究 具有战略意义,而分离和鉴定新的肝癌相关基因是目前肝癌基础研究中的前沿课题。到目前为止,已有不下20种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关,但已 确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高,肝癌的发病机制至今仍未阐明,肝癌 的早期诊断率仍有待提高。此外,传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因 治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率,因而寻找新的肝癌相关基因、尤其是肝癌高 表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。因此,研究和开发在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质具有重要意义,寻找 新的在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质也具有迫切需要性。B2(High mobility group protein B2, High mobility group protein 2,HMGB2, HMG2, HMG-2)的 NCBI 的登录号为 NP_002120,Swissprot 登录号为 P26583,IPI号为IPI00219097. 4(human3. 28version)。高迁移率族蛋白B2是与内质网结 合的SET复合体的组成成份之一,其具有多种重要作用,如能够直接与SET相互作用,能够 优先结合单链 DNA 以及解开双链 DNA (http://www. uniprot. org/uniprot/P26583)等,但至 今只有少量研究结果表明高迁移率族蛋白B2在基因水平上与癌症有关或在蛋白质水平上 与癌症有关,其中表明高迁移率族蛋白B2在基因水平上与癌症有关的文献主要有 Transcriptionalprofiling of medulloblastoma in children. J Neurosurg. 2003 ; 99 (3) 534-41 (通过cDNA芯片的方法来比较成神经管细胞瘤和正常小脑样品中基因的表 达水平,结果发现高迁移率族蛋白B2基因在成神经管细胞瘤中表达水平较高),Molecular targets for tumour progression ingastrointestinal stromal tumours. Gut. 2004 ; 53(2) :235-40(通过定量RT-PCR发现高迀移率族蛋白B2基因在恶性胃肠基质癌中过表 达),f[ISET complex in serous epithelial ovariancancer. Int J Cancer. 2006 ; 119(9) 2119-26 (通过比较低恶性潜能和高恶性潜能的浆液性卵巢上皮性肿瘤(O级对3级)发现 高迁移率族蛋白B2基因在有扩散性的3级肿瘤中高表达,同时通过组织芯片结合免疫组织 化学研究发现高表达的高迁移率族蛋白B2与病人的预后有关)。
表明高迁移率族蛋白B2在蛋白质水平上与癌症有关的文献为0VereXpreSSiOn of thehigh mobility group (HMG) B land B2 proteins directly correlates with the progression ofsquamous cell carcinoma in skin. Cancer Invest. 2008 ;26 (8) 843-51 (通过对皮肤鳞状细胞癌的研究发现高迁移率族蛋白B2与肿瘤变化的程度直接相 关,并可能有效的刺激细胞分化、肿瘤生长以及转移)。但是到目前为止,现有技术中尚未见到有关于高迁移率族蛋白B2与肝细胞癌的 相关性的报道。

发明内容
通过筛选在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中差异表达的蛋白质,本申请的 发明人找到了一种在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达的蛋白质(在 癌组织中上调表达),经质谱鉴定为高迁移率族蛋白B2。免疫印迹实验证实,高迁移率族蛋 白B2的确在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中表达上调)。利 用人肝细胞癌细胞株H印G2和人正常肝细胞株L02进行的免疫荧光实验,证明高迁移率族 蛋白B2在这两种细胞株间存在差异表达(在人肝细胞癌细胞株H印G2中表达上调)。基于高迁移率族蛋白B2与肝细胞癌的这种相关性,这种蛋白质可以作为一种蛋 白质分子标记物对它的表达量进行检测可以用于检测肝细胞癌。 因此,本发明的首要目的在于,提供一种高迁移率族蛋白B2的应用,以用作检测 肝细胞癌。本发明提供的高迁移率族蛋白B2的应用为,用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。本发明的另一个目的在于,提供一种高迁移率族蛋白B2的抗体的应用。本发明提供的高迁移率族蛋白B2的抗体的应用,包括单克隆抗体和多克隆抗体, 为用于制备检测肝细胞癌的制剂和/或试剂盒。本发明的又一个目的在于提供一种体外检测肝组织中高迁移率族蛋白B2的表达 是否异常的方法。本发明提供的体外检测肝组织中高迁移率族蛋白B2的表达是否异常的方法为 用特异性抗高迁移率族蛋白B2的抗体检测待测肝组织细胞中高迁移率族蛋白B2的数量, 并与正常肝组织中的高迁移率族蛋白B2的数量进行比较。高迁移率族蛋白B2在肝细胞癌的癌细胞和癌旁细胞中存在明显的差异表达,因 此,可根据其在肝细胞中的表达量检测患者是否患有肝细胞癌。同时,鉴于到目前为止,还 没有高迁移率族蛋白B2的表达量与肝细胞癌的相关性报道。因此,本发明的这一发现将为 肝细胞癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。


图1为高迁移率族蛋白B2的免疫印迹分析结果,其中,泳道1-6为肝细胞癌组织 的检测结果,泳道1’ -6’为与泳道1-6对应的癌旁组织的检测结果。图2为对图1的免疫印迹图谱进行数据分析得出的蛋白质表达量相对分布图,其 中,HCC为肝细胞癌患者的癌组织,non-HCC为癌旁组织,纵坐标IOD为蛋白质表达量相对丰度。图3为高迁移率族蛋白B2的免疫荧光实验结果,其中,图Al为HepG2细胞中蛋白 B2的分布情况,图A2为H印G2的细胞核,图A3为Al和A2的叠加图,图Bl为L02细胞中蛋 白B2的分布情况,图B2为L02的细胞核,图B3为Bl和B2的叠加图。
具体实施例方式以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人, 分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件,或按照制造厂商所建议的条件。在本发明的下述实施例中,尿素、3-[(3_胆酰胺丙基)_ 二乙铵]-1-丙磺酸 (CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、三(羟甲基)氨基乙烷(Tris)、碘代乙 酰胺(IAA)购自Bio-Rad公司;CLM-2262L-Leu(U-13C6,98% )购自剑桥同位素实验室;透 析胎牛血清购自Gibco公司;D9785细胞培养粉末、β -巯基乙醇、L-GlruL-Lys和L-Met购 自 Sigma 公司;胰蛋白酶(Trypsin,sequencing grade)购自 Promega 公司;SCX 柱禾Π SAX 柱以及PH缓冲液试剂盒购自Column Technology公司;!fepG2细胞株和L02细胞株购自中 国科学院上海生命科学研究院生物化学和细胞研究所的细胞库。在本发明的下述实施例中,使用的溶液/培养基配方如下不含谷氨酰胺的RPMI1640培养基5%透析胎牛血清,0.2mM苯甲基磺酰氟 (PMSF),ImM EDTA,苯甲异恶唑青霉素25mg/mL,庆大霉素50mg/mL,青霉素100U/mL,链霉素 100mg/mL,两性霉素 B 0. 25mg/mL,制霉菌素 50U/mL。裂解液8mol/L尿素、4% CHAPS、40mmol/L Tris 和 65mmol/L DTT。裂解缓冲液8mol/L尿素,40mmol/L Tris, 65mmol/L DTT。TBST =Tris 2. 42g/L,氯化钠 8g/L, Tween_201ml/L,用 HCl 调节 pH 到 7. 6。本申请的发明人用非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation, NESP)制备了肝细胞癌的癌组织与癌旁组织的蛋白质样品,并采用CDIT技术结合溶液内酶 解及阴阳多维液相色谱串联质谱的蛋白质组学标记定量技术对其中的蛋白质进行鉴定并 比较其表达量,结果发现高迁移率族蛋白B2在肝细胞癌组织中上调表达。免疫印迹实验进 一步证实高迁移率族蛋白B2的确在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达。另 外,免疫荧光实验也进一步证实了高迁移率族蛋白B2的确在人类肝细胞癌患者的癌组织 和癌旁组织中存在差异表达,具体如实施例所示。因此,以高迁移率族蛋白B2作为蛋白质 分子标记物对它的表达量进行检测可以用于检测肝细胞癌,即高迁移率族蛋白B2可以用 作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。实施例1、肝细胞癌癌组织及癌旁组织蛋白质样品的制备从东方肝胆外科医院获取5例肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织,该5例患者,均 由2名病理科医生确诊,患有肝细胞癌,5例患者的病理资料如表1所示。表1、5例肝细胞癌标本的病理资料
权利要求
一种高迁移率族蛋白B2的应用,其特征在于,所述应用为所述高迁移率族蛋白B2用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记 是检测高迁移率族蛋白B2在肝细胞组织中的表达量。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述检测高迁移率族蛋白B2在肝细胞组织 中的表达量是检测高迁移率族蛋白B2在肝细胞组织中是否均存在上调表达。
4.一种抗高迁移率族蛋白B2的抗体的应用,其特征在于,所述应用为用于制备检测肝 细胞癌的制剂。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述抗高迁移率族蛋白B2的抗体包括单克 隆抗体和多克隆抗体。
6.一种抗高迁移率族蛋白B2的抗体的应用,其特征在于,所述应用为用于制备检测肝 细胞癌的试剂盒。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述抗高迁移率族蛋白B2的抗体包括单克 隆抗体和多克隆抗体。
8.—种体外检测肝组织中高迁移率族蛋白B2的表达是否异常的方法,其特征在于,所 述方法为用特异性抗高迁移率族蛋白B2的抗体检测待测肝组织细胞中高迁移率族蛋白 B2的数量,并与正常肝组织中的高迁移率族蛋白B2的数量进行比较。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述抗高迁移率族蛋白B2的抗体包括单克 隆抗体和多克隆抗体。
全文摘要
本发明提供了一种高迁移率族蛋白B2的应用。本发明提供的高迁移率族蛋白B2的应用为高迁移率族蛋白B2作为检测肝细胞癌的蛋白质分子标记的应用。高迁移率族蛋白B2在肝细胞癌的癌细胞和癌旁细胞中存在明显的差异表达,因此,可根据其在肝细胞中的表达量检测患者是否患有肝细胞癌。
文档编号G01N33/577GK101995471SQ20091005678
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月21日 优先权日2009年8月21日
发明者徐孟杰, 曾嵘, 李辰, 武祎, 阮宏强 申请人:中国科学院上海生命科学研究院
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1