专利名称：：适于小动物的荧光分子层析成像方法
技术领域：
：本发明属于光谱技术应用，和生物医学工程领域，涉及一种在体检测小动物体内荧光标记分子位置与定量检测小动物体内荧光标记分子浓度的荧光分子层析成像方法。
背景技术：
：随着生物荧光蛋白，生物荧光标记技术的发展，靶向性的荧光标记物越来越多的用在肿瘤检测和药物研发中。这在一定程度上提高了药物研发周期，和肿瘤检测的准确性。但是由于荧光在生物组织内传播过程的复杂性，它并不像X射线一样在组织中是沿直线传播，由于组织对可见光的强散射性质，使得进入组织内部的光和从组织内部激发出来的荧光都是一个经历了多次散射的传播过程，这使得荧光完全散失了相干性。因此很难根据出射的荧光光强和相位信息来确定荧光团的实际位置只有当荧光团在组织表面很浅的范围内才可能根据光强或者是相位信息来探测荧光团的位置并定量检测荧光物质的浓度。这在很大程度上制约了荧光蛋白被用来在体观测药物疗效和检测肿瘤。因此现在所能够精确定位和准确定量检测荧光标记物的技术也只能针对表皮或皮下很浅的位置上的荧光标记物。对于深入体内的荧光标记物就很难精确定位和准确定量检测。为了解决这个问题国际上研究生物医学光学的学者提出了运用非线性的算法来近似荧光在组织内的传播过程。其中英国UCL(universityofcollegelondon)的S.R.Arridge教授提出了运用有限元的方法近似模拟光在生物组织内的传播，并通过非线性拟合的方法结合实验数据准确定位了深层次的光学参数的改变(S.R.Arridge，OpticalTomographyinMedicalImaging.InverseProblems,1999.15(2):p.R41-R93)。这为荧光分子层析成像技术的发展奠定了坚实的理论基础。但是由于S.R.Arridge教授的方法还只是针对血红蛋白和去氧血红蛋白的含量的检测技术，还不能用来做荧光分子层析成像。哈佛医学院的Vasilis.Ntziachristos教授在这个方法的基础上提出的荧光分子层析成像方法(Vasilis.Ntziachristos,Fluorescencemolecularimaging.AnnualReviewofBiomedicalEngineering,2006.8(1):p.1-33)比较成功的准确定位了深层次的荧光标记物位置，并定量的检测了荧光标记物的浓度。但是他的算法是基Kirchhoff近似(JorgeRipoll，VasilisNtziachristos,RemiCarminati,ManuelNieto-Vesperinas,KirchhoffapproximationfordiffUsivewaves.PhysicalReviewE,2001.64(051917):p.1-8.)来求解扩散方程。这种方法没有基于有限元的算法的高精度和计算速度。有限元算法本身发展于结构力学分析，后随着理论研究的深入人们将它应用到更加广阔的领域，如热力学分析，电磁学分析，地球物理等等，但将有限元方法用来做荧光分子层析成像国内却还没有相关专利。
发明内容本发明的技术问题在于提供一种适于小动物的荧光分子层析成像方法，该方法可基于相应的仪器测量数据，定位小动物组织内部深层荧光标记物位置及其浓度，并层析成像，为药物开发，肿瘤治疗提供参考手段。为解决上述技术问题，本发明的适于小动物的荧光分子层析成像方法，包括荧光标记物在生物体内分布的位置和浓度信息的定量检测技术，包括以下步骤步骤a、通过荧光分子层析成像系统得到荧光光强分布①;r;步骤b、将目标生物组织的空间结构离散为由Ne个空间四边形组成的三维组织模型，这Ne个空间四边形的顶点组成了一个包含N1个点的集合；每个点的三维位置由Nlx，Nly，Nlz表示，同时在每个点上根据相关文献设定一组目标生物组织的各类组织光学特性参数，包括激发光扩散系数A，激发光吸收系数/^，荧光扩散系数D,，突光吸收系数a,，和一组猜测的荧光光学参数值t/。，利用有限元方法将分离出来的离散的Ne个空间四边形，Nl个点的集合，和A，/^，",，/v系数代入如下扩散近似的辐射传输方程式(i)、式(ii)中进行计算，得到离散的荧光光强分布^，以及荧光光强分布函数对荧光光学参数的偏导数即梯度J=;L。v.[De(ovoe(noe(O=0(i)V[Z),()Vd),(7)]—/^①,(-)=—Oe((A"/W)(ii)其中下标e代表激发光的各个光学参数。^f)为激发光的扩散系数，A。为激发光的吸收系数，^("为激发光的光强，"/("为荧光的扩散系数，A/为荧光的吸收系数，下标m代表被激发光的各个光学参数，"代表量子效应常数；步骤c、将步骤b得到的梯度J作为非线性优化算法的搜索方向，将初始猜测荧光光学参数分布值^加上梯度J作为下一步迭代算法的初始值R，然后将初始值^"代入第二步中进行运算得到下一步的梯度Jn，如此迭代运算，直到满足如下公式(iii):minI①T"_r^(C/)<DeI(iii)最后得到可能与实际光学参数值最接近的像素点集合，逐个计算所述像素点集合中每个像素点的光学参数值。步骤d、根据步骤C得到的每个像素点的光学参数分布图，通过计算机将参数分布图显示出来。本发明建立了一种基于有限元方法的荧光分子层析成像算法，由于该方法利用辐射传输方程的扩散近似精确描述了荧光在组织中的传播过程，并结合有限元方法快速有效的计算了荧光分布，最后结合非线性优化算法能够反推出荧光标记物的浓度和位置。因此可以通过这种算法可以精确确定荧光标记物的位置和大小，并能够定量确定荧光标记物的浓度。本专利采用了辐射传播的扩散近似来描述光在组织内的传播过程，这种近似在组织散射系数远远大于组织吸收系数的条件下可以很好的模拟光在组织内的传播过程。特别对于深层次的荧光信号，可以准确快速恢复该深层次的荧光信号所携带的深度和强度信息，从而达到准确定位荧光标记物位置和强度的效果。图1为光在组织内传播的理论值与实验值的对比。图2为某实验样本示意图。图3为某实验样本实物图。图4为荧光标记物重构切片图。图5为荧光标记物量化准确度曲线。具体实施例方式具体的实施步骤如下1、通过荧光分子层析成像系统得到荧光光强分布o;r。2、将目标生物组织的空间结构离散为由Ne个空间四边形组成的三维组织模型，这N个空间四边形的顶点组成了一个包含N1个点的集合。每个点的三维位置由Nlx，Nly，Nlz表示，同时在每个点上根据相关文献设定一组目标生物组织的各类组织光学特性参数，包括激发光扩散系数马，激发光吸收系数/^，荧光扩散系数巧，荧光吸收系数/v,和一组猜测的荧光光学参数值t/。，利用有限元方法将分离出来的离散的Ne个空间四边形，Nl个点的集合，和化，/^，A,/v系数代入如下扩散近似的辐射传输方程(1)和(2)中进行计算。▽[A()V①ef)]-/iaeOe(O=0(1)▽[/^(OVO^O]-/^/!^,):-O)e(0t/(r，77//a/)(2)其中下标e代表激发光的各个光学参数。A^)为激发光的扩散系数，As为激发光的吸收系数，A^)为激发光的光强，A(。为荧光的扩散系数，A,为荧光的吸收系数，下标m代表被激发光的各个光学参数，〃代表量子效应常数。t/^U/v)-7^,^)①=Zc,礼3、利用有限元方法将公式(1)(2)离散为'=1足:其中p'满(3)代入公式1和2并结合Green函数将边界条件归入方程组中得到如下方程组:(4)其中4，G，a，^为N1*N1的矩阵N1为有限元划分的点的数目。矩阵的具体形式如下所示C=f〃(rKr々)"r(5)1_r———g=^^#,(r)w■(Oofr"2P^、^'、J将公式(4)中得到的^带入下式。(4+C,+2,)①"F,^(6)其中4^/必，H为NpNNi的矩阵M为有限元划分的点的数目。矩阵的具体形式如下所示C/,乂=J〃a/(",(/")w乂(r)dr1_rj卄—2Z3。6=—j"0，〃〃d0)r々)d广由公式(6)和(7)最后得到^也就是荧光光强的分布。4、计算^关于荧光光学参数U的梯度矩阵(雅克比矩阵"70。4.1、计算伴随光强分布①"。按照如下公式计算04/+C/+2/)O+/=g+其中f一—(7)(8)(9)1_r—卄—丄〃Q《+代表的是在第三类边界条件下以测量点为光源位置的光强分布函4.2、计算荧光光强r随每个剖分点的荧光参数的变化的梯度。其中r(《,^D,G,x巧x(^(10)其中的^，《，分别代表第(位置的探测器和《位置的光源.A为测量符可以表示为D_f^(W)如果点j处于mi所在J=0其他情况勿*^(11)5、将第2步得到的梯度J作为非线性优化算法的搜索方向，将初始猜测荧光光学参数分布值C/。加上梯度J作为下一步迭代算法的初始值R，然后将初始值^代入第二步中进行运算得到下一步的梯度Jn如此迭代运算，直到满足如下公式-otl①r-r^(W)」1(12)迭代多次后得到与实际光学参数值最接近的计算值。逐个计算每个像素点的光学参数值。6、根据第5步得到的每个像素点的光学参数分布图，通过计算机将参数分布图显示出来。下面通过实例结合说明书附图对本发明作进一步阐述验证。实例1:本实例主要为了证明在本发明专利中提到的有限元方法计算荧光在体内传播的准确性。具体步骤为将10%的intralipid(脂肪乳溶液装)入长46.3mm宽19.2mm高60mm的玻璃容器内。在玻璃容器的一侧利用632.8nm的氦氖激光器垂直照射到玻璃容器上。在玻璃容器的另外一侧利用高性能制冷CCD记录光强。由文献中提到的10%脂肪乳溶液的光学参数为<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>各向异性因子0.8250.8230.829表110%intralipid溶液光学参数由表l的数据作为化，//w，",，/v，结合利用本专利提出的方法，将实际物体离散成1800个点，3600个空间四边形单元，利用有限元方法代入公式(1)计算得到理论上激光通过10。/。intralipid溶液后光强，将这个数据与CCD记录的如附图3所示，沿黑线代表的区域的数据进行比较可以得到附图1所示数据。从图上可以看出，理论计算曲线与实验得到的曲线拟和性非常高，证明上述第4步中计算激发光和荧光在组织中的强度分布函数是正确的。实例2本实例主要证明了本专利的方法可以用来定位体内荧光标记物。具体步骤为将一对装有量子点荧光标记物的玻璃管(间距为4.1mm，玻璃管内径为2mm)放入装有10°/。intralipid溶液的玻璃容器内，容器长46.3mm宽19.2mm高60mm，如附图2所示。用632.8nm的氦氖激光器照射垂直照射玻璃容器。然后用高性能制冷CCD在玻璃容器的另一侧记录荧光光强。移动6次激光器的位置，每次向左移动2mm。同时用高性能制冷CCD在玻璃容器的另一侧记录荧光光强。然后将玻璃管的间距改为3.2mm，2.1mm，0.9mm，重复上面实验过程。最后将实验数据作为化，//w，i),.，/v参数代入本专利的算法中进行计算，将实际物体离散成3000个点，6000个空间四边形单元，利用有限元方法代入公式(1)，按照步骤2可得到荧光光强的计算值，同时根据步骤1可以得到如附图3中黑线所示的位置的实验数据，最后将计算得到的数据和实验得到的数据结合就得到如附图4所示的结果。从图4中可以看出利用本专利提出的算法可以很好的计算出荧光标记物的位置。且分辨率可以达到0.9mm。这个结果已经接近国际水平(EdwardE.Graves,JorgeRipoll,RalphWeissleder，VasilisNtziachristos，Asubmillimeterresolutionfluorescencemolecularimagingsystemforsmallanimalimaging.Med.Phys,2003.30(5):p.901-911.)。由此可以证明该专利的所提到的算法可以有效重构荧光标记物的位置。实例3本实例主要证明了本专利提到的方法可以用来定量检测荧光标记物的浓度，具体步骤为将一根装有100%浓度量子点荧光标记物的玻璃管(间距为4.1mm,内径2mm)放入装有10%intralipid溶液的玻璃容器内(离玻璃表面7mm)。容器长46.3mm宽19.2mm高60mm,如附图2所示。用632.8nm的氦氖激光器照射垂直照射玻璃容器。然后用高性能制冷CCD在玻璃容器的另一侧记录荧光光强。移动6次激光器的位置。每次向左移动2mm。同时用高性能制冷CCD在玻璃容器的另一侧记录荧光光强。然后将玻璃管内的量子点标记物浓度改为80%，70%，50%，30%，重复上面实验过程。最后将实验数据代入本专利的算法中进行计算，将实际物体离散成3000个点，6000个空间四边形单元，利用有限元方法代入公式(1)，按照本专利提出的算法重构如附图3中黑线所示的切片。得到切片图后求它的灰度值的平均值。得到的这个数据对应于重构的量子点标记物的浓度值。将这个计算值与实际值进行比较可以得到附图5所示结果。在附图5中横坐标代表的是实际荧光标记物的浓度值，纵坐标表示的是重构的荧光标记物的浓度值，在理想情况下重构的荧光标记物的浓度值应该恒等于实际荧光标记物的浓度值，因此在附图5中应该是一条过原点且与横坐标呈45度角的直线(如附图5中线条所示结果)，而在实际情况中由于有误差的原因，并不能得到理想情况下的结果。附图5中圆点的数据为通过本专利的方法得到的实际数据，可以很明显的看出本专利的方法能够很好的重构出荧光物质的浓度，且其误差与实际荧光标记物的浓度值相差很小。权利要求1、一种适于小动物的荧光分子层析成像方法，其特征在于，采用荧光标记物在生物体内分布的位置和浓度信息的定量检测技术，包括以下步骤步骤a、通过荧光分子层析成像系统得到荧光光强分布步骤b、将目标生物组织的空间结构离散为由Ne个空间四边形组成的三维组织模型，这Ne个空间四边形的顶点组成了一个包含Nl个点的集合；每个点的三维位置由Nlx，Nly，Nlz表示，同时在每个点上根据相关文献设定一组目标生物组织的各类组织光学特性参数，包括激发光扩散系数De，激发光吸收系数μαe，荧光扩散系数Df，荧光吸收系数μαf，和一组猜测的荧光光学参数值U0，利用有限元方法将分离出来的离散的Ne个空间四边形，Nl个点的集合，和De，μαe，Df，μαf系数代入如下扩散近似的辐射传输方程式(i)、式(ii)中进行计算，得到离散的荧光光强分布Φf，以及荧光光强分布函数对荧光光学参数的偏导数即梯度其中下标e代表激发光的各个光学参数。为激发光的扩散系数，μαe为激发光的吸收系数，为激发光的光强，为荧光的扩散系数，μαf为荧光的吸收系数，下标m代表被激发光的各个光学参数，η代表量子效应常数；步骤c、将步骤b得到的梯度J作为非线性优化算法的搜索方向，将初始猜测荧光光学参数分布值U0加上梯度J作为下一步迭代算法的初始值Un，然后将初始值Un代入步骤b中进行迭代运算得到下一步的梯度Jn，反复迭代运算，直到满足如下公式(iii)最后得到可能与实际光学参数值最接近的像素点集合，逐个计算所述像素点集合中每个像素点的光学参数值；步骤d、根据步骤c得到的每个像素点的光学参数分布图，通过计算机图形处理后显示。全文摘要本发明涉及光谱技术在生物医学工程领域的应用，特别涉及一种适于小动物的荧光分子层析成像方法，该方法利用辐射传输方程的扩散近似精确描述了荧光在组织中的传播过程，采用有限元方法计算组织中荧光分布，结合非线性优化算法反推出荧光标记物的浓度和位置，最后通过计算机图形处理进行荧光分子层析成像显示。本发明可基于相应的仪器测量数据，定位小动物组织内部深层荧光标记物位置及其浓度，并层析成像。特别对于深层次的荧光信号，可以准确快速恢复该深层次的荧光信号所携带的深度和强度信息，从而达到准确定位荧光标记物位置和强度的效果，为药物开发，肿瘤治疗提供参考手段。文档编号G01N21/64GK101509871SQ200910061250公开日2009年8月19日申请日期2009年3月25日优先权日2009年3月25日发明者全国涛,勇邓,骆清铭,辉龚申请人:华中科技大学