专利名称：一种复合薄膜酶电极及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物传感器技术领域，特别涉及一种复合薄膜酶电极及其制备方法。
背景技术：
近年来电流型酶生物传感器弓丨起了广泛关注，取得了大量的研究成果并且部分已 实现了商品化，其在基础理论研究和应用研究方面都是一项十分重要的研究课题，其中，存 在的最主要问题是酶分子的有效固定和酶与电极之间的直接电子转移。当今酶分子的固定 通常采用物理或者化学方法。物理吸附主要是基于酶分子和换能器之间的相互作用比如范 德华力和静电作用。而基于有机物模板的静电层层自组装技术(LbL)通过相对简单的制备 过程实现了对膜层厚度、结构和组成的控制和调节，被广泛地用于制备功能性生物复合薄 膜。当基底不带电荷时，这种方法通常需要将基底浸入带有电荷的聚电解质的溶液中，对 表面进行预处理，从而可以通过静电力吸附进行组装。但是这种方法存在一个大的问题需 要解决聚电解质和基底之间的作用力比较弱并且稳定性比较差。在长时间的制备过程中 经常是不可控的。因此，为了提高预处理薄膜的稳定性，界面之间的共价键结合是十分必要 的。电接枝则是一种在固体基底上制备强吸附作用力聚合物薄膜的简单方法。通过单 体与导电性基底之间的电子转移从而共价连接在基底表面，因此电接枝可以为基底的下一 步修饰提高稳定性。单体通常包括可以可裂解的电活性分子，比如乙烯基单体，丙烯酸基单 体和重氮盐等。纳米材料的研究极大地推动了生物医学，生物传感器和生物催化的发展。具有生 物相容性的纳米材料可以为酶分子提供温和的微环境来保持其活性并且实现直接电化学 行为。尤其贵金属的纳米粒子，由于其具有极大的比表面积，良好的导电性和高的催化活 性，已经广泛应用于生物传感器领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合薄膜酶电极及其制备方法。一种复合薄膜酶电极，其特征在于，由基底电极、电接枝薄膜聚N-巯乙基丙烯酰 胺、带有负电荷的纳米金颗粒和带有正电荷的酶分子组成。所述酶分子为辣根过氧化物酶或细胞色素C。一种复合薄膜酶电极的制备方法，其特征在于，采用电接枝方法制备得到聚N-巯 乙基丙烯酰胺，然后共价连接带有负电荷的纳米金颗粒，最后固定带有正电的酶分子，该方 法步骤如下，(1)制备带有负电荷的纳米金颗粒的溶液将浓度为0. 15 0. 35mmol/L的柠檬 酸钠与浓度为0. 15 0. 35mmol/L的氯金酸溶液按照体积比(2 3) (3 2)混合， 搅 拌均勻，然后加入浓度为0. 05 0. 2mmol/L硼氢化钠水溶液，加入的硼氢化钠水溶液的体 积与柠檬酸钠体积比为0. 15 0. 6，搅拌5 10分钟之后溶液变成酒红色，静置2 5小时，得到带有负电荷的纳米金颗粒的溶液；(2)采用电接枝方法在基底电极上制备聚N-巯乙基丙烯酰胺薄膜清洗基底电极，配制含有N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺和四丁基胺四氟硼酸盐的二甲基甲酰胺溶液，通N2除 氧15 30分钟，将干净的基底电极置于含有N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺和四丁基胺四氟硼酸 盐的二甲基甲酰胺溶液中，在电势范围0和-2. 7V之间扫描2 6圈，然后将电接枝聚N-丙 烯酰氧琥珀酰亚胺之后的电极浸泡在1 20mmol/L巯基乙胺溶液中，浸泡时间为10 25 小时，通过氨基取代酯基使其变为聚N-巯乙基丙烯酰胺，从而在基底电极上制备了聚N-巯 乙基丙烯酰胺薄膜；(3)复合薄膜酶电极的制备将在基底电极上制备了聚N-巯乙基丙烯酰胺薄膜的 电极置于带有负电荷的纳米金颗粒的溶液中，浸泡2 12小时，金纳米颗粒通过与巯基作 用共价连接在电极表面，然后，将电极置于带有正电荷的酶分子溶液中，所述酶分子为辣根 过氧化物酶或细胞色素C，浸泡5 12小时，酶分子静电吸附在金颗粒表面，从而制备成复 合薄膜酶电极。所述基底电极为铟锡氧化物电极、玻碳电极或热解石墨电极。所述清洗基底电极中，玻碳电极或热解石墨电极清洗步骤为将基底玻碳电极或热 解石墨电极依次用直径为1. 0 μ m、0. 3 μ m的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，每次抛光后先 用去离子水洗去表面污物，再移入超声器中依次用乙醇和去离子水各超声清洗1 3min， 用N2将基底电极吹干；铟锡氧化物电极清洗步骤为依次用乙醇和去离子水各超声清洗5 1011^11，用N2将铟锡氧化物电极吹干。所述含有N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺和四丁基胺四氟硼酸盐的二甲基甲酰胺溶液 中，二甲基甲酰胺溶液中四丁基胺四氟硼酸盐浓度为0. 4 lmol/L，N-丙烯酰氧琥珀酰亚 胺浓度为0. 05 lmol/L。本发明的有益效果为本发明成功的采用电接枝方法在基底电极表面电接枝聚N-巯乙基丙烯酰胺共价 连接纳米金颗粒用以固定酶分子，采用电接枝方法对电极进行修饰，为下一步的修饰提供 了高稳定性的预处理膜，与纳米金颗粒的结合使固定的酶分子保持了很好的活性并具有优 良的催化性质，制备的复合薄膜，实现了酶分子的直接电化学行为，并且酶分子表现出很好 的电催化活性，这种复合薄膜酶电极具有很好的催化活性和较宽的线性范围。本发明工艺 简单，可有效地固定酶生物分子，对酶生物传感器的直接电化学性质及其应用的研究具有 重要的意义。
图1是实施例1的复合薄膜酶电极的制备过程示意图。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明实施例1一种复合薄膜酶电极，由玻碳电极、电接枝薄膜聚N-巯乙基丙烯酰胺、带有负电 荷的纳米金颗粒和带有正电荷的辣根过氧化物酶(HRP)组成。
一种复合薄膜酶电极的制备方法，采用电接枝方法制备得到聚N-巯乙基丙烯酰 胺，然后共价连接带有负电荷的纳米金颗粒，最后固定带有正电的辣根过氧化物酶，该方法 步骤如下，(1)制备带有负电荷的纳米金颗粒的溶液将浓度为0. 25mmol/L的柠檬酸钠与浓 度为0.25mmol/L氯金酸溶液按照体积比1 1混合，搅拌均勻，然后加入浓度为0. Immol/ L硼氢化钠水溶液，加入的硼氢化钠水溶液的体积与柠檬酸钠体积比为0. 3，搅拌5分钟之 后溶液变成酒红色，静置2 5小时，得到带有负电荷的纳米金颗粒的溶液；(2)采用电接枝方法在玻碳电极上制备聚N-巯乙基丙烯酰胺薄膜清洗玻碳电 极，清洗玻碳电极的步骤为，将玻碳电极依次用直径为1. 0 μ m、0. 3 μ m的Al2O3浆在麂皮 上抛光至镜面，每次抛光后先用去离子水洗去表面污物，再移入超声器中依次用乙醇和蒸 馏水各超声清洗2!^11，用队将玻碳电极吹干，配制含有0. lmol/L N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺 和0. 05mol/L四丁基胺四氟硼酸盐的二甲基甲酰胺溶液，在上述溶液中通N2除氧20分钟， 将干净的玻碳电极置于含有N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺和四丁基胺四氟硼酸盐的二甲基甲酰 胺溶液中，在电势范围0和-2. 7V之间扫描4圈，然后将电接枝聚N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺 (PNSA)之后的电极浸泡在lmmol/L巯基乙胺溶液中，浸泡时间为24h，通过氨基取代酯基使 其变为聚N-巯乙基丙烯酰胺，从而在玻碳电极上制备了聚N-巯乙基丙烯酰胺薄膜；(3)复合薄膜酶电极的制备将在玻碳电极上制备了聚N-巯乙基丙烯酰胺薄膜的 电极置于带有负电荷的纳米金颗粒的溶液中，浸泡12h，纳米金颗粒通过与巯基作用共价连 接在电极表面，然后，将电极置于带有正电荷的辣根过氧化物酶溶液(PH = 7)中，浸泡12h， 辣根过氧化物酶静电吸附在金颗粒表面，从而制备成复合薄膜酶电极。图1表示了本实施 例中复合薄膜酶电极的制备过程示意图。将本实施例中的有机/无机薄膜组装过程采用循环伏安(CV)和电化学阻抗谱 (EIS)来研究，其催化性质则通过上海辰华的电化学工作站CHI630B来研究。在电化学性质 测试过程中，我们采用三电极体系，其中钼电极为对电极，Ag/AgCl (饱和KCl)电极为参比 电极，组装的有机/无机复合薄膜酶电极作为工作电极。结果表明，辣根过氧化物酶表现出 很好的电催化活性，较低的米氏常数(0. 48mM)表明辣根过氧化物酶在修饰电极提供的微 环境里保持了很好的活性，在一定范围内对H2O2的响应具有明显的线性关系，而且性能稳定。实施例2—种复合薄膜酶电极，由玻碳电极、电接枝薄膜聚N-巯乙基丙烯酰胺、带有负电 荷的纳米金颗粒和带有正电荷的细胞色素C组成。一种复合薄膜酶电极的制备方法，采用电接枝方法制备得到聚N-巯乙基丙烯酰 胺，然后共价连接带有负电荷的纳米金颗粒，最后固定带有正电的细胞色素C，该方法步骤 如下，(1)制备带有负电荷的纳米金颗粒的溶液将浓度为0. 3mmol/L的柠檬酸钠与 浓度为0.3mmol/L的氯金酸溶液按照体积比1. 1 1混合，搅拌均勻，然后加入浓度为 0. 05mmol/L硼氢化钠水溶液，加入的硼氢化钠水溶液的体积与柠檬酸钠体积比为0. 6，搅 拌10分钟之后溶液变成酒红色，静置2 5小时，得到带有负电荷的纳米金颗粒的溶液；(2)采用电接枝方法在玻碳电极上制备聚N-巯乙基丙烯酰胺薄膜清洗玻碳电极，清洗玻碳电极的步骤为，将玻碳电极依次用直径为1. O μ m、0. 3 μ m的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，每次抛光后先用去离子水洗去表面污物，再移入超声器中依次用乙醇和去离 子水各超声清洗lmin，用N2将玻碳电极吹干，配制含有0. lmol/L N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺 和0. lmol/L四丁基胺四氟硼酸盐的二甲基甲酰胺溶液，在上述溶液中通N2除氧25分钟， 将干净的玻碳电极置于含有N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺和四丁基胺四氟硼酸盐的二甲基甲酰 胺溶液中，在电势范围0和-2. 7V之间扫描4圈，然后将电接枝聚N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺 (PNSA)之后的电极浸泡在lOmmol/L巯基乙胺溶液中，浸泡时间为15h，通过氨基取代酯基 使其变为聚N-巯乙基丙烯酰胺，从而在玻碳电极上制备了聚N-巯乙基丙烯酰胺薄膜；(3)复合薄膜酶电极的制备将在玻碳电极上制备了聚N-巯乙基丙烯酰胺薄膜的 电极置于带有负电荷的纳米金颗粒的溶液中，浸泡5h，金纳米颗粒通过与巯基作用共价连 接在电极表面，然后，将电极置于带有正电荷的细胞色素C溶液(pH = 7)中，浸泡10h，细胞 色素C静电吸附在金颗粒表面，从而制备成复合薄膜酶电极。结果表明，细胞色素C表现出很好的电催化活性，其在修饰电极提供的微环境里 保持了很好的活性，在一定范围内对H2O2的响应具有明显的线性关系，而且性能稳定。实施例3一种复合薄膜酶电极，由铟锡氧化物电极、电接枝薄膜聚N-巯乙基丙烯酰胺、带 有负电荷的纳米金颗粒和带有正电荷的细胞色素C组成。一种复合薄膜酶电极的制备方法，采用电接枝方法制备得到聚N-巯乙基丙烯酰 胺，然后共价连接带有负电荷的纳米金颗粒，最后固定带有正电的细胞色素C，该方法步骤 如下，(1)制备带有负电荷的纳米金颗粒的溶液将浓度为0. 21mmol/L的柠檬酸钠 与浓度为0.21mmol/L氯金酸溶液按照体积比1 1. 1混合，搅拌均勻，然后加入浓度为 0. lmmol/L硼氢化钠水溶液，加入的硼氢化钠水溶液的体积与柠檬酸钠体积比为0. 3，搅拌 8分钟之后溶液变成酒红色，静置2 5小时，得到带有负电荷的纳米金颗粒的溶液；(2)采用电接枝方法在铟锡氧化物电极上制备聚N-巯乙基丙烯酰胺薄膜清洗铟 锡氧化物电极，清洗铟锡氧化物电极的步骤为，将铟锡氧化物电极依次用乙醇和去离子水 各超声清洗5min，用N2将铟锡氧化物电极吹干，配制含有0. 2mol/LN-丙烯酰氧琥珀酰亚胺 和0. lmol/L四丁基胺四氟硼酸盐的二甲基甲酰胺溶液，在上述溶液中通N2除氧25分钟， 将干净的铟锡氧化物电极置于含有N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺和四丁基胺四氟硼酸盐的二甲 基甲酰胺溶液中，在电势范围0和-2. 7V之间扫描4圈，然后将电接枝聚N-丙烯酰氧琥珀 酰亚胺(PNSA)之后的电极浸泡在lmmol/L巯基乙胺溶液中，浸泡时间为20h，通过氨基取代 酯基使其变为聚N-巯乙基丙烯酰胺，从而在铟锡氧化物电极上制备了聚N-巯乙基丙烯酰 胺薄膜；(3)复合薄膜酶电极的制备将在铟锡氧化物电极上制备了聚N-巯乙基丙烯酰胺 薄膜的电极置于带有负电荷的纳米金颗粒的溶液中，浸泡8h，纳米金颗粒通过与巯基作用 共价连接在电极表面，然后，将电极置于带有正电荷的细胞色素C溶液(pH = 7)中，浸泡 12h，细胞色素C静电吸附在金颗粒表面，从而制备成复合薄膜酶电极。结果表明，辣根过氧化物酶表现出很好的电催化活性，在一定范围内对H2O2的响 应具有明显的线性关系，而且性能稳定。
实施例4一种复合薄膜酶电极，由铟锡氧化物电极、电接枝薄膜聚N-巯乙基丙烯酰胺、带 有负电荷的纳米金颗粒和辣根过氧化物酶组成。一种复合薄膜酶电极的制备方法，采用电接枝方法制备得到聚N-巯乙基丙烯酰 胺，然后共价连接带有负电荷的纳米金颗粒，最后固定辣根过氧化物酶，该方法步骤如下，(1)制备带有负电荷的纳米金颗粒的溶液将浓度为0. 2mmol/L的柠檬酸钠与浓 度为0.2mmol/L氯金酸溶液按照体积比1 1混合，搅拌均勻，然后加入浓度为0. lmmol/L 硼氢化钠水溶液，加入的硼氢化钠水溶液的体积与柠檬酸钠体积比为0. 3，搅拌6分钟之后 溶液变成酒红色，静置2 5小时，得到带有负电荷的纳米金颗粒的溶液；(2)采用电接枝方法在铟锡氧化物电极上制备聚N-巯乙基丙烯酰胺薄膜清洗铟 锡氧化物电极，清洗铟锡氧化物电极的步骤为，将铟锡氧化物电极依次用乙醇和去离子水 各超声清洗lOmin，用N2将铟锡氧化物电极吹干，配制含有0. 05mol/LN-丙烯酰氧琥珀酰亚 胺和0. 5mol/L四丁基胺四氟硼酸盐的二甲基甲酰胺溶液，在上述溶液中通队除氧30分钟， 将干净的铟锡氧化物电极置于含有N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺和四丁基胺四氟硼酸盐的二甲 基甲酰胺溶液中，在电势范围0和-2. 7V之间扫描6圈，然后将电接枝聚N-丙烯酰氧琥珀 酰亚胺PNSA之后的电极浸泡在lmmol/L巯基乙胺溶液中，浸泡时间为24h，通过氨基取代酯 基使其变为聚N-巯乙基丙烯酰胺，从而在铟锡氧化物电极上制备了聚N-巯乙基丙烯酰胺 薄膜；(3)复合薄膜酶电极的制备将在铟锡氧化物电极上制备了聚N-巯乙基丙烯酰胺 薄膜的电极置于带有负电荷的纳米金颗粒的溶液中，浸泡lih，纳米金颗粒通过与巯基作用 共价连接在电极表面，然后，将电极置于带有正电荷的辣根过氧化物酶溶液(PH = 7)中，浸 泡13h，辣根过氧化物酶静电吸附在金颗粒表面，从而制备成复合薄膜酶电极。结果表明，辣根过氧化物酶表现出很好的电 催化活性，其在修饰电极提供的微环 境里保持了很好的活性，在一定范围内对H2O2的响应具有明显的线性关系，而且性能稳定。
权利要求
一种复合薄膜酶电极，其特征在于，由基底电极、电接枝薄膜聚N-巯乙基丙烯酰胺、带有负电荷的纳米金颗粒和带有正电荷的酶分子组成。
2.根据权利要求1所述的一种复合薄膜酶电极，其特征在于，所述酶分子为辣根过氧 化物酶或细胞色素C。
3.一种复合薄膜酶电极的制备方法，其特征在于，采用电接枝方法制备得到聚N-巯乙 基丙烯酰胺，然后共价连接带有负电荷的纳米金颗粒，最后固定带有正电的酶分子，该方法 步骤如下，(1)制备带有负电荷的纳米金颗粒的溶液将浓度为0.15 0. 35mmol/L的柠檬酸钠 与浓度为0. 15 0.35mmol/L的氯金酸溶液按照体积比(2 3) (3 2)混合，搅拌均 勻，然后加入浓度为0. 05 0. 2mmol/L硼氢化钠水溶液，加入的硼氢化钠水溶液的体积与 柠檬酸钠体积比为0. 15 0. 6，搅拌5 10分钟之后溶液变成酒红色，静置2 5小时，得 到带有负电荷的纳米金颗粒的溶液；(2)采用电接枝方法在基底电极上制备聚N-巯乙基丙烯酰胺薄膜清洗基底电极， 配制含有N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺和四丁基胺四氟硼酸盐的二甲基甲酰胺溶液，通N2除氧 15 30分钟，将干净的基底电极置于含有N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺和四丁基胺四氟硼酸盐 的二甲基甲酰胺溶液中，在电势范围0和-2. 7V之间扫描2 6圈，然后将电接枝聚N-丙 烯酰氧琥珀酰亚胺之后的电极浸泡在1 20mmol/L巯基乙胺溶液中，浸泡时间为10 25 小时，通过氨基取代酯基使其变为聚N-巯乙基丙烯酰胺，从而在基底电极上制备了聚N-巯 乙基丙烯酰胺薄膜；(3)复合薄膜酶电极的制备将在基底电极上制备了聚N-巯乙基丙烯酰胺薄膜的电极 置于带有负电荷的纳米金颗粒的溶液中，浸泡2 12小时，金纳米颗粒通过与巯基作用共 价连接在电极表面，然后，将电极置于带有正电荷的酶分子溶液中，所述酶分子为辣根过氧 化物酶或细胞色素C，浸泡5 12小时，酶分子静电吸附在金颗粒表面，从而制备成复合薄 膜酶电极。
4.根据权利要求3所述的一种复合薄膜酶电极的制备方法，其特征在于，所述基底电 极为铟锡氧化物电极、玻碳电极或热解石墨电极。
5.根据权利要求3所述的一种复合薄膜酶电极的制备方法，其特征在于，所述清洗基 底电极中，玻碳电极或热解石墨电极清洗步骤为将基底玻碳电极或热解石墨电极依次用直 径为1. 0 μ m、0. 3 μ m的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面，每次抛光后先用去离子水洗去表面污 物，再移入超声器中依次用乙醇和去离子水各超声清洗1 3min，用N2将基底电极吹干；铟 锡氧化物电极清洗步骤为依次用乙醇和去离子水各超声清洗5 10!^11，用N2将铟锡氧化 物电极吹干。
6.根据权利要求3所述的一种复合薄膜酶电极的制备方法，其特征在于，所述含有 N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺和四丁基胺四氟硼酸盐的二甲基甲酰胺溶液中，二甲基甲酰胺溶液 中四丁基胺四氟硼酸盐浓度为0. 4 lmol/L，N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺浓度为0. 05 lmol/ L0
全文摘要
本发明公开了属于生物传感器技术领域的一种复合薄膜酶电极及其制备方法。一种复合薄膜酶电极，由基底电极、电接枝薄膜聚N-巯乙基丙烯酰胺、带有负电荷的纳米金颗粒和带有正电荷的酶分子组成。所述酶分子为辣根过氧化物酶或细胞色素C。制备方法为采用电接枝方法制备得到聚N-巯乙基丙烯酰胺，然后共价连接带有负电荷的纳米金颗粒，最后固定带有正电的酶分子。本发明制备的复合薄膜，实现了酶分子的直接电化学行为，并且酶分子表现出很好的电催化活性，这种复合薄膜酶电极具有很好的催化活性和较宽的线性范围。本发明工艺简单，可有效地固定酶生物分子，对酶生物传感器的直接电化学性质及其应用的研究具有重要的意义。
文档编号G01N27/327GK101839883SQ20091008030
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月18日 优先权日2009年3月18日
发明者李利淼, 李景虹, 高艳芳 申请人:清华大学