专利名称：：一种鉴别人血白蛋白药品真伪的方法
技术领域：
：本发明涉及一种鉴别人血白蛋白药品真伪的方法。
背景技术：
：人血白蛋白是血液制品的一种，俗称"生命制品"、"救命药"。人血白蛋白是从健康人的血液中提炼加工而成，可以直接静脉注射到病人体内，主要功能是增强人的免疫力和抵抗力，增加循环血容量和维持血浆渗透压，是治疗因失血、创伤、烧伤、整形外科手术及脑损伤、防治低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等恶性病变不可缺少的药物。市售的人血白蛋白包括液体制剂和冻干制剂两种剂型，液体制剂的规格一般按蛋白浓度(g/ml)分为5%、10%、20%、25%四种，冻干制剂一般分为每瓶含蛋白质2g、5g、10g、12.5g四种。2006年卫生部制定了《单采血浆站质量管理规范》，开始对全国范围内的单采血浆站进行转制改造，其中一些不符合规范的血站被关闭，加之近年来供浆者人数的减少，都导致了全国采浆量直线下降。在这种原料紧缺、价格上涨的情况下，很多生产厂家不再生产人血白蛋白，直接导致市场上人血白蛋白价格居高不下。目前，人血白蛋白在全国都比较紧俏，北京、上海、广州等地这种供需矛盾尤为突出。人血白蛋白供不应求的局面和高附加值的特点刺激造假者铤而走险。人血白蛋白市场价300到400元一瓶。假冒的人血白蛋白成本仅10元左右，其蛋白质含量几乎为零。更在某些样品中发现添加有"聚山梨酯80"的成分。添加有"聚山梨酯80"的假冒产品为黄色液体，外观上与人血白蛋白类似，但使用后会产生溶血现象，使病人出现一系列贫血症状，甚至导致患者死亡。危重病号使用无效的药剂，轻则耽误治疗的时机，重则引发其他症状，威胁患者生命！假冒人血白蛋白的泛滥，使"救命药"变成了"夺命药"，极大的危害了人民群众的生命安全。为了广大人民的利益，需要快速有效的方法来鉴别市面上人血白蛋白的真伪。国内人血白蛋白的检验主要依据《中国药典》2005年版三部，检验项目包括外观、免疫双扩散、免疫电泳、纯度、多聚体含量、pH值、辛酸钠含量、4热稳定性、装量、蛋白含量测定等，其中可用于进行人血白蛋白真伪鉴别的检验项目有免疫双扩散、免疫电泳、纯度、蛋白含量测定。目前国际通用的假冒人血白蛋白的检验仍为实验室常规检验手段，需要专业人员和设备，耗时23天完成，耗时耗力；另一方面，常规检验手段需要的样品量比较大，在人血白蛋白几乎"零库存"的形势下，容易出现监督检验无样品可供抽取的现象，从而容易出现药品监督的盲点。人血白蛋白是人血浆的混合成分，又难以采用常规化学手段进行准确定性。因此，迫切需要样品需要量少、检测速度快、专属性强的高效检测方法。国内进行人血白蛋白快速现场检测方法利用白蛋白的物理性质采用了钨酸钠沉淀法(肖林，沈琦，快速鉴别人血白蛋白方法的建立与评价，中国药事，2007.27(8)，589-603)，但该方法灵敏度低，且不具有专属性，易受干扰，出现假阴性结果的几率较高。
发明内容本发明的一个目的是提供一种鉴别人血白蛋白药品真伪的方法。本发明所提供的鉴别人血白蛋白药品真伪的方法，是采用免疫胶体金技术对待测人血白蛋白药品的稀释液进行检测，根据显色结果判断所述待测人血白蛋白药品的真伪。上述过程中，所述用免疫胶体金技术对待测人血白蛋白药品的稀释液进行检测的方法具体可为用胶体金测试卡对所述待测人血白蛋白药品的稀释液进行检测；所述胶体金测试卡由浸入测试液区、抗体包被区、检测区和手持区顺次连接而成；所述抗体包被区固定有胶体金标记的人血白蛋白单克隆抗体；所述检测区由依次平行排列的检测线l、检测线2、检测线3和质控线构成，所述依次平行排列的方向为从所述抗体包被区至所述手持区的方向；所述检测线l、检测线2和检测线3位置分别固定了人血白蛋白；所述质控线位置固定了抗抗体；所述根据显色结果判断所述待测人血白蛋白药品的真伪的方法具体为下述l)、2)或3):1)若所述胶体金测试卡上仅质控线位置出现显色条带，或者在质控线位置和检测线l位置同时出现显色条带，则所述待测人血白蛋白药品为真品；2)若所述胶体金测试卡上质控线位置、检测线1位置和检测线2位置同时出现显色条带，则所述待测人血白蛋白药品为伪劣产品；3)若所述胶体金测试卡上质控线位置、检测线1位置、检测线2位置和检测线3位置同时出现显色条带，则所述待测人血白蛋白药品为伪劣产品；5所述人血白蛋白药品的稀释液中人血白蛋白的理论浓度为100mg/L;所述人血白蛋白药品为标注人血白蛋白浓度的人血白蛋白药品或为标注人血白蛋白质量的人血白蛋白药品；所述人血白蛋白药品的稀释液是按照如下l)或2)所述方法得到的1)将所述标注人血白蛋白浓度的人血白蛋白药品直接进行稀释，得到所述人血白蛋白药品的稀释液；其中，所述理论浓度是将所述标注人血白蛋白浓度乘以稀释倍数得到的浓度；2)将所述标注人血白蛋白质量的人血白蛋白药品溶解得到溶解液，再对溶解液进行稀释，得到所述人血白蛋白药品的稀释液；其中，所述理论浓度是将所述溶解液的浓度乘以稀释倍数得到的浓度。上述过程中，所述稀释是用水、生理盐水、注射用水或pH值为68的磷酸盐缓冲液进行的。上述过程中，所述人血白蛋白药品为人血白蛋白液体制剂、冻干人血白蛋白制剂或含有人血白蛋白添加剂的其它制剂。上述过程中，所述胶体金测试卡具体可以是由北京怡成生物电子技术有限公司生产的尿微量白蛋白半定量测试卡，产品型号为mALB-l。上述过程中，所述含有人血白蛋白添加剂的其它制剂可为人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)等。所述人血白蛋白液体制剂的规格为白蛋白浓度(g/ml)为5%、10%、20%或25%。所述冻干人血白蛋白制剂的规格为每瓶含白蛋白2g、5g、10g或12.5g。所述人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)的规格为L0ml/瓶，效价不低于2.5IU。本发明的鉴别方法具有样品前处理简单、检测速度快、检测时需要样品量极少(每次测定仅需约20微升样品原液即可，使用患者使用后容器中残存的药液也可测定)的特点，不需要任何辅助仪器，检测时间连同样品制备时间仅需510分钟，并且能够进行半定量测定；另外，实验证明，本发明方法的灵敏度高、准确度好、可重复性强、特异性高，不受其它血液制品的影响，也不受其它种属白蛋白的影响，检测结果可靠。与其它人血白蛋白快检方法比较，本发明采用胶体金标记的抗体呈现鲜红色，在白色背景下，条带清晰，目视即可观察，极易判读；操作简便仅需要将测试卡插入稀释的样本中进行测定，不需要专业技术人员，甚至使用人血白蛋白的患者也可以自行进行测定，避免使用假药。本发明方法适合人血白蛋白假冒伪劣产品的快速现场检测的要求。图l为测试卡的结构示意图。图2为测试卡的测试结果判断示意图。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中使用的测试卡为北京怡成生物电子技术有限公司生产的"尿微量白蛋白半定量测试卡"，产品型号为mALB-l，生产日期20080417。实施例l、鉴别人血白蛋白药品真伪的方法一、测试卡的结构(图1):所述测试卡由浸入测试液区、抗体包被区、检测区和手持区顺次连接而成；所述抗体包被区固定有胶体金标记的人血白蛋白单克隆抗体；所述检测区由依次排列的检测线l、检测线2、检测线3和质控线构成，所述依次排列的方向为从所述抗体包被区至所述手持区的方向；所述检测线1、检测线2和检测线3位置分别固定了人血白蛋白；所述质控线位置固定了羊抗鼠IgG抗抗体；所述浸入测试液区中部设一标记有"MAX"的线，记作"MAX线"；所述检测线1、检测线2、检测线3和质控线与MAX线平行。二、检测原理方法基于胶体金免疫层析技术。原理是以胶体金为显色标记物，将测试卡浸入测试液后，测试液由于毛细管作用，沿膜向前移动，测试液中若含有人血白蛋白，到达金标抗体区域后，与金标抗体结合，形成金标抗原抗体复合物；溶液再继续上行，到达检测区后，如果测试液中白蛋白含量足够高，使抗体没有空余位点与固定于检测线的白蛋白抗原结合，则检测线不显色；如果测试液中白蛋白含量不足或不含有白蛋白，金标抗体可以与固定于检测线的白蛋白抗原结合，则检测线显色；测试中，金标抗体或金标抗原抗体复合物必须到达质控线位置，并且质控线处包埋的二抗与抗体发生免疫作用，使质控线呈现出红色条带，否则试验不成立，需重新测定。测试液中白蛋白含量的不同可以用未结合金标抗体结合位点的数量来反映，同样测试区出现的条带数目也反映了测试液中的白蛋白含量。从而，根据免疫层析膜上出现的条带数目，进行样品中人血白蛋白含量的半定量测定。7三、检测步骤1、样品前处理1)液体制剂样品的前处理不同规格的制剂按下述方法稀释，得到稀释液，稀释液即为待测样品溶液。下述中的理论浓度即为按照药品标注的浓度及稀释的倍数换算后得到的浓度。5%(即5g/100ml)规格液体药品取40微升，加水稀释至20ml，摇匀，得到稀释液；稀释液中人血白蛋白的理论浓度为100mg/L;10%(即10g/100ral)规格液体药品取20微升，加水稀释至20ml，摇匀，得到稀释液；稀释液中人血白蛋白的理论浓度为100mg/L;20°/。(即20g/100ml)规格液体药品取10微升，加水稀释至20ml，摇匀，得到稀释液；稀释液中人血白蛋白的理论浓度为100mg/L;25%(即25g/100ml)规格液体药品取8微升，加水稀释至20ml;摇匀，得到稀释液。稀释液中人血白蛋白的理论浓度为100mg/L;2)冻干制剂样品的前处理.-冻干制剂的溶解方法如下取冻干制剂(每瓶含白蛋白2g、5g、10g或12.5g)，按照说明书要求溶解，得到理论浓度分别为5%(即5g/100ml)、10%(即10g/100ml)、20%(即20g/100ml)或25%(即25g/100ml)的人血白蛋白溶液。此处所说的理论浓度是指按照药品标注的人血白蛋白质量与溶解时加入的溶剂体积换算后得到的浓度。对不同浓度的人血白蛋白溶液按照1)中所述方法进行稀释。得到待测样品溶液。其中，1)和2)中所用的稀释剂水还可以替换为生理盐水或pH68的磷酸盐缓冲液，效果是一样的。2、检测过程将测试卡有"MAX"标志的一端插入待测样品溶液中(深度不超过"MAX"标志)，待样品溶液扩展至测试卡顶端，取出观察。3、检测结果判定下述检测结果中，"阴性"指含有人血白蛋白且人血白蛋白浓度合格的真品；"阳性"指假冒伪劣产品。1)阴性结果如果仅在质控线位置显现了红色线(图2D)，或者在质控线位置和检测线l位置同时显现了红色线(图2C)，则表明所测样品溶液中人血白蛋白浓度为100mg/L以上(图2D)或50-100mg/L(图2C)，考虑到样品稀释过程中存在的误差，结果均判定为阴性，表明，所测人血白蛋白药品(人血白蛋白液体制剂或冻干制剂)中含有人血白蛋白，且所测人血白蛋白药品中人血白蛋白的实际浓度或人血白蛋白的实际质量与所测人血白蛋白药品中标注的人血白蛋白浓度或人血白蛋白质量相符，药品为真品。2)阳性结果如果在质控线位置显现了红色线，同时在测试区检测线1和检测线2位置均显现出红色线(图2B)，则判定为阳性，所测样品溶液中含有人血白蛋白，人血白蛋白浓度为20-50mg/L(图2B)，表明，所测人血白蛋白药品(人血白蛋白液体制剂或冻干制剂)中含有人血白蛋白，但是所测人血白蛋白药品中人血白蛋白的实际浓度或人血白蛋白的实际质量低于所测人血白蛋白药品中标注的人血白蛋白浓度或人血白蛋白质量，药品为假冒伪劣产品。3)阳性结果如果在质控线位置显现了红色线，同时测试区的3条检测线均显现出红色线(图2A)，则结果判定为阳性，所测样品溶液中无人血白蛋白或人血白蛋白浓度很低(<20mg/L)(图2A)，表明，所测人血白蛋白药品(人血白蛋白液体制剂或冻干制剂)中无人血白蛋白或药品中人血白蛋白的实际浓度或人血白蛋白的实际质量远低于药品中标注的人血白蛋白浓度或人血白蛋白的实际质量，药品为假冒伪劣产品。4)结果不成立如果在质控线位置没有显现红色线(图2E)，则无论测试区是否显现红色线，均判断为结果不成立，需要重新测定。实施例2、本发明检测方法的准确度检测对45批市售人血白蛋白液体制剂和5批假冒人血白蛋白液体制剂按照实施例1中所述方法以及《中国药典》2005年版三部收载的方法进行检测。实验设3次重复，两种方法检测结果一致。5批假冒人血白蛋白全部检出，阳性检9出率100%。说明本发明方法适用于目前市售人血白蛋白药品中白蛋白的检测。表格1本方法准确度考察结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例3、本发明检测方法的特异性检测一、种属特异性检测按照实施例l中所述方法，分别对猪、马、牛、羊血清(抗血浆鉴别试剂盒，中国药品生物制品检定所生产，批号20060216)进行检测。实验设3次重复，结果均呈阳性。说明本发明方法具有种属特异性，其它种属动物血清对人血白蛋白条的检测不存在干扰。表格2本方法种属特异性考察结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>二、人血其它蛋白特异性检测按照实施例1中所述方法，检测如下市售的血液制品中的蛋白量静注人免疫球蛋白(pH4.0)、冻干人免疫球蛋白、人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白。实验设3次重复，结果均呈阳性。说明本发明方法特异性强，能够有效避免其它血液制品的干扰。表格3本发明方法的特异性检测结果编<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例4、本发明方法的重复性检测按照实施例1中所述方法，分别对人血白蛋白真品和假品进行5次重复测定，结果一致。说明本发明方法具有较好的重现性。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>权利要求1、一种鉴别人血白蛋白药品真伪的方法，是采用免疫胶体金技术对待测人血白蛋白药品的稀释液进行检测，根据显色结果判断所述待测人血白蛋白药品的真伪。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述用免疫胶体金技术对待测人血白蛋白药品的稀释液进行检测的方法为用胶体金测试卡对所述待测人血白蛋白药品的稀释液进行检测；所述胶体金测试卡由浸入测试液区、抗体包被区、检测区和手持区顺次连接而成；所述抗体包被区固定有胶体金标记的人血白蛋白单克隆抗体；所述检测区由依次平行排列的检测线l、检测线2、检测线3和质控线构成，所述依次平行排列的方向为从所述抗体包被区至所述手持区的方向；所述检测线l、检测线2和检测线3位置分别固定了人血白蛋白；所述质控线位置固定了抗抗体；所述根据显色结果判断所述待测人血白蛋白药品的真伪的方法为下述l)、2)或3):1)若所述胶体金测试卡上仅质控线位置出现显色条带，或者在质控线位置和检测线1位置同时出现显色条带，则所述待测人血白蛋白药品为真品；2)若所述胶体金测试卡上质控线位置、检测线l位置和检测线2位置同时出现显色条带，则所述待测人血白蛋白药品为伪劣产品；3)若所述胶体金测试卡上质控线位置、检测线1位置、检测线2位置和检测线3位置同时出现显色条带，则所述待测人血白蛋白药品为伪劣产品；所述人血白蛋白药品的稀释液中人血白蛋白的理论浓度为100mg/L;所述人血白蛋白药品为标注人血白蛋白浓度的人血白蛋白药品或为标注人血白蛋白质量的人血白蛋白药品；所述人血白蛋白药品的稀释液是按照如下1)或2)所述方法得到的1)将所述标注人血白蛋白浓度的人血白蛋白药品直接进行稀释，得到所述人血白蛋白药品的稀释液；其中，所述理论浓度是将所述标注人血白蛋白浓度乘以稀释倍数得到的浓度；2)将所述标注人血白蛋白质量的人血白蛋白药品溶解得到溶解液，再对溶解液进行稀释，得到所述人血白蛋白药品的稀释液；其中，所述理论浓度是将所述溶解液的浓度乘以稀释倍数得到的浓度。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述稀释是用水、生理盐水、注射用水或pH值为68的磷酸盐缓冲液进行的。4、根据权利要求l、2或3所述的方法，其特征在于所述人血白蛋白药品为人血白蛋白液体制剂、冻干人血白蛋白制剂或含有人血白蛋白添加剂的其它制剂。5、根据权利要求2、3或4所述的方法，其特征在于所述胶体金测试卡是由北京怡成生物电子技术有限公司生产的尿微量白蛋白半定量测试卡，产品型号为mALB-l。全文摘要本发明公开了一种鉴别人血白蛋白药品真伪的方法。该方法是采用免疫胶体金技术对待测人血白蛋白药品的稀释液进行检测，根据显色结果判断所述待测人血白蛋白药品的真伪。本发明的鉴别方法具有样品前处理简单、检测速度快、检测时需要样品量极少的特点，每次测定仅需约20微升样品原液即可，使用患者使用后容器中残存的药液也可测定，不需要任何辅助仪器，检测时间连同样品制备时间仅需5～10分钟，并且能够进行半定量测定。文档编号G01N33/68GK101666803SQ20091009302公开日2010年3月10日申请日期2009年9月17日优先权日2009年9月17日发明者立余,刘秋和,静姚,山广志,彤张,颖方,王志斌,宏纪,明赵,郭洪祝申请人:北京市药品检验所