专利名称：一种测定蜂胶中β-葡萄糖苷酶活性的方法
技术领域：
本发明属蜂胶中有效成分测定，涉及一种测定蜂胶中p-葡萄糖苷酶活性的方法。
背景技术：
蜂胶是蜜蜂从植物幼芽、树皮与树干裂缝上采集树脂，并混入其上颚腺分 泌物和蜂蜡等加工而成的具有芳香气味的胶状固体物。蜂胶的化学成分复杂， 含有黄酮类化合物、酸、醇、酚、醛、酯、醚类以及烯、萜、甾类化合物和多 种氨基酸、脂肪酸、酶类、维生素和多种微量元素。在这些化学成分中，由于 黄酮类化合物含量高，生物学活性强，因此有关蜂胶中黄酮类化合物提取和功 效的研究成为热点。
黄酮类化合物在自然界中多数以黄酮苷的形式存在，只有极少量的以游离 黄酮苷元的形式存在。虽然天然存在的游离黄酮苷元含量极少，但其表现出来 的活性要比结合型的糖苷高很多。而蜂胶中的已分离鉴定出的黄酮类化合物大 都以游离黄酮苷元形式存在，多数人认为是蜜蜂在采集蜂胶的过程中加入了自 身分泌物，使黄酮苷水解成黄酮苷元。黄酮苷元可以直接被吸收进入动物血液， 大部分糖苷型的黄酮化合物在人体内不能通过小肠壁进入到血液中，而是被肠 腔内微生物通过杂环裂解方式降解和代谢，其中仅有小部分黄酮苷在结肠内益 生菌(乳酸菌和双歧杆菌)分泌的水解酶的作用下，产生苷元再重新吸收进入血 液。因此，黄酮苷在动物体内的生物利用率远远低于苷元型黄酮。研究表明， 黄酮苷元清除人体氧自由基的生物活性明显优于黄酮糖苷，黄酮苷元的效价是
黄酮糖苷效价的7倍。
天然存在的黄酮苷基本上都是卩-D-葡萄糖苷，因此，蜜蜂很可能在采集蜂 胶的过程中加入了 P-D-葡萄糖苷酶。目前，还没有蜂胶中P-D-葡萄糖苷酶研究 的相关报道，为了证实该酶的存在，必须建立蜂胶中(3-D-葡萄糖苷酶提取鉴定 的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定蜂胶中P-D-葡萄糖苷酶活性的方法，本发明 采用分光光度法对蜂胶中P-D-葡萄糖苷活性进行测定。通过对蜂胶中该酶提取
3条件及影响该酶活力参数的考察，确定测定蜂胶中该酶活性的基本条件。其原 理为卩-D-葡萄糖苷酶催化对硝基苯-P-D-葡萄糖苷水解反应，生成物对硝基苯
酚在400 420 nm可见光范围内有特征吸收峰，可通过测定一定时间内(3-D-葡萄糖苷酶将一定量的底物水解成对硝基苯酚的量的多少来确定酶活性的强 弱。
本发明通过以下步骤实现
(1) 粗酶提取将蜂胶样本冷冻，然后将蜂胶捣碎，过30目筛，取3.0g 蜂胶粉末加入pH值4.5 6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，然后加入0.3 0.9 g 不溶性聚乙烯毗咯垸酮(PVPP)及少许石英砂，在冰浴上研磨成糊状，低温 高速离心，上清液转移到另一只离心管中，二次低温高速离心，取上清液定容 至25mL即为粗酶提取液；
(2) 酶促反应取两只试管，分别加入0.5mL粗酶液，0.5mL底物浓度 5 40 mmol/L的对硝基苯酚p-D-葡萄糖苷，其中一只试管在30 60'C下温育 1.5 h，反应中始终保持溶液均匀，温育完毕加入2.5mLlMNa2C03终止反应， 另一只为空白对照，其反应混合液立即在100。C水浴中加热5 min使酶灭活， 然后加入1 MNa2C03终止反应；
(3) 活性测定用分光光度计在400nm处测定对硝基苯酚的吸光度，从 而确定该酶的活性。
卩-D-葡萄糖苷酶活力单位每分钟催化形成一个微摩尔对硝基苯酚所需要 的酶量为一个酶活力单位。蜂胶中(3-D-葡萄糖苷酶活力为每克蜂胶具有的酶活 力单位(unit/g)。计算公式如下
卩-0-葡萄糖苷酶活力=#><" 「
式中A为对硝基苯酚的摩尔量(Kimol/L) V为酶液量(mL) n为酶液稀释倍数 t为反应时间(min)
本发明方法通过对蜂胶中该酶提取条件及影响该酶活力参数的考察，确定 测定蜂胶中该酶活性的基本条件。该方法的建立，首次证实蜂胶中确定含有 卩-D-葡萄糖苷酶，这说明蜜蜂确实在采胶的过程中加入了该酶，使蜂胶的药理 活性得以加强。同时，通过测定P-D-葡萄糖苷酶活力的方法，可以从成分及药 理活性的角度区分蜂胶与其胶源植物的差别。因此，可以在原料蜂胶的层面上区分真假蜂胶，为蜂胶质量标准化提供依据。本发明的方法具有简便，灵敏度 高，检测成本低等优点，由于蜂胶中酶的相关研究还未见报道，因此，该方法 在蜂胶中卩-D-葡萄糖苷酶的提取及活力测定上具有创新性。
具体实施例方式
本发明结合实施例作进一步的说明。
实施例1
取不同产地(平湖、绍兴、江山)蜂胶各3.0g，溶于25 mL pH 6.0磷酸 氢二钠-柠檬酸缓冲液中，加入0.9gPVPP，少许石英砂，在冰浴上研磨至糊状， 10000g4 。C离心15min，上清液转移到另一只离心管中，14000 g 4 。C离心30 min取上清液定容至25mL。取两只试管，分别加入0.5 mL粗酶液，0.5 mL 25 mmol/L底物浓度的对硝基苯酚(3-D-葡萄糖苷，其中一只试管在37"C设定的条 件下温育1.5h，反应中始终保持溶液均匀，温育完毕加入2.5mLlMNa2C03 终止反应。另一只为空白对照，其反应混合液立即在10(TC水浴中加热5 min 使酶灭活，然后加入lMNa2C03终止反应。用分光光度计在400nm处测定对 硝基苯酚的吸光度，从而确定该酶的活性。
测定结果平湖蜂胶吸光度为0.172，计算所得(3-D-葡萄糖苷酶活力为 0.0420 unit/g;绍兴蜂胶吸光度为0.160，计算所得(3-D-葡萄糖苷酶活力为0.0391 unit/g;江山蜂胶吸光度为0.184，计算所得卩-D-葡萄糖苷酶活力为0.0449 unit/g。
实施例2
取不同产地(平湖、绍兴、江山)蜂胶各3.0g，溶于25 mL pH 6.0磷酸 氢二钠-柠檬酸缓冲液中，加入0.6gPVPP，少许石英砂，在冰浴上研磨至糊状， 10000g4。C离心15min，上清液转移到另一只离心管中，14000 g 4 。C离心30 min取上清液定容至25mL。取两只试管，分别加入0.5 mL粗酶液，0.5mL30 mmol/L底物浓度的对硝基苯酚P-D-葡萄糖苷，其中一只试管在57。C设定的条 件下温育1.5 h，反应中始终保持溶液均匀，温育完毕加入2.5 mL 1 M Na2C03 终止反应。另一只为空白对照，其反应混合液立即在IO(TC水浴中加热5 min 使酶灭活，然后加入lMNa2C03终止反应。用分光光度计在400nm处测定对 硝基苯酚的吸光度，从而确定该酶的活性。
测定结果平湖蜂胶吸光度为0.405，计算所得P-D-葡萄糖苷酶活力为0.0980 unit/g;绍兴蜂胶吸光度为0.330，计算所得(3-D-葡萄糖苷酶活力为 0.0800 unit/g;江山蜂胶吸光度为0.456，计算所得(3-D-葡萄糖苷酶活力为0.110 unit/g。
实施例3
取不同产地(平湖、绍兴、江山)蜂胶各3.0g，溶于25 mL pH 5.0磷酸 氢二钠-拧檬酸缓冲液中，加入0.6gPVPP，少许石英砂，在冰浴上研磨至糊状， 10000g4 。C离心15min,上清液转移到另一只离心管中，14000 g 4 。C离心30 min取上清液定容至25mL。取两只试管，分别加入0.5 mL粗酶液，0.5mL10 mmol/L底物浓度的对硝基苯酚(3-D-葡萄糖苷，其中一只试管在37"C设定的条 件下温育1.5 h，反应中始终保持溶液均匀，温育完毕加入2.5 mL 1 M Na2C03 终止反应。另一只为空白对照，其反应混合液立即在IOO'C水浴中加热5 min 使酶灭活，然后加入1MNa2C03终止反应。用分光光度计在400nm处测定对 硝基苯酚的吸光度，从而确定该酶的活性。
测定结果平湖蜂胶吸光度为0.162，计算所得p-D-葡萄糖苷酶活力为 0.0396 unit/g;绍兴蜂胶吸光度为0.154，计算所得P-D-葡萄糖苷酶活力为0.0377 unit/g;江山蜂胶吸光度为0.210，计算所得卩-D-葡萄糖苷酶活力为0.0511 unit/g。
实施例4
取不同产地(平湖、绍兴、江山)蜂胶各3.0g，溶于25 mL pH 4.5磷酸 氢二钠-拧檬酸缓冲液中，加入0.3gPVPP，少许石英砂，在冰浴上研磨至糊状， 10000g4 。C离心15min，上清液转移到另一只离心管中，14000g4 。C离心30 min取上清液定容至25mL。取两只试管，分别加入0.5 mL粗酶液，0.5mL10 mmol/L底物浓度的对硝基苯酚卩-D-葡萄糖苷，其中一只试管在37。C设定的条 件下温育1.5 h，反应中始终保持溶液均匀，温育完毕加入2.5 mL 1 M Na2C03 终止反应。另一只为空白对照，其反应混合液立即在IO(TC水浴中加热5 min 使酶灭活，然后加入1 MNa2C03终止反应。用分光光度计在400 nm处测定对 硝基苯酚的吸光度，从而确定该酶的活性。
测定结果平湖蜂胶吸光度为0.129，计算所得卩-D-葡萄糖苷酶活力为 0.0316 unit/g;绍兴蜂胶吸光度为0.112，计算所得P-D-葡萄糖苷酶活力为0.0270 unit/g;江山蜂胶吸光度为0.143，计算所得卩-D-葡萄糖苷酶活力为0.0350 unit/g。实施例5
取不同产地(平湖、绍兴、江山)蜂胶各3.0g，溶于25 mL pH 5.5磷酸 氢二钠-柠檬酸缓冲液中，加入0.6gPVPP，少许石英砂，在冰浴上研磨至糊状， 10000g4 。C离心15min，上清液转移到另一只离心管中，14000g4 。C离心30 min取上清液定容至25mL。取两只试管，分别加入0.5 mL粗酶液，0.5mL30 mmol/L底物浓度的对硝基苯酚p-D-葡萄糖苷，其中一只试管在47'C设定的条 件下温育1.5h，反应中始终保持溶液均匀，温育完毕加入2.5mLlMNa2C03 终止反应。另一只为空白对照，其反应混合液立即在10(TC水浴中加热5 min 使酶灭活，然后加入lMNa2C03终止反应。用分光光度计在400nm处测定对 硝基苯酚的吸光度，从而确定该酶的活性。
测定结果平湖蜂胶吸光度为0.359，计算所得J3-D-葡萄糖苷酶活力为 0.0870 unit/g;绍兴蜂胶吸光度为0.298，计算所得P-D-葡萄糖苷酶活力为0.0723 unit/g;江山蜂胶吸光度为0.412，计算所得(3-D-葡萄糖苷酶活力为0.0997 unit/g。
权利要求
1. 一种测定蜂胶中β-D-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于通过以下步骤实现(1)粗酶提取将蜂胶冷冻，然后捣碎，过30目筛，取3.0g蜂胶粉末加入pH值4.5～6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，然后加入0.3～0.9g不溶性聚乙烯毗咯烷酮及石英砂，在冰浴上研磨成糊状，低温高速离心，上清液转移到另一只离心管中，二次低温高速离心，取上清液定容至25mL即为粗酶提取液；(2)酶促反应取两只试管，分别加入0.5mL粗酶液，0.5mL底物浓度5～40mmol/L的对硝基苯酚β-D-葡萄糖苷，其中一只试管在30～60℃下温育1.5小时，温育完毕加入2.5mL1M Na2CO3终止反应，另一只为空白对照，其反应混合液立即在100℃水浴中加热5分钟使酶灭活，然后加入1M Na2CO3终止反应；(3)活性测定用分光光度计在400nm处测定对硝基苯酚的吸光度，从而确定该酶的活性。
2. 根据权利要求1所述的一种测定蜂胶中p-D-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于步骤(2)中所述试管在温育时始终保持溶液均匀。
3. 根据权利要求1所述的一种测定蜂胶中(3-D-葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于蜂胶中P-D-葡萄糖苷酶活力计算公式如下(3-D-葡萄糖苷酶活力"^x"式中A为对硝基苯酚的摩尔量pmol/L， V为酶液量mL， n为酶液稀释倍数，t为反应时间分钟。
全文摘要
本发明提供一种测定蜂胶中β-D-葡萄糖苷酶活性的方法，本发明采用分光光度法测定一定时间内β-D-葡萄糖苷酶将一定量的底物水解成对硝基苯酚的量的多少来确定酶活性的强弱。本发明方法证实蜂胶中确定含有β-D-葡萄糖苷酶，并从成分及药理活性的角度区分蜂胶与其胶源植物的差别，还可在原料蜂胶的层面上区分真假蜂胶，为蜂胶质量标准化提供依据。本发明的方法具有简便，灵敏度高，检测成本低等优点。
文档编号G01N21/31GK101482498SQ200910096109
公开日2009年7月15日 申请日期2009年2月10日 优先权日2009年2月10日
发明者张翠平, 胡福良 申请人:浙江大学