专利名称：一种利用普通光学显微镜判别螺旋藻藻丝螺旋手性的方法
技术领域：
本发明涉及显微检测技术，特别涉及利用普通光学显微镜判别螺旋藻藻丝螺旋手性的方法。
背景技术：
螺旋藻(&ir"77'朋)，是一种光合放氧、呈规则螺旋形的原核丝状微藻，系蓝藻门 (Cyanophyta)、颤藻目(Oscillatoriales)、颤藻科(Oscillatoriaceae)的一个属[武汉 植物学研究，1997， 15(4): 369-374]，因其富含优质蛋白和多种生物活性物质而受到国内外 的极大关注，目前己在大量研究的基础上形成了庞大的螺旋藻产业，并广泛应用于食品、生 物医药保健、饲料、精细化工等领域。该属中的钝顶螺旋藻(^A/r"h'/7aj^ate/i A)是国内 外商业化养殖生产与开发应用最广泛的品种。我国是全球生产与出口螺旋藻粉的主要国家， 产量近占世界总产量的一半[/owv aJ 0//^/co7og, 2005， 41: 622-628]。
手性(chirality or handedness)系指左右对称性的差异特征。手性在自然界普遍存在， 如一些植物的藤蔓等往往呈螺旋状，根据其螺旋取向可区分为左手性或左旋(Left-handed)、 右手性或右旋(Right-handed)，以及无手性特征的手中性(No-chiral)。手性取向可按业内 通用的左右手定则进行判别。螺旋藻藻丝在分类学上典型的形态学特征为由多个柱状细胞串 联成丝状、不分枝、有规则、疏松或紧密的螺旋形，但在某些条件下会发生多形性变异甚至 完全变直[/owv aJ 0/,力ycoJo^x. 2005, 41: 622-628]。近年来，利用激光扫描共聚焦显微 技术等研究又发现螺旋藻藻丝的螺旋取向不仅具有典型的左、右对称性差异，即具有明显的 手性(Chirality或handedness)特征，而且在某些条件下手性取向会发生逆转，甚至变成手 中性(即变直)LZ尸々rco丄2003， 39: 360 - 367]。
众多实验研究与生产实践表明，螺旋藻藻丝的螺旋手性及其取向是其工厂化培殖生产中 重要的经济性状。 一方面，螺旋形态不仅有利于藻体上浮和游动，显著提高光能和养分利用 率，而且可用简便的筛绢过滤方式低成本采收。当藻丝一旦变直失去其螺旋手性特征(称手 中性)，就难以恢复到螺旋形，并给生产带来产量和质量急骤下降、难以采收及易受其它生物 污染等严重后果，生产上称这种"不可逆"的变异为藻种退化。另一方面，在螺旋藻工厂化 培养生产中，当藻丝群体均为螺旋形且手性取向一致时，藻体分散性好，产量高、品质和采 收性能好；而当藻丝群体即使全为螺旋形但取向不一致时，藻丝间往往会发生相互缠绕和结块，进而引发藻体死亡或变直。据不完全统计，仅我国每年因手性变异导致藻种退化等严重 生产问题所造成的经济损失至少上亿元，因而将藻丝螺旋手性定期观察列入螺旋藻养殖生产 的日常管理内容是非常重要的，这对确保螺旋藻高产、优质、低成本生产具有重要的现实意 义。但值得指出的是，目前判别螺旋藻藻丝螺旋手性的方法要借助激光共聚焦显微镜或更高 级的电子显微镜等精密、昂贵的科研大型仪器设备才能进行，而绝大多数螺旋藻生产基地仅 配备了普通光学显微镜，也未配备能从事激光共聚焦显微镜或电子显微镜等大型仪器复杂操 作的专业技术人员。因此，迫切需要建立一种能利用普通光学显微镜判别螺旋藻藻丝螺旋手 性，且操作简便、省时省力、成本低、可靠实用的新方法，以满足当前国内外螺旋藻产业不 断发展的实际需要。
发明内容
本发明目的是克服现有技术中的不足，提供一种利用普通光学显微镜判别螺旋藻藻丝螺 旋手性的方法。
本发明提供了一种利用普通光学显微镜判别螺旋藻藻丝螺旋手性的方法，包括以下步骤
(1) 将待检测螺旋藻液与Sp-CDS检测液按照1 : 1 2的体积比混匀得到待检混合液；
(2) 按显微观察所需量取待检混合液滴至载玻片上，置于普通光学显微镜下观察，通过 调节细调焦旋钮得到藻丝表层清晰的影像；
(3) 利用左右手定则根据藻丝表层的螺旋取向判别藻丝的螺旋手性为左旋还是右旋； 所述Sp-CDS检测液是dH20、吐温-20、 Triton-X100和甘油按体积比70 80: 6 10:
6~10: 8 10的比例组成的混合液。
作为一种改进，所述待检测螺旋藻液与Sp-CDS检测液按照1 : 1的体积比混匀。 作为一种改进，所述Sp-CDS检测液是由dH20、吐温-20、 Triton-X100和甘油按体积比
72: 10: 8: IO的比例组成的混合液。 本发明的有益效果在于
本发明所建立的利用普通光学显微镜判别螺旋藻藻丝螺旋手性的方法，与目前利用激光 共聚焦显微镜或更高级的电子显微镜等精密、昂贵的科研大型仪器设备的判别方法相比，具 有操作简便、省时省力、成本低、对操作人员的专业技术无特殊要求、生产应用性强等优点。
图1是利用激光共聚焦显微镜对螺旋藻品系Sp-11的藻丝进行的显微照相，其螺旋手性 为左旋；
图2是利用普通光学显微镜对螺旋藻品系Sp-ll的藻丝进行的显微照相，其螺旋手性为
4左旋，图中A为藻丝表层。
具体实施例方式
本发明的技术方案可以通过以下步骤实现。
选用样本材料；为公知的钝顶螺旋藻品系Sp-11，这株螺旋藻品系是实验室常用的螺旋 藻，在发明人所在的浙江大学原子核农业科学研究所生物资源与分子工程实验室也有保存， 可随时提供样本。利用公知的激光共聚焦显微镜判别法可以确认Sp-ll藻丝的螺旋取向为左 手性。
试剂和仪器本发明中所用的吐温-20、 Triton-X100和甘油均为美国安发码西亚公司 产品，其它试剂均为国产分析纯。激光共聚焦显微镜产由德国生产，型号为LSM 5 EXCITER; 普通光学显微镜为上海长方光学仪器有限公司生产，型号为XSP-IICE。
利用普通光学显微镜鉴别螺旋藻藻丝螺旋手性的主要步骤如下
(1) 将dH20、吐温-20、 Triton-X100和甘油按体积比为72: 10: 8: 10的比例取样并 混合均匀，配成基于普通光学显微镜鉴别螺旋藻藻丝螺旋手性的检测液(Sp-CDS),并保存于 4'C冰箱待用。如要配制10 ml的Sp-CDS,则依次取7, 2 ml dH20、 1,0 ml吐温-20、 0.8 ml Triton-X100和1 ml甘油，轻轻搅拌并充分混匀即可。
(2) 取O. 5 ml待检测的螺旋藻液于体积为2 ml的Eppendorf管中，再加入O。 5 ml Sp-CDS 并轻轻摇晃混匀。
(3) 用玻璃吸管吸取少量步骤(2)所得混匀的藻液均匀滴至载玻片上。此时，液滴会 因受其中所含的表面活性剂吐温-20和Triton-X100的表面张力作用而迅速展开成很薄的一 层膜，螺旋藻藻丝也随之散布开来。同时，液滴中所含的甘油因具有保水作用能较长时间维 持载玻片上的膜层和藻丝表面不干，以便有足够的时间观察藻丝的螺旋手性。
(4) 将步骤(3)加好藻液的载玻片放置于普通光学显微镜的载物台上，在低倍物镜(如 4X)下通过调节焦距与载波片移位旋钮，看到清晰的横躺在载玻片上的螺旋藻藻丝的影像， 再将物镜切换成更高倍数的镜头(若目镜为10X，则物镜至少为10X),并通过调节焦距得 到清晰的藻丝影像。
(5) 逆时针方向旋转细调焦旋钮(此时载物台下降)，使藻丝影像隐约可见(即变得较 模糊)。
(6) 顺时针方向缓慢旋转细调焦旋钮(此时载物台上升)，使载玻片上藻丝的表层清晰 可见，藻丝的底层(紧贴载玻片)隐约可见。
(7) 根据左右手定则(手心朝上)，并根据藻丝表层的螺旋取向判别藻丝的螺旋手性为 左旋还是右旋。作为实例，我们选取螺旋藻Sp-ll为样本利用本发明的方法在普通光学显微镜下判别其 的螺旋手性，可以确认Sp-11藻丝的螺旋取向为左手性；这一结果，与利用公知的激光共聚 焦显微镜判别法所得的结果一致。
权利要求
1、一种利用普通光学显微镜判别螺旋藻藻丝螺旋手性的方法，包括以下步骤(1)将待检测螺旋藻液与Sp-CDS检测液按照1∶1～2的体积比混匀得到待检混合液；(2)按显微观察所需量取待检混合液滴至载玻片上，置于普通光学显微镜下观察，通过调节细调焦旋钮得到藻丝表层清晰的影像；(3)利用左右手定则根据藻丝表层的螺旋取向判别藻丝的螺旋手性为左旋还是右旋；所述Sp-CDS检测液是dH2O、吐温-20、Triton-X100和甘油按体积比70～80∶6～10∶6～10∶8～10的比例组成的混合液。
2、 根据权利要求1所述的利用普通光学显微镜判别螺旋藻藻丝螺旋手性的方法，其特征 在于，所述待检测螺旋藻液与Sp-CDS检测液按照1 : 1的体积比混匀。
3、 根据权利要求1所述的利用普通光学显微镜判别螺旋藻藻丝螺旋手性的方法，其特征 在于，所述Sp-CDS检测液是由dH20、吐温-20、 Triton-X100和甘油按体积比72: 10: 8: 10 的比例组成的混合液。
全文摘要
本发明涉及显微检测技术，旨在提供一种利用普通光学显微镜判别螺旋藻藻丝螺旋手性的方法。该方法包括(1)将待检测螺旋藻液与Sp-CDS检测液按照1∶1～2的体积比混匀得到待检混合液；(2)按显微观察所需量取待检混合液滴至载玻片上，置于普通光学显微镜下观察，通过调节细调焦旋钮得到藻丝表层清晰的影像；(3)利用左右手定则根据藻丝表层的螺旋取向判别藻丝的螺旋手性为左旋还是右旋。本发明与目前利用激光共聚焦显微镜或更高级的电子显微镜等精密、昂贵的科研大型仪器设备的判别方法相比，具有操作简便、省时省力、成本低、对操作人员的专业技术无特殊要求、生产应用性强等优点。
文档编号G01N21/84GK101592618SQ20091010026
公开日2009年12月2日 申请日期2009年7月2日 优先权日2009年7月2日
发明者汪志平, 潘剑用, 王冬云, 董丹丹, 谢彦广, 斌 邵 申请人:浙江大学