专利名称：：丙型肝炎病毒抗体唾液快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物应用
技术领域：
，特别是涉及一种丙型肝炎病毒抗体唾液快速检测试纸条。
背景技术：
：丙型肝炎是波及全球的传染病，在输血后的肝炎中，80-90%是丙型肝炎，在散发的非曱非乙肝炎中有50%以上是丙型肝炎，在肝炎的慢性化和肝硬化的发病过程中起着重要作用，丙型肝炎在一般人群中感染率为3.1%。丙型肝炎是由丙肝病毒(HCV)所引起，是通过输血或血制品、血透析、单采血浆还输血球、肾移植、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。丙肝分布较广，更容易演变为慢性、肝硬化和肝癌。在预防丙肝的措施上，筛选献血员是重要一环，凡血中抗-HCV阳性或HCVRNA阳性均不能作为献血员。丙型肝炎急、慢性患者和慢性HCV携带者均可为传染源。小部分(约20%~50%)急性病例可获自愈，其余大部转为慢性，终致肝硬化乃至演变为肝细胞癌，而且后一进程较快。HCV慢性感染的治疗相当棘手。目前干扰素疗法，纵然比HBV慢性感染治疗加倍剂量和疗程，效果仍欠理想，而中医中药在治疗本病的应用上，效果不畲于乙肝的治疗，亦是目前较为推荐的治疗手段。输血和输注血液制品是HCV的最主要传播途径，散发病例多有与丙型肝炎患者之密切接触史，或有手术、静滴注射以及介人性诊疗史。本病母嬰垂直传播虽已不容怀疑，但发生率很低。目前，检测以上传染病最常用的方法是免疫检测，此方法以抗原一抗体的特异性识别为基础，包括传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)和近来兴起的胶体金法两种。胶体金法分为免疫层析和免疫渗滤两种方式，其中以免疫层析法最为方^^、快捷。运用免疫层析胶体金技术检测唾液中的丙型肝炎病毒抗体尚无报道。免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，已得到较为广泛的应用，基本原理如下利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试纸条的硝酸纤维素膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测时当样品中含有相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结合形成复合物，然后在硝酸纤维素膜上层析，再被包被的抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测线(T线)，通过检测线的有无实现对结果的判定。但现有的试纸条大多以血液为样品，不适合现场检测和自检，检测成本较高。
发明内容本发明提供了一种丙型肝炎病毒抗体唾液快速^r测试纸条，该试纸条可以用唾液作为样品，解决了现有试纸条不适合现场4企测，检测成本较高的问题。一种丙型肝炎病毒抗体唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的可与丙型肝炎病毒抗体特异性结合的重组抗原，所述的硝酸纤维素膜上包被有由所述的重組抗原构成的检测线以及可与所述的重组抗原特异性结合的抗体构成的质控线。所述的胶体金垫上附着有0.15~0.45吗/cm2的胶体金标记的可与丙型肝炎病毒抗体特异性结合的重组抗原。所述的胶体金垫通过如下方法制备取胶体直径为1535nm的胶体金溶液，调节pH值至8.0~8.2,按每100ml胶体金溶液加入0.75~l.Omg的可与丙型肝炎病毒抗体特异性结合的重组抗原，搅拌后用牛血清蛋白封闭，离心去上清液，加入相同体积的胶体金溶液复溶，将每毫升溶液均匀铺在2250cn^玻璃纤维膜上，干燥后制得胶体金垫。所述的4企测线中所述的重组抗原含量为0.05~1.0jag/cm;所述的质控线中可与所述的重组抗原特异性结合的抗体含量为0.05~1.0pg/cm。在该浓度下，正好可以和大多数唾液中的抗原相匹配。所述的检测线和质控线包被方法如下取浓度为0.01mol/L、pH为8.0的磷酸緩冲溶液，将所述的重組抗原和可与所述的重组抗原特异性结合的抗体分别溶解磷酸緩冲溶液中制得浓度均为0.05~1.0mg/ml的两种溶液，将该两种溶液以1~1.5|il/cm的参数分别在硝酸纤维素膜两端划线，干燥后即得;险测线和质控线。所述的试纸条的宽度为2.5~6mm。本发明还提供了一种上述试纸条的4企测方法，包括以下步骤取人唾液，用磷酸緩沖溶液稀释，取50100^il稀释后的唾液滴在样品垫上，根据检测线(T线)和质控线(C线)的显色状态，判断检测结果。如C、T线均出现，判定样品为阳性；C线出现，T线不出现，判定样品为阴性；C、T线都不出现或者C线不出现T线出现，均判定试纸无效。本发明试纸条采用胶体金标记技术，检测唾液中的丙型肝炎病毒抗体成分，从而判断是否感染丙肝病毒，具有操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和自检、经济实用等优点。具体实施方式实施例1胶体金垫的制备以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径15nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金溶液于烧杯内，用0.1MK2C03调至pH8.0,按100ml胶体金溶液加入0.75mg相应可与丙型肝炎病毒抗体特异性结合的重组抗原(上海领潮生物科技有限公司)，室温搅拌1小时，加入重量百分比为5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，12000rpm、4。C离心30分钟，弃上清，用胶体金溶液复溶至100ml，按lml溶液铺22cm2的比例，将溶液均匀地铺在玻璃纤维膜上，37r干燥30分钟，制成胶体金垫。硝酸纤维素膜的包被将可与丙型肝炎病毒抗体特异性结合的重组抗原(上海领潮生物科技有限公司)以及可与上述重组抗原特异性结合的抗体(上海领潮生物科技有限公司)溶解在O.OIM、pH8.0磷酸緩冲液(PBS)配制成0.05mg/ml的溶液，用喷膜仪分别在硝酸纤维素膜两端以1.5nl/cm的参数进行划线，包被T线和C线，划线后将硝酸纤维素膜在室温干燥8小时。检测试纸的组装在干燥室内，温度20~25°C，湿度小于30%,将样品垫(玻璃纤维膜)、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫(吸水试纸)粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包被有T线的一端与胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10招:接，样品垫与胶体金垫的l/5搭接。最后切成宽度为2.5mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。实施例2胶体金垫的制备以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径35nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金溶液于烧杯内，用0.1MK2CO3调至pH8.2,向胶体金溶液加入lmg可与丙型肝炎病毒抗体特异性结合的重组抗原(上海领潮生物科技有限公司)，室温搅拌1小时，加入重量百分比为5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时，12000rpm、4。C离心30分钟，弃上清，用胶体金稀释液复溶至100ml,按lml溶液铺50cm2的比例，将溶液均匀的铺在玻璃纤维膜上，37'C干燥30分钟，制成胶体金垫。硝酸纤维素膜的包被将可与丙型肝炎病毒抗体特异性结合的重组抗原(上海领潮生物科技有限公司)以及可与上述重组抗原特异性结合的抗体(上海领潮生物科技有限公司)溶解在O.OIM、pH8.2磷酸緩冲液(PBS)配制成0.1mg/ml的溶液，用喷膜仪分别在硝酸纤维素膜两端以lpl/cm的参数进行划线，包被T线和C线，划线后将硝酸纤维素膜在室温干燥8小时。检测试纸的组装在干燥室内，温度20~25°C,湿度小于30%，将样品垫(玻璃纤维膜)、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫(吸水试纸)依次粘贴在底板上，其中硝酸纤维素膜位于底板中部，硝酸纤维素膜包净皮有T线的一端与胶体金垫的1/3搭接，包被有C线的一端与吸样垫的1/10搭接，样品垫与胶体金垫的1/5搭接。最后切成宽度为6mm的试纸条，也可将试纸条装入一个塑料卡中制成检测卡。临床样品试验待检人在采集唾液样品前30分钟禁食，耳又每位待4企人唾液0.5ml于纸杯中，用吸管取两滴滴加到浓度0.02M、pH8.0的磷酸緩冲溶液中稀释，取稀释的唾液100^1加到样品垫中，肉眼观测30分钟，记录T线和C线的显色状态。同时将唾液样品用丙肝病毒抗体ELISA试剂盒^f企测，若两者检测检测结果不一致，再以另外两种丙肝病毒抗体ELISA试剂盒进行检测，若两种或以上的ELISA试剂为阳性，判定结果为阳性，两种或以上的ELISA试剂为阴性，判定结果为阴性。收集唾液样品161份，其中ELISA试剂盒^r测出阳性样品34份，本发明试纸条(实施例1)检测出阳性样品35份，具体结果如下表1所示表1本发明试纸条对临床样品丙型肝炎病毒抗体的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>灵敏度=42/42=100%;特异性=118/119=99.2%。权利要求1、一种丙型肝炎病毒抗体唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，其特征在于所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的可与丙型肝炎病毒抗体特异性结合的重组抗原，所述的硝酸纤维素膜上包被有由所述的重组抗原构成的检测线以及可与所述的重组抗原特异性结合的抗体构成的质控线。2、根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗体唾液快速检测试纸条，其特征在于所述的胶体金垫上附着有0.15~0.45吗/cm2的胶体金标记的可与丙型肝炎病毒抗体特异性结合的重组抗原。3、根据权利要求2所述的丙型肝炎病毒抗体唾液快速检测试纸条，其特征在于，所述的胶体金垫通过如下方法制备取胶体直径为15~35nm的胶体金溶液，调节pH值至8,0~8.2,按每100ml胶体金溶液加入0.75~l.Omg的可与丙型肝炎病毒抗体特异性结合的重组抗原，搅拌后用牛血清蛋白封闭，离心去上清液，加入相同体积的胶体金溶液复溶，将每毫升溶液均匀铺在22-50cmS玻璃纤维膜上，干燥后制得胶体金垫。4、根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗体唾液快速检测试纸条，其特征在于所述的4企测线中所述的重组抗原含量为0.05~1.0(xg/cm;所述的质控线中可与所述的重组抗原特异性结合的抗体含量为0.05~1.0(ig/cm。5、根据权利要求4所述的丙型肝炎病毒抗体唾液快速检测试纸条，其特征在于，所述的^r测线和质控线包被方法如下取浓度为0.01mol/L、pH为8.0的磷酸緩沖溶液，将所述的重组抗原和可与所述的重组抗原特异性结合的抗体分别溶解在磷酸緩冲溶液中制得浓度均为0.05~1.0mg/ml的两种溶液，将该两种溶液以1~1.5nl/cm的参数分别在硝酸纤维素膜两端划线，干燥后即得;险测线和质控线。6、根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗体唾液快速检测试纸条，其特征在于所述的试纸条的宽度为2.5~6mm。7、根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗体唾液快速检测试纸条的检测方法，其特征在于，包括以下步骤取人唾液，用磷酸緩沖溶液稀释，取50~100pl稀释后的唾液滴在样品垫上，才艮据检测线和质控线的显色状态，判断检测结果。全文摘要本发明公开了一种丙型肝炎病毒抗体唾液快速检测试纸条，包括底板，底板上依次粘贴有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜以及吸样垫，所述的胶体金垫上附着有胶体金标记的可与丙型肝炎病毒抗体特异性结合的重组抗原，所述的硝酸纤维素膜上包被有由所述的重组抗原构成的检测线以及可与所述的重组抗原特异性结合的抗体构成的质控线。本发明试纸条采用胶体金标记技术，检测唾液中的丙型肝炎病毒抗体成分，从而判断是否感染丙肝病毒，具有操作简单、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和自检、经济实用等优点。文档编号G01N33/576GK101614739SQ20091010103公开日2009年12月30日申请日期2009年7月30日优先权日2009年7月30日发明者李洪江,郑隆泗申请人:杭州艾力康医药科技有限公司