专利名称：镍离子人工抗原螯合剂的合成及镍单克隆抗体的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的双功能螯合剂及该螯合剂在重金属镍 离子人工抗原的合成及镍单克隆抗体制备中的应用。
背景技术：
人工抗原的合成是重金属免疫分析技术中关键环节之一，它 是利用双功能螯合剂先与重金属离子形成稳定的螯合物(半抗原 分子)，再与载体蛋白质偶联形成重金属-螯合剂-载体蛋白质的螯 合物(人工抗原)。目前双功能螯合剂的种类非常少，并且价格偏 高，阻碍了重金属人工抗原合成的研究。本申请人曾在先申请了 镉离子人工抗原螯合剂的合成方法，继而介绍了对应的镉离子人
工抗原和单克隆抗体的合成，并将抗体应用于镉离子污染的检测， 但对于重金属镍而言，目前国内并没有关于制备其人工抗原的相 关报道，因此，寻找新型、价廉的双功能螯合剂，并进一步制备 相应的人工抗原和单克隆抗体，对应用于重金属镍残留污染的快 速检测具有十分重要的现实意义。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明的目的是研制出 一种双功
能的镍离子人工抗原螯合剂6-溴乙酰氨基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基会鬼啉(6-bromine acetamido-2， 3-(N， N， N'， N'- tetraacethyl) dimethylamino-quinoxaline， BATDQ)合成 对应于重金属镍的人工抗原，并公开基于此人工抗原的重金属镍 单克隆抗体的制备方法，以及运用酶联免疫吸附法(Enzymeassay, EIJSA)中的间接竟争法检观J富 含镍离子污染的样品。本发明的目的通过如下措施实现l.镍离子人工抗原螫合剂的合成方法如下1) 6-硝基-2， 3-二甲基喹喔啉的合成将2 g 4-硝基邻苯二胺和1. 13 g 丁二酮放入250 mL单口烧 瓶中，以50mL无水乙醇为溶剂，加热回流2h，冷却至室温后抽 滤，加30 mL无水乙醇结晶提纯，所得产物即为6-硝基-2， 3-二甲基喹喔啉；2) 6-硝基-2， 3-二溴甲基会喔啉的合成取0. 5 g第一步产物6-硝基-2， 3-二曱基喹喔啉、0.202 g 偶氮二异丁腈与1.14 g N-溴代琥珀酰亚胺置于干燥的250 mL单 口圆底烧瓶中，再取40 mL四氯化碳加入烧瓶中，装上回流冷凝 管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到80。C的油浴中， 强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后， 将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水浴锅中蒸馏、冷却， 得6-硝基-2， 3-二溴甲基喹喔啉；3) 6-硝基-2， 3-(N, N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的 合成在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加 入l. 99 mL亚氛基二乙酸二乙酯、10 mL干燥的乙腈和2. 63 g无 水碳酸钾粉末；搅拌下向反应混合液中滴加溶有1.805 g 6-硝基 -2, 3-二溴曱基会喔啉的10 mL干燥乙腈，回流8-10 h，冷却， 滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体；往上述油状液中加入含3. 48 g结晶氢氧化钡(Ba (OH) 2 8H20 )的 饱和溶液，室温下充分搅拌至油状液体均转化为白色沉淀，抽滤 钡盐并用蒸馏水充分浸泡、洗涤；然后将此钡盐转移到15 mL蒸 馏水中，将混合物加热煮沸，加入石克酸至清液中不再出现混浊， 过滤除去硫酸钡，再用沸水煮洗硫酸钡残渣3次，将滤液和洗涤 液合并，冰箱中冷却8-10h，得到6-硝基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基喹喔啉；4) 6-氨基-2，3-(N， N，『，N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成将IOO mL乙醇和2.025 g 6-硝'基-2， 3-(N, N， N'， N'-四乙 酸)二曱胺基喹喔啉加入到250 mL装有温度计、机械搅拌器的三 口瓶中，加入1. 2 g钯碳催化剂和5. 29 g水合肼，不断搅拌，在 80-85n条件下反应4 h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷 却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2，3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基会喔啉；5) 6-溴乙酰氨基-2, 3-(N， N， N'，『-四乙酸)二曱胺基喹 喔啉的合成取5. 05 g溴乙酰溴溶于30 mL三氯化碳中，2.105 g碳酸氬 钠溶于100 mL水中，冰浴中将碳酸氢钠溶液緩慢滴加到溴乙酰溴 溶液中，取18. 722 g 6-氨基-2，3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺 基喹喔啉装入三口烧瓶中，温度保持在50-60lC，快速搅拌的同时 把溴乙酰溴和碳酸氢钠混合液緩慢地滴入6-氨基-2， 3-(N， N， N: N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氢氧化钠溶液控制反应体系 的pH为12.0，滴加完毕，升温到90X:，搅拌，将溶剂全部蒸出，加入50 mL浓盐酸，过滤分离出氯化钠，然后往盐酸提取液中加 入150 mL无水乙醇，产生白色沉淀，4。C存放8-10 h，用50%的 乙醇水溶液重结晶，得6-溴乙酰氨基-2， 3-(N, N， N', N'-四乙 酸)二甲胺基喹喔啉；2. 镍人工抗原的合成包括下列步骤1) 重金属镍半抗原的合成取BATDQ 0. 8 mg，用pH=7. 5，浓度为0. 1 mol L—i的磷酸盐 緩沖液(Phosphate buffered saline, PBS)定容至2 mL，加 入O. 4 mg的硝酸镍，搅拌使其混合均匀，反应30 min;2) 重金属镍人工抗原的合成将5 mg牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)用pH=9. 6 的PBS定容至2mL，室温下，将其緩慢加入半抗原溶液中，并用 氢氧化钾调节pH-9. 5，室温下搅拌反应20h，即得重金属镍人工 抗原；3) 重金属镍包被抗原的合成将5 mg人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)用pH=9. 6 的PBS定容至2mL，室温下，将其緩慢加入半抗原溶液中，并用 氢氧化钾调节pH-9. 5，室温下搅拌反应20h，即得重金属镍包被 抗原；3. 镍单克隆抗体制备包括下列步骤 1)小鼠免疫及抗血清制备选用6周龄雌性BALB/c小鼠8只，将人工抗原与佐剂按1:1 体积比混合，注射器双推法使其混合均匀，初次免疫将人工抗原 与完全佐剂乳化，腹腔、皮下、颈部多点注射，每只小鼠注射0.2mL，第一次免疫3周后进行第二次免疫，剂量和途径同第一次， 但从第二次免疫开始佐剂换用不完全佐剂，每隔两周分别进行第 三次、第四次免疫，第四次免疫后采血清，检测效价，取效价高 的继续加强免疫，加强免疫时抗原不加任何佐剂；加强免疫3天后，摘眼#小鼠血液于灭菌的康氏管内，室 温放置lh，在超净工作台用无菌管把血块和管壁剥离，37。C恒温 2h后，41C冰箱中静置8-10 h，使血清充分析出，收集血清，将 血清IOOO rpm/min离心10 min，收集上清，将血清分装， 保存；2)间接ELISA法检测抗血清效价包被用pH=9. 6，浓度为0. 05 mol . L—i的碳酸盐緩沖液将包 被抗原稀释至2 )Lig'mL—、 100 inL/孔，包被到酶标板上，4。C反 应12 h或37"C水浴3 h;洗涤倾去板孔液，用pH=7. 4,浓度为0.15 mol . L—1 ，含 0. 05%吐温-20的磷酸盐緩沖液(PBS-T)洗涤3次，5 min/次，拍干；封闭加入10%小牛血清作为封闭液，200 nL/孔，371C孵 育3 h，同前洗涤，拍干；加抗血清抗血清按400、 800、 1600、 3200、 6400、 12800、 25600、 5U00倍稀释，100 jiL/孔，设置空白对照，并用正常小鼠 血清作为阴性对照，371C孵育l h，同前洗涤，拍干；加酶标记抗体加入按1: 5000稀释的用辣才艮过氧化物标记的 羊抗小鼠(IgG-HRP)， 100 pL/孔，37*€孵育1 h，同前洗涤，拍 干；显色加入使用前配制的邻苯二胺底物溶液 (O—phenylenediamine， 0PD) ， 100 jliL/孔，371C显色15 min;终止加2 mol . L—i的石危酸，50 jiL /孑U终止反应5 min;读数利用酶标仪测定492 nm波段处的吸光值，经间接ELISA 法检测抗血清的效价达到1 x 105;3 )细胞融合在无菌条件下，制备饲养细胞，取效价高的BALB/c小鼠，最 后加强免疫三天后，制备免疫脾细胞，并准备对数生长期的Sp2/0 骨髓瘤细胞；取1. 0 x 108个脾细胞，2. 0-5. 0 x 107个Sp2/0细胞，按1-10: l的比例加入到50mL融合管中，轻轻摇匀，1000 r/min离心10 min，弃上清液；将融合管置于掌心轻轻摩擦，以防止细胞沉淀，使细胞松散 均匀成糊状；将融合管置于37X:水浴中，吸取1 mL 37。C预热的聚乙二醇 4000，緩慢加入融合管中，边加边轻轻摇匀，60 s内加完；在90 s内緩慢滴加无血清的DMEM培养基30-40 mL，终止融 合，37X:静止10 min后，1000 r/min,离心10 min，弃上清液；将融合管置于手掌，摩擦使^^>*，加入60-80 mL HAT培养 基使细胞悬浮，混勻，分装于带有饲养细胞的96孔细胞培养板， 100 piL/孔，于37。C、 5% 0)2培养箱中培养；4)采用有限稀释法筛选阳性孔及克隆制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，细胞计数，用含12%血清的 HT培养基稀释至每毫升含10、 15和20个细胞3种不同的稀释度，分装于有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度分装32孑L, 100 jnL/孔；于371C、 5%0)2培养箱中培养7-10天，出现肉眼可见的克隆 即用间接ELISA法检测抗体效价，以样品孔的OD值大于阴性孔的 2倍为阳性；取抗体检测为阳性孔的细胞进行扩大培养并冻存；5) 腹水型单克隆抗体的制备 腹腔注射液体石蜡，每只小鼠0.5 mL;7-10天后用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞腹腔接种，每只 小鼠注射5乂105个细胞；间隔5天后，观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以 手触摸时，皮肤有紧张感，即用16号针头采集腹水，连续采2-3 次，每只小鼠采5-10 mL腹水；将腹水在2000 rmp/min条件下离心5 min， 除去细胞成分和 其他沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80"€冻存，或冻干保存；6) 腹水型单克隆抗体的纯化用微孔滤膜过滤腹水，除去较大的凝块及脂肪滴，在41C, 10000 rmp/min的条件下离心15 min，除去细胞残渣及小颗津立物质；饱和硫酸铵法对腹水型单克隆抗体进行粗提取；DEAE离子交换层析法对腹水型单克隆抗体进一步纯化；4.应用镍单克隆抗体检测含镍污水的方法按如下步骤进行1)包被用pH-9. 6，浓度为0. 05 mol L—i的碳酸盐緩沖液稀释抗原至5ng/mL， 100 iuL/孔，包被到酶标板上，4^C放置 12 h或37T水浴3 h;2) 洗涤倾去板孔液，用pH=7. 4，浓度为0. 15 mol L一1 ， PBS-T洗涤3次，5 min/次，拍干；3) 封闭加入10%小牛血清作为封闭液，200 juL/孔，37 1C孵育3 h，同前洗涤，拍干；4 )加样将样品和最佳稀释浓度的抗血清按1:1的体积充分 混合，室温下反应30 min， 100 pL /孔，37"C反应1 h，洗涤3 次，5 min/次，拍干；5) 加酶标记抗体加入按1: 5000稀释的IgG-HRP， 100 juL/ 孔，37*€孵育1 h,同前洗涤，拍干；6) 显色加入使用前配制的OPD溶液，100 jlaL/孔，371C显 色15 minj7 )终止加2 mol L—1的硫酸，50 p L /孔，终止反应5 min;8) 读数利用酶标仪测定492 nm波段处的吸光值；9) 数据处理根据抑制率计算公式和标准曲线求出相对应的 样品浓度。本发明的有益效果是1) 本单克隆抗体对镍残留污染的检测专一性强，且与其他金 属的交叉反应弱；2) 原料便宜，总成本低，价格为30元/mg;3) 通过原子吸收分光光度法测定的Ni-BATDQ-BSA 、 Ni-BATDQ-HSA的偶联比为22:1、 28: 1，偶联比较高；4) 合成的人工抗原免疫原性强，稳定性好，以间接ELISA法测定的抗血清效价达到1 x 105，获得的单克隆抗体检出限为lpbb,具体实施方案本发明的实验反应路线<formula>formula see original document page 17</formula>本发明是利用了 BATDQ的四乙酸结构与重金属镍离子形成稳 定的螯合物，另一方面又利用它的溴乙酰氨基结构与蛋白质上的 巯基在弱碱性条件下发生缩合反应，从而实现了重金属镍人工抗 原的合成，这为重金属镍的酶免疫分析技术奠定了基础。同时， 本发明是对传统的重金属镍离子的检测技术进行的有益补充，其 快速、高灵敏度、在线操作等特点成为重金属检测的新M方向。最佳实施例镍离子人工抗原螯合剂的合成方法如下1) 6-硝基-2， 3-二甲基会喔啉的合成将2 g 4-硝基邻苯二胺和1. 13 g 丁二酮放入250 mL单口烧 瓶中，以50mL无水乙醇为溶剂，加热回流2h，冷却至室温后抽 滤，加30 mL无水乙醇结晶提纯，所得产物即为6-硝基-2， 3-二曱基全喔啉；2) 6-硝基-2， 3-二溴甲基会喔啉的合成取0. 5 g第一步产物6-硝基-2， 3-二甲基喹喔啉、0.202 g 偶氮二异丁腈与1. 14 g N-溴代琥珀酰亚胺置于干燥的250 mL单 口圆底烧瓶中，再取40 mL四氯化碳加入烧瓶中，装上回流冷凝 管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到8(TC的油浴中， 强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后， 将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水浴锅中蒸馏、冷却， 得6-硝基-2， 3-二溴甲基会喔啉；3) 6-硝基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基喹喔啉的合成在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加 入1.99 mL亚^^二乙酸二乙酯、10 mL干燥的乙腈和2. 63 g无 水碳酸钾粉末；搅拌下向反应混合液中滴加溶有1. 805 g 6-硝基 -2， 3-二溴甲基会喔啉的10 mL干燥乙腈，回流8-10 h,冷却， 滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体； 往上述油状液中加入含3.48 g Ba(0H)2 8H20的饱和溶液，室温 下充分搅拌至油状液体均转化为白色沉淀，抽滤钡盐并用蒸馏水 充分浸泡、洗涤；然后将此钡盐转移到15 mL蒸馏水中，将混合 物加热煮沸，加入硫酸至清液中不再出现混浊，过滤除去硫酸钡，再用沸水煮洗硫酸钡残渣3次，将滤液和洗涤液合并，水箱中冷 却8-10 h得到6-硝基-2， 3-(N， N，N'， N'-四乙酸)二曱胺基喹喔啉；4) 6-氨基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成将IOO mL乙醇和2.025 g 6-硝基-2，3-(N， N， N', N'-四乙 酸)二曱胺基喹喔啉加入到250 mL装有温度计、机械搅拌器的三 口瓶中，加入1. 2 g把碳催化剂和5. 29 g水合肼，不断搅拌，在 80-85匸条件下>^应4 h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷 却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2， 3-(N， N， N'， N'-四 乙 酸) 二 曱 胺基会喔啉；5) 6-溴乙酰氨基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹鬼啉的合成取5. 05 g溴乙酰溴溶于30 mL三氯化碳中，2.105 g碳酸氢 钠溶于100 mL水中，冰浴中将碳酸氢钠溶液緩慢滴加到溴乙酰溴 溶液中，取18. 722 g 6-氨基-2，3-(N， N， N', N'-四乙酸)二曱胺 基全喔啉装入三口烧瓶中，温度保持在50-60"C，快速搅拌的同时 把溴乙酰溴和碳酸氢钠混合液緩慢地滴入6-氨基-2， 3-(N, N， N'， N' -四乙酸)二甲胺基奎喔啉中，并用氢氧化钠溶液控制反应体系 的pH为12. 0，滴加完毕，升温到90'C，搅拌，将溶剂全部蒸出， 加入50 mL浓盐酸，过滤分离出氯化钠，然后往盐酸提取液中加 入150 mL无水乙醇，产生白色沉淀，41C存放8-10 h，用50%的 乙醇水溶液重结晶，得6-溴乙酰氨基-2, 3-(N, N， N、 N'-四乙 酸)二甲胺基喹喔啉；镍人工抗原的合成包括下列步骤1) 重金属镍半抗原的合成取BATDQ 0. 8 mg，用pH=7, 5， 0.1 mol L—1的PBS定容至2 mL, 加入O. 4 mg的硝酸镍，搅拌使其混合均匀，反应30 min;2) 重金属镍人工抗原的合成将5 mg BSA用pH=9. 6的PBS定容至2 mL，室温下，将其緩 慢加入半抗原溶液中，并用氢氧化钾调节pH=9,5，室温下搅拌反 应20 h，即得重金属镍人工抗原；3 )重金属镍包被抗原的合成将5 mg HSA用pH-9. 6的PBS定容至2 mL，室温下，将其緩 慢加入半抗原溶液中，并用氢氧化钾调节pH=9.5，室温下搅拌反 应20 h，即得重金属镍包被抗原；4)原子吸收分光光度法鉴定偶联比分别配制镍标准液(0、 0.1、 0. 5、 1. 0、 1. 5、 2. 0 mg L—1 )， 制做标准曲线，将偶联产物取l mL稀释20倍，用原子吸收法检 测重金属镍的含量。利用原子吸收分光光度法检测人工抗原 Ni-BATDQ-BSA、包被抗原Ni-BATDQ-HSA，检测到重金属镍离子的 含量分别为20. 0 mg . L_1、 25. 0 mg . L—、经计算两种人工抗原的 偶联比分别为22:1、 28:1，偶联比符合制备抗体要求。5 ) SDS-PAGE法对偶联结果的鉴定采用SDS-PAGE不连续电泳，以Tris-HCl作为緩沖体系，10% 分离胶，5%浓缩胶。样品在浓缩胶上电泳时以恒定电流(20 mA) 电泳，待其转入分离胶后恒定电流(30 mA)，电泳至溴酚蓝距分 离胶底边1 cm左右停止。卸开电泳槽，取出胶板，固定液固定40 min，敏化30 min，水洗4次，银染，最后显色呈像。电泳结 果显示，人工抗原Ni-BATDQ-BSA、包被抗原Ni-BATDQ-HSA在电泳中的泳动速度明显落后于其相应的载体蛋白，且偶联后的人工 抗原与原载体蛋白相比增加的分子量在6000 D左右。镍单克隆抗体制备包括下列步骤1) 小鼠免疫及抗血清制备选用6周龄雌性BALB/c小鼠8只，将人工抗原与佐剂按1:1 体积比混合，注射器双推法4吏其混合均匀，初次免疫将人工抗原 与完全佐剂乳化，腹腔、皮下、颈部多点注射，每只小鼠注射0.2 mL，第一次免疫3周后进行第二次免疫，剂量和途径同第一次， 但从第二次免疫开始佐剂换用不完全佐剂，每隔两周分别进行第 三次、第四次免疫，第四次免疫后釆血清，检测效价，取效价高 的继续加强免疫，加强免疫时抗原不加任何佐剂；加强免疫3天后，摘眼來取小鼠血液于灭菌的康氏管内，室 温放置lh，在超净工作台用无菌管#块和管壁剥离，371c恒温 2h后，41c冰箱中静置8-10 h，使血清充分析出，收集血清，将 血清IOOO rpm/min离心10 min，收集上清，将血清分装，-20"C 保存；2) 间接ELISA法检测抗血清效价包被用pH-9. 6，浓度为0. 05 mol L—i的碳酸盐緩冲液将包 被抗原稀释至2 jug'ml/1， 100 mL/孔，包被到酶标板上，4。C反 应12 h或37匸水浴3 h;洗涤倾去板孔液，用pH=7. 4，浓度为0.15 mol 'I^的PBS-T 洗涤3次，5 min/次，拍干；封闭加入10%小牛血清作为封闭液，200 pL/孔，37C孵 育3 h，同前洗涤，拍干；加抗血清抗血清按400、 800、 1600、 3200、 6400、 12800、 25600、 51200倍稀释，100 pL/孔，设置空白对照，并用正常小鼠 血清作为阴性对照，37<€孵育1 h，同前洗涤，拍干；加酶标记抗体加入按1:5000稀释的IgG-HRP， 100 pL/孔， 37。C孵育1 h，同前洗涤，拍干；显色加入4吏用前配制的OPD溶液，100 jLiL/孔，37。C显色 15 min;终止加2 mol L—i的石危酸，50 jliL /孔，终止反应5 min; 读数利用酶标仪测定492 nm波段处的吸光值，经间接ELISA 法检测抗血清的效价达到1 x 105; 3 )细胞融合在无菌条件下，制备飼养细胞，取效价高的BALB/c小鼠，最 后加强免疫三天后，制备免疫脾细胞，并准备对数生长期的Sp2/0 骨髓瘤细胞；取1. 0 x 108个脾细胞，2. 0-5. 0 x 107个Sp2/0细胞，按1-10: 1的比例加入到50 mL融合管中，轻轻摇匀，1000 r/min离心10 min,弃上清液；将融合管置于掌心轻轻摩擦，以防止细胞沉淀，使细胞松散 均匀成糊状；将融合管置于371C水浴中，吸取1 mL WX:预热的聚乙二醇 4000，緩慢加入融合管中，边加边轻轻摇匀，60 s内加完；在90 s内緩慢滴加无血清的DMEM培养基30-40 mL，终止融r/min，离心10 min，弃上清液； 将融合管置于手掌，摩擦使之爭>歉，加入60-80 mL HAT培养基4吏细胞悬浮，混匀，分装于带有飼养细胞的96孔细胞培养板，100 )LiL/孔，于37C、 5% 0)2培养箱中培养； 4)采用有限稀释法筛选阳性孔及克隆制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，细胞计数，用含12%血清的 HT培养基稀释至每亳升含10、 15和20个细胞3种不同的稀释度， 分装于有祠养细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度分装32孑L， 100 juL/孔；于37"C、 5%0)2培养箱中培养7-10天，出现肉眼可见的克隆 即用间接ELISA法检测抗体效价，以样品孔的OD值大于阴性孔的 2倍为阳性；取抗体检测为阳性孔的细胞进行扩大培养并冻存； 5 )腹水型单克隆抗体的制备 腹腔注射液体石蜡，每只小鼠O. 5 mL;7-10天后用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞腹腔接种，每只 小鼠注射5 x 105个细胞；间隔5天后，观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以 手触摸时，皮肤有紧张感，即用16号针头采集腹水，连续采2-3 次，每只小鼠采5-10 mL腹水；将腹水在2000 rmp/min条件下离心5 min， 除去细胞成分和 其他沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80。01冻存，或冻千保存；6)腹水型单克隆抗体的纯化用微孔滤膜过滤腹水，除去较大的凝块及脂肪滴，在4"C， 10000 rmp/min的务ff下离心15 min，除去细胞残渣及小颗粒物质；饱和硫酸铵法对腹水型单克隆抗体进行粗提取； DEAE离子交换层析法对腹水型单克隆抗体进一步纯化。 至此，本发明对镍人工抗原螯合剂的合成方法及对应镍的人 工抗原和镍单克隆抗体的制备，都作了完整而清楚的介绍，穿插 介绍了人工抗原偶联结果的两种鉴定方法及抗血清效价的检测 方法。为更进一步说明本发明，下面再介绍重金属镍离子标准曲线 的建立，并以水中重金属镍离子的含量为例介绍快速检测法，便 于公众全面了解本发明。为检测抗体的检测限，下面介绍重金属镍标准曲线的建立方法1) 包被用pH为9. 6，浓度为0. 05 mol f的碳酸盐包被 緩冲液稀释抗原至5Mg/mL, 100 mL/孔，包被到酶标板上，4 'C放置12 h或37"C水浴3 h;2) 洗涤倾去包净皮液，用PBS-T洗涤3次，5min/次，拍千；3) 封闭加入10%小牛血清作为封闭液，200 juL/孔，37 C孵育3 h，同前洗涤，拍干；4) 加样取系列浓度(O、 10、 50、 100、 250、 500、 1000和 5000 ng . mL—1)的镍标液加入适宜浓度的EDTA中，按1:1的体积 比加入最佳稀释浓度的抗血清，室温下反应30min， 100 juL/孔， 37C反应l h,同前洗涤，拍干；5) 加酶标记抗体加入按l: 5000稀释的IgG-HRP， 100 pL/ 孔，37"孵育1 h，同前洗涤，拍干；6) 显色加入使用前配制的OPD溶液，100 mL/孔，37"C显 色15 minj7 )终止加2 mol L一1的硫酸，50 p L /孑U终止反应5 min;8) 读数利用酶标仪测定492 mn波段处的吸光值9) 抑制率的计算灿生,l中,TQ/、 零标准吸光度值-样品或标准液吸光度值 1r^0/抑制率(1% )=零标准吸光度值-空白对照吸光度值x 1 00%然后以P/。为纵坐标，以标样的自然对数浓度值为横坐标，做 标准曲线。下面以水体中重金属镍含量的快速检测为例加以说明水体样品的前处理取含镍水样IOOO yL，用0.45 jum的微 孔滤膜过滤出去杂质。1) 包被用pH=9. 6，浓度为0， 05 mol L—i的碳酸盐緩冲液 稀释抗原至5ng/mL， 100 pL/孔，包被到酶标板上，4"C放置 12 h或37T水浴3 h;2) 洗涤倾去板孔液，用pH=7.4,浓度为0.15 mol . L—1 ， PBS-T洗涤3次，5 min/次，拍干；3) 封闭加入10%小牛血清作为封闭液，200 pL/孔，37 X:孵育3 h，同前洗涤，拍干；4 )加样将样品和最佳稀释浓度的抗血清按1:1的体积充分 混合，室温下反应30 min， 100 |nL /孔，37"C反应1 h，同前洗涤，拍干；5)加酶标记抗体加入按1: 5000稀释的IgG-HRP， 100 pL/孔，371C赙育1 h，同前洗涤，拍干；6)显色加入4吏用前配制的0PD溶液，100 jiL/孔，37^显 色15 min;7 )终止加2 mol I/1的硫酸，50 ja L /孑L，终止反应5 min;8) 读数利用酶标仪测定492 nm波段处的吸光值；9) 数据处理才艮据抑制率计算公式和标准曲线求出相对应样 品的浓度。
权利要求
1.一种镍离子人工抗原螯合剂的合成方法，其特征包括下列步骤1)6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉的合成将2g 4-硝基邻苯二胺和1.13g丁二酮放入250mL单口烧瓶中，以50mL无水乙醇为溶剂，加热回流2h，冷却至室温后抽滤，加30mL无水乙醇结晶提纯，所得产物即为6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉；2)6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的合成取0.5g第一步产物6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉、0.202g偶氮二异丁腈与1.14g N-溴代琥珀酰亚胺置于干燥的250mL单口圆底烧瓶中，再取40mL四氯化碳加入烧瓶中，装上回流冷凝管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到80℃的油浴中，强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后，将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水浴锅中蒸馏、冷却，得6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉；3)6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加入1.99mL亚氨基二乙酸二乙酯、10mL干燥的乙腈和2.63g无水碳酸钾粉末；搅拌下向反应混合液中滴加溶有1.805g 6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的10mL干燥乙腈，回流8-10h，冷却，滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体；往上述油状液中加入含3.48g结晶氢氧化钡的饱和溶液，室温下充分搅拌至油状液体均转化为白色沉淀，抽滤钡盐并用蒸馏水充分浸泡、洗涤；然后将此钡盐转移到15mL蒸馏水中，将混合物加热煮沸，加入硫酸至清液中不再出现混浊，过滤除去硫酸钡，再用沸水煮洗硫酸钡残渣3次，将滤液和洗涤液合并，冰箱中冷却8-10h，得到6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；4)6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成将100mL乙醇和2.025g 6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉加入到250mL装有温度计、机械搅拌器的三口瓶中，加入1.2g钯碳催化剂和5.29g水合肼，不断搅拌，在80-85℃条件下反应4h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；5)6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成取5.05g溴乙酰溴溶于30mL三氯化碳中，2.105g碳酸氢钠溶于100mL水中，冰浴中将碳酸氢钠溶液缓慢滴加到溴乙酰溴溶液中，取18.722g 6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉装入三口烧瓶中，温度保持在50-60℃，快速搅拌的同时把溴乙酰溴和碳酸氢钠混合液缓慢地滴入6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氢氧化钠溶液控制反应体系的pH为12.0，滴加完毕，升温到90℃，搅拌，将溶剂全部蒸出，加入50mL浓盐酸，过滤分离出氯化钠，然后往盐酸提取液中加入150mL无水乙醇，产生白色沉淀，4℃存放8-10h，用50％的乙醇水溶液重结晶，得6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；
2. 用权利要求1所述的合成的螯合剂合成镍人工抗原的方法， 其特征包括下列步骤1) 重金属镍半抗原的合成取6-溴乙酰氨基-2， 3-(N, N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔 啉0. 8 mg，用pH=7. 5，浓度为0.1 mol . L—i的磷酸盐緩冲液定容 至2 mL,加入0. 4 mg的硝酸镍，搅拌使其混合均匀，反应30 min;2) 重金属镍人工抗原的合成将5 mg牛血清白蛋白用pH=9. 6的磷酸盐緩沖液定容至2 mL， 室温下，将其緩慢加入半抗原溶液中，并用氢氧化钾调节pH-9. 5， 室温下搅拌反应20 h，即得重金属镍人工抗原；3) 重金属镍包被抗原的合成将5 mg人血清白蛋白用pH=9. 6的磷酸盐緩沖液定容至2 mL， 室温下，将其緩慢加入半抗原溶液中，并用氢氧化钾调节pH=9. 5， 室温下搅拌反应20 h，即得重金属镍包被抗原；
3. 用权利要求2所述的合成的镍人工抗原制g单克隆抗体 的方法，其特征包括下列步骤1)小鼠免疫及抗血清制备选用6周龄雌性BALB/c小鼠8只，将人工抗原与佐剂按1: 1 体积比混合，注射器双推法使其混合均匀，初次免疫将人工抗原 与完全佐剂乳化，腹腔、皮下、颈部多点注射，每只小鼠注射0,2 mL,第一次免疫3周后进行第二次免疫，剂量和途径同第一次，但从第二次免疫开始佐剂换用不完全佐剂，每隔两周分别进行第 三次、第四次免疫，第四次免疫后采血清，检测效价，取效价高的继续加强免疫，加强免疫时抗原不加任何佐剂；加强免疫3天后，摘眼J^l小鼠血液于灭菌的康氏管内，室 温放置lh，在超净工作台用无菌管把血块和管壁剥离，37T恒温 2 h后，4。C水箱中静置8-10 h，使血清充分析出，收集血清，将 血清1000 rpm/min离心10 min，收集上清，将血清分装，-20匸 保存；2)间接ELISA法检测抗血清效价包被用pH=9. 6,浓度为0. 05 mol L—i的碳酸盐緩冲液将包 被抗原稀释至2 pg'mL—、 100 pL/孔，包被到酶标板上，41C反 应12 h或37"C水浴3 h;洗涤倾去板孔液，用pH=7. 4,浓度为0.15 mol . L—1 ,含 0. 05°/。吐温-20的磷酸盐緩沖液洗涤3次，5 min/次，拍干；封闭加入10%小牛血清作为封闭液，200 pL/孔，371C孵 育3 h，同前洗涤，拍干；加抗血清抗血清按400、 800、 1600、 3200、 6400、 12800、 25600、 5"00倍稀释，100 juL/孔，设置空白对照，并用正常小鼠 血清作为阴性对照，37"C孵育1 h，同前洗涤，拍干；加酶标记抗体加入按1: 5000稀释的用辣根过氧化物标记的 羊抗小鼠，100 jLiL/孔，371C孵育1 h，同前洗涤，拍干；显色加入4吏用前配制的邻苯二胺底物，100 jLiL/孔，37"C 显色15 min;终止加2 mol ■ L—i的石危酸，50 nL /孑L，终止反应5 min;读数利用酶标仪测定492 nm波段处的吸光值；3) 细胞融合在无菌条件下，制备祠养细胞，取效价高的BALB/c小鼠，最 后加强免疫三天后，制备免疫脾细胞，并准备对数生长期的Sp2/0 骨髓瘤细胞；取1. 0 x 108个脾细胞，2. 0-5. 0 x 107个Sp2/0细胞，按1-10: l的比例加入到50 mL融合管中，轻轻摇匀，1000 r/min离心10 min，弃上清液；将融合管置于掌心轻轻摩擦，以防止细胞沉淀，使细胞松散 均匀成糊状；将融合管置于371C水浴中，吸取1 mL 37"C预热的聚乙二醇 4000，緩慢加入融合管中，边加边轻轻摇匀，60 s内加完；在90 s内緩慢滴加无血清的DMEM培养基30-40 mL，终止融 合，37匸静止10 min后，1000 r/min，离心10 min，弃上清液；将融合管置于手掌，摩擦使^^>*，加入60-80 mL HAT培养 基使细胞悬浮、混匀，分装于带有饲养细胞的96孔细胞培养板， 100 nL/孔，于37C、 5% 0)2培养箱中培养;4) 采用有限稀释法筛选阳性孔及克隆 制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，细胞计数，用含12°/。血清的HT培养基稀释至每亳升含10、 15和20个细胞3种不同的稀释度， 分装于有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度分装32孑L， 100 juL/孔；于371C、 5% CO2培养箱中培养7-10天，出现肉眼可见的克隆 即用间接ELISA法检测抗体效价，以样品孔的OD值大于阴性孔的2倍为阳性；取抗体检测为阳性孔的细胞进行扩大培养并冻存；5) 腹水型单克隆抗体的制备 腹腔注射液体石蜡，每只小鼠O. 5 mL;7-10天后用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞腹腔接种，每只 小鼠注射5乂105个细胞；间隔5天后，观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以 手触摸时，皮肤有紧张感，即用16号针头采集腹水，连续采2-3 次，每只小鼠采5-10 mL腹水;将腹水在2000 rmp/min条件下离心5 min，除去细胞成分和 其他沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80C冻存，或冻干保存；6) 腹水型单克隆抗体的纯化用微孔滤膜过滤腹水，除去较大的凝块及脂肪滴，在4<C， 10000 rmp/min的条件下离心15 min，除去细胞残5查及小颗丰立物质；饱和硫酸铵法对腹水型单克隆抗体进行粗提取；DEAE离子交换层析法对腹水型单克隆抗体进一步纯化；
4.如权利要求3所述的镍单克隆抗体的应用，其特征是对含镍 污水的检测按如下步骤进行1) 包被用pH=9. 6，浓度为0. 05 mol L—i的碳酸盐緩冲液 稀释抗原至5ng/mL， 100 pL/孔，包被到酶标板上，4。C放置 12 h或37"C水浴3 h;2) 洗涤倾去板孔液，用pH=7.4，浓度为0. 15 mol L—1 ，含O. 05%吐温-20的磷酸盐緩冲液洗涤3次，5 min/次，拍干； 3)封闭加入10%小牛血清作为封闭液，200 pL/孔，3"7r孵育3 h，同前洗涤，拍干；(4 )加样将样品和最佳稀释浓度的抗血清按1:1的体积充分混合，室温下反应30 min, 100 pL /孔，37T反应1 h，洗涤3次，5 min/次,拍干；(5) 加酶标记抗体加入按1: 5000稀释的辣根过氧化物标记 的羊抗小鼠，100 pL/孔，37'C孵育1 h，同前洗涤，拍干；(6) 显色加入使用前配制的邻苯二胺底物，100 pL/孔，37 1C显色15 min;(7 )终止加2 mol I/1的硫酸，50 p L /孑U终止反应5 min;(8) 读数利用酶标仪测定492 nm波段处的吸光值；(9) 数据处理根据抑制率计算公式和标准曲线求出相对应的 样品浓度。
全文摘要
一种镍离子人工抗原螯合剂的合成及镍单克隆抗体的制备。以4-硝基邻苯二胺为原料经过一系列反应化学合成了6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉，简称BATDQ，作为合成镍人工抗原的双功能螯合剂，利用BATDQ的四乙酸和溴乙酰氨基结构螯合镍离子及载体蛋白质，获得人工抗原。然后通过人工抗原免疫BALB/c小鼠，并运用细胞融合、细胞克隆等技术获得对应于镍的单克隆抗体，用于检测环境、食品中镍的残留。本发明具有快速、灵敏、成本低、特别适合大批量现场快速检测的特点，并且本发明中的镍人工抗原制备方法简单，成本低，而单克隆抗体的制备技术相对比较成熟，便于规模化生产，检测技术简单，易于推广。
文档编号G01N33/531GK101597266SQ200910101118
公开日2009年12月9日 申请日期2009年7月21日 优先权日2009年7月21日
发明者力 刘, 姚嘉赟, 车晓青, 明 郭 申请人:浙江林学院