专利名称：西瓜细菌性果斑病菌免疫pcr的检测试剂盒和试剂盒使用方法
技术领域：
本发明是一种西瓜细菌性果斑病菌的基因检测试剂盒，属于植物病原菌 的才企测4贞i或，专——4十只十西瓜纟田菌'〖生果扭王病菌(Acidovorax avenae subsp. citrulli, Aac)的;f金测。适用于西瓜细菌性果斑病菌的田间预防及 进出口植物一企疫中Aac快速4企测。
背景技术：
西瓜细菌性果斑病又称细菌斑点病、西瓜水浸病、果实腐斑病等，是西 瓜、籽瓜风险最高的一种种子传播病害。苗期和成抹均可发病。瓜苗染病沿 中脉出现不规则褐色病变，有的扩展到叶缘，从叶背面看呈水渍状，有时被 一个黄色组织带包围。种子带菌的瓜苗在发病后l-3周即死亡。西瓜果实染 病，初期在果实上部表面现数个几毫米大小灰绿色至暗绿色水渍状斑点，后 迅速扩展成大型不规则的水浸状斑，3~5天内便布满除接触地面部分的整 个果面。早期形成的病斑老化后表皮龟裂，常溢出黏稠、透明的琥珀色菌脓， 果实很快腐烂。该病多始于成瓜向阳面，与地面接触处未见发病，瓜蔓不萎 蔫，西瓜细菌性果斑病的病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp. citrulli, A. a. c )。该菌属原核生物界(Procaryotae )、薄壁菌门
(Gracilicutes )、 暗细菌纲 (Scotobacteria )、 假单孢菌科
(Pseudomonadaceae )、嗜酸菌属(Acidovorax )。
由于该病主要通过种子带菌进行远距离传播，且病瓜种子带菌率较高， 所以对种子进行严格检测是防止该病害传播的最重要手段。目前国内对西瓜果斑病菌检测采用的方法主要有育苗检测、分离培养片企测、免疫血清学和
PCR检测等方法。育苗检测、分离检测所需检测时间较长，无法满足多批次 种子进出口检测要求；免疫血清学如ELISA检测灵敏度相对较低，有时甚至 出现假阴性现象。而只有少量种子携带病原这一实际情况，更使得以上检测 方法的灵敏度和检出率受到限制，发展一种将病原富集和基因水平检测有效 结合的方法，是进出口种子西瓜细菌性果斑病菌检测急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种西瓜细菌性果斑病菌 免疫PCR检测试剂盒。以克服现有的植物病原菌检测方法灵敏性低、特异性 差、费时不稳定的不足，将病原富集和基因水平检测有效结合的方法，用免 疫学方法先将样品中的病原富集，然后进行PCR扩增，可以极大的提高检测 灵敏度，同时大大提高了种子检测的效率。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为 一种西瓜细菌性果斑病菌 免疫PCR检测试剂盒，其主要特点是包括有8-10 x PCR緩冲液；氯化镁20-25 國1/L; dNTP 8-10 mmol/L; Taq酶1-5 IU/uL;引物 5， -GACCAGCCACACTGGGAC-3， 8-10 pmol/uL;引物
5， -CTGCCGTACTCCAGCGAT-3， 8-10pmol/uL;双蒸水99%~100%;包被了 Aac单克隆抗体检测PCR管3个；包被了 Aac单克隆抗体阳性对照PCR管3 个；包被了 Aac单克隆抗体阴性对照PCR管3个；阳性对照1管；阴性对照
i管；
使用该试剂盒对参试细菌进行免疫PCR扩增，西瓜细菌性果斑病菌产生 分子量为360bp的特异性扩增产物。
其扩增条件是PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放 DNA作为扩增模板；PCR扩增条件94。C变性20秒，35。C退火20秒，72°C
6延伸35秒，35次循环完成后72。C延伸7分钟，最后4。C保持。
一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，所述使用方 法的步骤为
(1 )加样品孵育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的Aac;
(2 ) PCR扩增，PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放
DNA作为扩增模板；
(3 ) 1-1. 5°/。琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析； (4 )对条带进行分析得出结论；
若有360bp扩增条带，则判断为西瓜细菌性果斑病菌。 进一步，所述的西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法， 所述的PCR管包被Aac单克隆抗体的具体步骤为
(a) 用包被緩冲液按照1: 100-300稀释Aac单克隆抗体，抗体浓度为 0. 4-0. 8mg/ml，将稀释好的抗体按照每管50 u L加入PCR管室温4小时或4 'C过夜包^^抗体。
(b) 包被緩冲液配方为碳酸钠1.59g,碳酸氢钠2.93g,叠氮化钠0. 2 g，溶于1000ml PBST緩沖液中，调pH值到9. 6。配制PBST:氯化钠8. 0 g, 无水磷酸氢二钠1. 15 g，无水磷酸二氢钾0. 2 g，氯化钾0. 2 g，吐温-20 0. 5 毫升，加双蒸水到1000ml，调pH值到7. 4。
进一步，所述的西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法， 所述的加样品將育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的Aac的具体步 骤为
a) 样品制备方法为按照每两克种子加入2tnl提取緩沖液的比例，研 磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清，5000rpm(转/每分 钟)离心5分钟，用100 u L重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增；
b) 抽提緩沖液配方为:Na2SO30. 13g/ml,聚乙烯吡咯烷酮(PVP ) 2g/ml叠氮化纳0. 02g/ml，鸡蛋清蛋白与吐温-20 ( tween-20)各0. 5ml/L， pH为 7.4,抽提緩冲液使用量根据需要配置， 一般种子和緩沖液的重量比约为1: 2-10。
c)加样品50uL,在室温或37。C的条件下在緩冲液中孵育2小时，抗体 会特异性捕捉和富集样品中的Aac;
一种西瓜细菌性果斑病菌基因组DNA提取方法，步骤为
A. 取l. 5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm(转/每分钟)离心1 分钟，丟去上清夜，收集菌体。
B. 加入400ul裂解液(40mM三轻甲基氨基曱烷-醋酸(Tris-醋酸)，20mM 醋酸钠，lmM乙二胺四乙酸(EDTA ) ， 1%十二烷基石黄酸钠(SDS ) , pH7. 8，混匀， 置于37'C水浴1小时。
C. 然后加入20Oul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm(转/每分钟) 离心15分钟。
D. 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
E. 加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8. 0)， -20度保存1 小时后，13000rpm(转/每分钟)离心15分钟，弃上清液，沉淀用70°/。乙醇洗 2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4。C保存备用。
西瓜纟田菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp. ci trul 1 i ， Aac )免 疫PCR检测试剂盒，属于农作物病害防治和植物检疫范畴，基因位于16S rDNA。使用本发明试剂盒对8个参试菌林进行检测，Acc得到360bp特异性 目标条带，其余菌抹无产物；对26个ELISA检测阳性样品进行验证，符合 率为98°/。，且不符合样品均为ELISA未有效检测样品。该试剂盒集病原浓缩、 特异性抗体识别、PCR扩增为一体，是一种灵敏度极高、检测速度快、结果 准确、使用方便的试剂盒，尤其适用于植保部门和进出口检疫部门，对病原 含量比较低的样品进行快速西瓜细菌性果斑病菌的鉴定。本发明的有益效果是本发明西瓜细菌性果斑病菌的检测试剂盒，涉及 一种检测危险性植物病原菌的分子技术，尤其是能快速、简便、准确的检测 病原菌的试剂盒，在10小时内就可以完成才企测。
本发明提供了一种依赖PCR的分子检测试剂盒，克服现有的植物病原菌 检测方法灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足。该试剂盒能快速、灵敏、 准确的检测到病原菌，并直接可从植物种子、组织中检测病原菌。大大简化 了检测程序，提高了我国口岸的检疫水平，同时为病害防治策略的制定提供 了依据。
通过对西瓜细菌性果斑病菌的特异性一企测，引物Aacpl和Aacp2和优化 的PCR条件对目标菌抹扩增得到了一段长360bp的PCR产物，可以特异的检 测目标菌。但是对于8种类非目标菌，均无扩增产物。
通过灵敏度的检测，对西瓜细菌性果斑病菌纯菌液模拟带菌种子提取液 的直接PCR和免疫PCR检测比较，发现直接进行PCR扩增的最低检出限为 3600个细菌/ml，而免疫PCR的最低检出量是600个细菌/ml。
通过对西瓜种子检测，均可从带菌种子中准确稳定的检测到360bp的 PCR产物，和ELISA检测符合率为98°/。，且有2%的ELISA未检测到的带菌种 子，该试剂盒也可以检测到目标条带，说明该试剂盒比ELISA试剂盒更加灵 敏。
图1是试剂盒使用流程图2是本试剂盒引物特异性的验证和PCR条件优化；
A. a. c菌林DNA的PCR扩增结果 M: 100bp DNA ladder D: A. a. c菌才朱DNA
图3是模拟带菌种子提取液的直接PCR检测灵敏度结果；其中M: lOObp DM ladder; A: 3600cells/ml; B: 360cells /ml; C: 36cells /ml ; D: 3.6cells /ml E: 3. 6 x lO-lcells /ml; F: 3. 6 x 10-2cells/ml; G: 3. 6x 10-3cells/ml 图4是模拟带菌种子提取液的免疫PCR检测灵敏度结果； 其中M: lOObpDNA ladder; A: <60000cells/ml; B: < 6000cells /ml;C:《600cells /ml; D:《60cells /ml ; E: "cells /ml ; F: < 0. 6cells/ml ; G:《0. 06cells/ml 图5对八种非Aac菌林进行特异性验证结果；
其中M: lOObp DNA ladder P, 1,3: Aac, 2， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10分 别为丁香^f艮单胞杆菌丁香致病型，番茄细菌性溃疡病，番茄细菌性叶斑病菌， 番茄细菌性掩痂病，十字花科蔬菜黑腐致病变种，大豆细菌斑疹病，丁香假 单胞杆菌丁香致病型，甜瓜细菌性叶斑病菌
图6A对出口 IO个黑瓜籽检测；
图6B对出口 IO个西瓜种子检测；
图6C对5个田间籽瓜样品检测。 其中M: Marker, P: Aac对照
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释 本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，包括有10 x PCR緩冲液；氯化镁25 mmol/L; dNTP 10咖ol/L; Taq酶5 IU/uL;引 物5， -GACCAGCCACACTGGGAC-3' 10 p咖l/uL;引物
5， -CTGCCGTACTCCAGCGAT-3， 10pmol/pL;双蒸水99%~100%;包被了 Aac单克隆抗体的检测PCR管3个；包被了 Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3 个；包被了 Aac单克隆抗体的阴性对照PCR管3个；阳性对照1管；阴性对
照1管。
实施例2 —种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，包括有8 x PCR緩沖液；氯化4美20 mmol/L; dNTP 8mmol/L; Taq酶1 IU/uL;引物 5， -GACCAGCCACACTGGGAC-3， 8pmol/uL;引物
5， -CTGCCGTACTCCAGCGAT-3， 8 pmol/uL;双蒸水99%~100%;包被了 Aac 单克隆抗体的检测PCR管3个；包被了 Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3 个；包被了 Aac单克隆抗体的阴性对照PCR管3个；阳性对照1管；阴性对 照1管。
使用该试剂盒对参试细菌进行免疫PCR扩增，西瓜细菌性果斑病菌产生 分子量为360bp的特异性扩增产物。
其扩增条件是PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放 DNA作为扩增模板；PCR扩增条件94。C变性20秒，35。C退火20秒，"。C 延伸35秒，35次循环完成后72。C延伸7分钟，最后4匸保持。
实施例3:西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，其步 骤为
(1 )加样品50 u L室温或37'C孵育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样 品中的Aac;样品制备方法为按照每两克种子加入2ml提取緩冲液的比例， 研磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清，S000rpm(转/每 分钟)离心5分钟，用100uL重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增。抽提緩冲 液配方为Na2SO30. 13g/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP ) 2g/ml，叠氮化纳 0. 02g/ml，鸡蛋清蛋白与吐温-20 ( tween-20)各0. 5ml/L， PH 7. 4，抽提緩 冲液使用量根据需要配置， 一般种子和緩冲液的重量比约为1: 2-10。
(2)PCR扩增，PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放DNA作为扩增模板；PCR扩增条件94。C变性20秒，35。C退火20秒，72 。C延伸35秒，35次循环完成后72。C延伸7分钟，最后4。C保持。
(3 ) 1-1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；
(4)对条带进行分析得出结论，若有扩增条带，则判断为西瓜细菌性 果斑病菌。
实施例4:见图2，试剂盒性能测定，用提取的Aac基因组DNA作为模 板，按照94X:变性20秒，35。C退火20秒，72。C延伸35秒，35次循环完成 后72。C延伸7分钟，最后4'C保持的PCR条件进行扩增，对PCR条件进行测 试，结果发现，该PCR参数适合Aac的PCR扩增。
西瓜细菌性果斑病菌基因组DNA提取方法如下
A. 取1. 5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm(转/每分钟)离心1 分钟，丟去上清夜，收集菌体。
B. 加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠，lmM乙二胺四乙酸 (EDTA) ,1°/。十二烷基磺酸钠(SDS) ,pH7,8)混匀，置于37。C水浴1小时。
C. 然后加入200ul5raol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm(转/每分钟) 离心15分钟。
D. 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
E. 加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8. 0)， -20度保存1 小时后，13000rpm(转/每分钟)离心15分钟，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗 2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4。C保存备用。
实施例5:见图3,模拟种子带菌的直接PCIU全测。各取A到G这7个 不同浓度梯度纯菌液3"L， (A: 60000cells/ml， B: 6000cells /ml, C: 600cells /ml， D: 60cells /ml, E: 6cells /ml, F: 0.6cells/ml, G: 0. 06cells/ml )，与47 u LPBS充分混合后，模拟50 y L的种子抽提液，各 取3 ti L作为模板直接进行PCR扩增，产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳及成像系统分析，结果显示，只有A出现目标条带，其最低;f企出限为3600个细菌/ml。 PCR条件为94。C裂解20分钟，94。C变性20秒，35。C退火20秒，72°C 延伸35秒，35次循环完成后72。C延伸7分钟，最后4'C保持。
实施例6:见图4,模拟种子带菌的免疫PCR检测。各取A到G这7个 不同浓度梯度纯菌液3uL， (A: 60000cells/ml， B: 6000cells /ml， C: 600cells /ml， D: 60cells /ml, E: 6cells /ml, F: 0.6cells/ml， G: 0. 06cells/ml ),与47 w LPBS充分混合后，才莫拟50 u L的种子抽才是液，然 后加入已包被了 A. a. c—抗的PCR管中进行孵育。然后用免疫PCR法扩增， 产物经1-1. 5%琼脂糖凝胶电泳及成像系统分析，结果发现检测灵敏度为 600cells/ml。
PCR条件为94。C裂解20分钟，94"C变性20秒，35。C退火20秒，72°C 延伸35秒，35次循环完成后72。C延伸7分钟，最后4'C保持。
实施例7:见图5，对8种类非Aac供试菌抹的验i正检测
供试菌林丁香假单胞杆菌丁香致病型(Pseudomonas syringae pv Syringae )， 番痴纟田菌性溃疡病 (Corynebacteri腿 michiganense pv. michiganense )， 番^S纟田菌性叶斑病菌(Pseudomonas. syringae pv tomato )，番痴纟田菌性掩痂病(Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria ), 十字花科蔬菜黑腐致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris ), 大豆纟田菌斑渗病(Xanthomonas campestris phaseoli) , 丁香假单胞杆菌 丁香致病型(Pseudomonas syringae pv Syringae), 甜瓜细菌性叶斑病菌 (Pseudomonas syringae pv. lachrymans )。
PCR反应条件为94。C预变性20分钟，94。C变性20秒，35。C退火20秒， 72。C延伸35秒，35次循环完成后72。C延伸7分钟，最后4'C保持。扩增产 物用1-1. 50/。琼脂糖凝胶电泳及UVP凝胶成像系统分析。
检测结果表明，以上八种供试菌，均未检出目标条带，说明试剂盒有
13比较好的专一性。
实施例8:见图6A，对出口的IO批黑瓜籽进行一验证冲企测 随机抽取经过ELISA检测的出口黑瓜子10批各30克进行检测，PCR反 应条件为94。C预变性20分钟，94。C变性20秒，35。C退火20秒，72。C延 伸35秒，35次循环完成后72。C延伸7分钟，最后4。C保持，扩增产物用1-1. 5% 琼脂糖凝胶电泳及UVP凝胶成像系统分析，结果表明，所检测的3批黑瓜籽 携带Aac，但ELISA;f企测结果只有两批。
实施例9:见图6B，对出口的IO批西瓜种子进行一睑证;险测 随机抽取经过ELISA检测的进口西瓜籽10批各30克进行检测，PCR反 应条件为94。C预变性20分钟，94。C变性20秒，35。C退火20秒，72。C延 伸35秒，35次循环完成后72。C延伸7分钟，最后4。C保持，扩增产物用1-1. 5% 琼脂糖凝胶电泳及UVP凝胶成像系统分析，结果表明，所检测的西瓜种子有 5批携带Aac,但是ELISA检测结果只有4批携带。
实施例10:见图6C，对田间采集的籽瓜、黄瓜、西瓜样品进行检测 对田间采集的籽瓜、黄瓜、西瓜样品5份进行Aac检测，PCR反应条件 为94。C预变性20分钟，94。C变性20秒，35。C退火20秒，72。C延伸35 秒，35次循环完成后72。C延伸7分钟，最后4。C保持，扩增产物用1-1.5% 琼脂糖凝胶电泳及UVP凝胶成像系统分析，结果表明，所检测的样品西瓜籽 均携带Aac,和ELISA检测结果完全符合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。序列表
SEQUENCE LISTING
< 110 〉 兰州慧盟生物科技有限公司
<120〉 西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR的检测试剂盒和试剂盒使用方法
<130〉
<160> 1
<170〉 Patentln version 3.5 <210〉 1 <211> 360 <212〉 腿
<213> 密执安棒形杆菌密执安亚种 <400〉 1
gaccagccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 60
ttttgg汪ca汪tgggcgcaag cctgatccag ccatgccgcg tgcaggatga aggccttcgg 120 gUgtaaact gcttttgtac ggaacgaaaa gccttcttct aataaagggg ggtcatgacg 180 gtaccgtaag aataagcacc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggtg 240 caagcgtUa tcggaatUc tgggcgtaaa gcgtgcgcag gcggtg"gt aagacagatg 300 tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc atttgtgact gcatcgctgg agtacggcag 360
权利要求
1.一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，其特征是包括有8-10×PCR缓冲液；氯化镁20-25mmol/L；dNTP 8-10mmol/L；Taq酶1-5IU/μL；引物5’-GACCAGCCACACTGGGAC-3’8-10pmol/μL；引物5’-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3’8-10pmol/μL；双蒸水99％～100％；包被了Aac单克隆抗体的检测PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体的阴性对照PCR管3个；阳性对照1管；阴性对照1管；使用该试剂盒对参试细菌进行免疫PCR扩增，西瓜细菌性果斑病菌产生分子量为360bp的特异性扩增产物；其扩增条件是PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放DNA作为扩增模板；PCR扩增条件94℃变性20秒，35℃退火20秒，72℃延伸35秒，35次循环完成后72℃延伸7分钟，最后4℃保持。
2. —种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述使用方法的步骤为(1)加样品孵育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的Aac病菌； (2 ) PCR扩增，PCR循环增加20分钟，94 :慑氏度高温裂解细菌，释放 DNA作为扩增模板；(3 ) 1-1. 5°/。琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析； (4)对条带进行分析得出结论；若有360bp扩增条带，则判断为西瓜 细菌性果斑病菌。
3. 如权利要求2所述的西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述的PCR管包被Aac单克隆抗体的具体步骤为 (a)用包被緩冲液按照1: 100-300稀释Aac单克隆抗体，抗体浓度为.0. 4-0. 8mg/ml,将稀释好的抗体按照每管50 u L加入PCR管室温4小 时或4"C过夜包^皮抗体。 (b )包被緩冲液配方为碳酸钠1. 59g,碳酸氢钠2. 93 g，叠氮化钠0. 2 g, 溶于1000ml PBST缓沖液中，调pH值到9. 6;配制PBST:氯化钠8. 0 g，无水磷酸氢二钠1.15 g，无水磷酸二氢钾O. 2 g，氯化钾O. 2 g， 吐温-20 0.5毫升，加双蒸水到1000ml，调plH直到7. 4。
4. 如权利要求2所述的西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方 法，其特征是，所述的加样品孵育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品 中的Aac的具体步骤为a) 样品制备方法为按照每两克种子加入2ml提取缓冲液的比例，研 磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清，5000rpm离心 5分钟，用100uL重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增；b) 抽提緩冲液配方为Na2SO30. 13g/ml,聚乙烯吡咯烷酮2g/ml,叠氮 化纳0. 02g/ml，吐温-20各0. 5ml/L, PH 7. 4，种子和緩沖液的重量比 为1:2-10。
5. —种西瓜细菌性果斑病菌基因组DNA提取方法，其特征是，步骤为A. 取1. 5ml菌体培养物于一灭菌离心管中，12000rpm离心1分钟，丢去 上清夜，收集菌体；B. 加入400ul裂解液，40mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，SOmM醋酸钠，lmM 乙二胺四乙酸，1°/。十二烷基石黄酸钠，pH7.8，混匀，置于37。C水浴1小时；C. 然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；D. 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；E. 加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M ,pH8. 0, -20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70°/。乙醇洗2次；置 于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4。C保存备用。
全文摘要
本发明是一种西瓜细菌性果斑病菌的基因检测试剂盒，属于植物病原菌的检测领域，专一针对西瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli，Aac)的检测。一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，其主要特点是包括有8-10×PCR缓冲液；氯化镁20-25mmol/L；dNTP 8-10mmol/L；Taq酶1-5IU/μL；引物5’-GACCAGCCACACTGGGAC-3’8-10pmol/μL；引物5’-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3’8-10pmol/μL；双蒸水99％～100％；包被了Aac单克隆抗体的检测PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体的阴性对照PCR管3个；阳性对照1管；阴性对照1管。本发明的优点是能快速、简便、准确的检测病原菌的试剂盒，在10小时内就可以完成检测。
文档编号G01N33/577GK101603091SQ20091014189
公开日2009年12月16日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日
发明者箐 刘 申请人:兰州慧盟生物科技有限公司