专利名称：同时对人21及18号染色体数目进行检测的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及检测染色体数目的方法，尤其涉及应用多重实 时荧光PCR相对定量法在同一反应管中同时检测人21及18号染色体数目的方法。
背景技术：
21及18三体综合征是胎儿出生缺陷最常见的两种染色体病，发病率分别为 1/600 1/800和1/6000，表现为21或18号染色体数目的异常，即患者在正常两条的基 础上多了一条(或多了部分21/18号易位染色体)。此两种病患者有严重的智力发育迟 缓和多发畸形，患儿早期死亡率高，给家庭和社会带来沉重负担。此两种疾病尚无有效治 疗，主要通过产前诊断来避免缺陷儿的出生。目前主要依靠传统的细胞遗传学方法来检测， 该方法所需培养时间长，出结果慢，费时费力，增加了患者等待结果的焦虑。荧光原位杂交 (FISH)技术费用昂贵、操作技术要求高、存在一定的漏诊率等。近年，分子生物技术的发展 突飞猛进，如短串联重复数目多态性(STR)分析、多重连接探针扩增(MLPA)及比较基因组 杂交(Array-based CGH)技术都有应用于产前诊断遗传疾病的报道，但这些技术由于费用、 设备等局限性，难以普及应用。因此，临床急需准确、快速、高通量、无污染、能大规模应用的 分子检测技术。最近发展而来的实时荧光PCR(Real-time PCR)技术，是在PCR反应体系中加入引 物和相对应的荧光标记的探针.它融汇了 PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术 的高精确定量等优点，直接监测PCR过程中荧光信号的累积量。在PCR反应早期，产生荧光 的水平不能与背景明显地区别，可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的 量，并由此来推断模板分子最初的拷贝数。首先需设定一定荧光信号的阈值，一般阈值设在 扩增对数期并超过无规则噪音线的最高处。如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真正的 信号，它可以定义样本的阈值循环数(CT)。CT的含义是每个反应管内的荧光信号达到设 定的阈值所经历的循环数。21、18三体综合征的21、18号染色体原始拷贝数是其他正常染 色体数目的1. 5倍，因此21、18号染色体基因上的扩增产物量更早到达阈值，Ct值更小，利 用原始拷贝数量上相对定量法，即ACT值法，便可对三体做出检测。Real-time PCR技术已经成为准确检测模板拷贝数、体液游离DNA及肿瘤研究中 基因重复或缺失的一项有力工具。国内也有研究者(廖灿，黄以宁等，实时荧光定量PCR快 速分子诊断唐氏综合征.现代临床医学生物工程杂志，2004，1(K4) :310-312.)通过分管扩 增目的基因及内参基因部分片段，采用实时荧光PCR的方法对21三体的分子诊断进行了初 步探索。但分管实验中的一些因素，如孔间差异、模板加样差异等，都可以导致结果完全不 同，造成错误的判断。此外，吕时铭等在申请号为200510049601. 2、发明名称为〃实时定量 PCR技术来检测人21号染色体的数目的方法"的专利申请中公开了应用实时定量PCR技术 来检测人21号染色体的数目的方法，但是该研究是选择21号染色体上的DSCR4作为目的 基因，1号染色体上的RABIF基因作为参照基因，只能对21号染色体的数目做出检测，且该 研究选择的Taqman探针是3'端采用荧光物质的TAMRA淬灭基因标记，增加了本底信号的干扰，影响结果的正确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时对人21及18号染色体数目进行检测的方法，应 用多重实时荧光PCR相对定量法在同一反应管中同时检测人21及18号染色体数目。本发明所述的一种同时对人21及18号染色体数目进行检测的方法，包括以下步 骤A.样品DNA提取按常规苯酚-氯仿法提取样本的DNA，检测DNA浓度及纯度；B.引物设计和合成选择21号染色体21q21. 3上的淀粉样前蛋白基因(APP基因MIM =188350 ；GeneID 7298)部分片段和18号染色体18pll. 32上的胸苷酸合成酶基因(TYMS基因MIM :104760 ； GeneID :351)部分片段，设计相应引物，使得两基因部分片段在同一管中相互作为内参照 同时扩增；并设计相应的iTaqman探针，探针3'端标记非荧光性的淬灭基因Eclipse，5‘端 标记FAM或HEX荧光基团；其中，针对21号染色体设计的上游引物序列为SEQ ID NO. 1，下游引物序列为SEQ ID NO. 2，相应的Taqman探针序列为SEQ ID NO. 3 ；针对18号染色体设计的上游引物序列 为SEQ ID NO. 4，下游引物序列为SEQ IDN0. 5，相应的Taqman探针序列为SEQ ID NO. 6 ；C.多重实时荧光PCR扩增反应采用25ul反应体系，包含模板DNA 2ul (60ng)，两对引物各300nmol/L，相应 TaqMan荧光探针各200nmol/L，1 X TaqMan通用PCR混合试剂12. 5ul ；该混合试剂中含有热 启动DNA聚合酶、dNTP、MgC12、荧光染料ROX ；每个DNA标本进行3个平行管的扩增；热循环条件为50°C 2分钟，95°C 10分钟，然后95°C 15秒，60°C 1分钟，循环40 次；D.相对定量分析方法采用ABI7500型PCR仪随机附带软件进行荧光相对定量分析；分析参数设定阈值线设在对数期并超过无规则噪音线的最高处，不同批次采用 同一阈值分析，将阈值设定为0. 2 ；基线范围起点为第3个循环，终点为第19个循环；仪器附带软件根据设定参数自动计算出CT值，APP基因部分片段扩增产物与TYMS 基因部分片段扩增产物CT值之差为相对定量指标ACT值，取3个平行管ACT值的平均值； 通过Δ CT值来确定21及18号染色体的数目。本发明还提供了一种同时对人21及18号染色体数目进行检测的试剂盒。本发明所述的一种同时对人21及18号染色体数目进行检测的试剂盒，包括多 重荧光PCR反应液、热启动DNA聚合酶、dNTP、MgC12、荧光染料R0X，其特征在于，还包括 两对引物和相应的Taqman荧光探针；所述第一对引物和相应的探针是针对21号染色体 21q21. 3上的淀粉样前蛋白基因设计的，包括序列为SEQ ID NO. 1的上游引物，序列为SEQ ID N0. 2的下游引物；以及序列为SEQ ID N0. 3的相应Taqman探针；所述第二对引物和相 应的探针是针对18号染色体18pll. 32上的胸苷酸合成酶基因设计的，包括序列为SEQ IDNO. 4的上游引物，序列为SEQ ID NO. 5的下游引物，以及序列为SEQ ID NO. 6的相应Taqman 探针；探针3'端标记非荧光性的淬灭基因EclipSe，5'端标记FAM或HEX荧光基团。目前尚未见到应用多重实时荧光PCR技术同时对人21及18号染色体数目进行检 测的报道。本发明利用多重实时荧光PCR技术比较CT值的相对定量法(八(^值法)，建立 了一种在同一反应管中同时对人21及18号染色体数目进行检测的方法，且Taqman探针的 设计是在3'端采用非荧光性的淬灭基因Eclipse标记，淬灭基团吸收报告基团的能量后 并不发光，大大降低了本底信号的干扰，结果更客观准确。
具体实施例方式本发明所述的一种多重实时荧光PCR相对定量法在同一反应管中同时检测人21 及18号染色体数目的方法，包括以下步骤(I)DNA 提取按常规苯酚-氯仿法提取样本的DNA，例如，采用QIAamp DNA BloodMini Kit 试剂盒(德国Qiagen公司)，按说明书要求提取DNA，用微量核酸蛋白检测仪(NanoDrop ND-1000)检测DNA浓度及纯度，所需DNA纯度要求0D26(1/0D28(1的值为1. 8 2. O ；(2)引物、探针的设计和合成选择21号染色体21q21. 3上的淀粉样前蛋白基因(amyloid precursorprotein gene，APP)部分片段设计的引物序列分别为上游引物5'-CCCAGGAAGGAAGTCTGTACCC-3‘ SEQ ID NO. 1 ；下游引物5'-CCCTTGCTCATTGCGCTG-3‘ SEQ ID N0. 2 ；相应Taqman 探针SEQ ID NO. 35' -(FAM)AGCCATCCTTCCCGGGCCTAGG(Eelipse)-3‘。选择18号染色体18pll. 32上的胸苷酸合成酶基因(thymidylatesynthetase gene, TYMS)部分片段设计的引物序列分别为上游引物5'-TGACAACCAAACGTGTGTTCTG-3‘ SEQ ID N0. 4 ；下游引物5'-AGCAGCGACTTCTTTACCTTGATAA-3‘ SEQ ID N0. 5 ；相应Taqman 探针SEQ ID NO. 65' (HEX)-AAGGGTGTTTTGGAGGAGTTGCTGTGG(Eclipse)-3'。以上引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。(3) PCR 扩增反应APP及TYMS两基因的部分片段在同一反应管中进行扩增，每个标本的DNA进行3 个平行管的扩增，PCR扩增体系如下DNA 模板60ng引物300nmol/L探针200nmol/L1X TaqMan Universal PCR MasterMix(美国 ABI 公司 Cat 4304437) 12. 5uL加水至总体积25 μ 1ΑΒΙ7500 型定量 PCR 仪，热循环条件为50°C 2min,95°C lOmin，然后 95°C 15S,60 0C Imin，循环 40 次。(4)相对定量分析方法采用ABI7500型PCR仪(美国ABI公司)随机附带软件进行荧光相对定量分析。分析参数设定阈值线设在对数期并超过无规则噪音线的最高处，不同批次采用 同一阈值分析，将阈值设定为0. 2 ；基线范围起点为第3个循环，终点为第19个循环；仪器附带软件根据设定参数自动计算出CT值，APP基因部分片段与TYMS基因部 分片段的扩增产物CT值之差为相对定量指标Δ CT值，取3个平行管Δ CT值的平均值；通 过Δ CT值来确定21及18号染色体的数目。(5) APP基因部分片段和TYMS基因部分片段扩增效率的检测以2倍系列稀释6个浓度梯度的正常核型DNA为模板进行该多重实时荧光定量 PCR扩增检测。ΑΒΙ7500软件根据设定自动生成APP基因部分片段和TYMS基因部分片段扩 增产物的标准曲线，该曲线以模板相对浓度的对数为横坐标，CT值为纵坐标，并自动计算出 标准曲线的斜率和相关系数。根据标准曲线的斜率和相关系数来评价两片段的扩增效率。 仪器附带软件计算得出，两条标准曲线的相关系数(R2)分别是0. 997566和0. 994185，均大 于0. 99，表明可信度好，曲线的斜率(slope)分别是-3. 377818和-3. 235760，换算成扩增 效率分别是97.7%和103.7%，均接近100%的PCR扩增效率。因此，两基因部分片段的扩 增效率基本一致，满足采用△ CT值法进行相对定量分析的要求。(6)结果分析APP基因部分片段及TYMS基因部分片段在同一管中进行扩增，按以上参数设置， 软件自动计算两基因部分片段扩增产物的ACT值ACT 值=CTapp-CTtyms用此方法检测三组标本51例正常核型的DNA (A组)，21例21三体综合征的DNA (B 组)和6例18三体综合征的DNA (C组)。结果见表一。A、B、C三组标本Δ CT (Mean士SD)均值分别 为-0. 48 士 0. 14，-1. 26 士 0. 17 和 0. 25 士 0. 12。统计学T-test =B组与A组、C组与A组间均有显著差异(P < 0. 001)，且无交叉重叠。正常核型DNAACT均值(Mean士2SD)范围为-0. 76 -0. 20，该数值在使用同 一试剂盒的条件下是固定的，但在使用不同试剂盒时可以有所不同。当待测标本ACT值 < -0. 76时，判断该标本21号染色体数目为3条；当待测标本ACT值处于-0. 76 -0. 20 之间，判断该标本为正常核型；当待测标本八(^值> -0. 20时，判断该标本18号染色体数 目为3条。本发明的多重实时荧光PCR相对定量法在同一反应管中同时检测人21及18号染 色体数目的方法，验证上述临床标本检测结果的敏感性、特异性、准确率均达百分之百，尚 需进一步扩大样本量。表1.正常核型DNA、21及18号染色体数目为3条的DNA的Δ CT值
权利要求
1.一种同时对人21及18号染色体数目进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤A.样品DNA提取按常规苯酚-氯仿法提取样本的DNA，检测DNA浓度及纯度；B.引物设计和合成选择21号染色体21q21. 3上的淀粉样前蛋白基因部分片段和18号染色体18pll. 32 上的胸苷酸合成酶基因部分片段，设计相应引物，使得两基因部分片段在同一管中相互 作为内参照同时扩增；并设计相应的Taqman探针，探针3'端标记非荧光性的淬灭基因 Eclipse, 5'端标记FAM或HEX荧光基团；其中，针对21号染色体设计的上游引物序列为SEQ ID NO. 1，下游引物序列为SEQ ID NO. 2，相应的Taqman探针序列为SEQ ID NO. 3 ；针对18号染色体设计的上游引物序列为SEQ ID NO. 4，下游引物序列为SEQ IDN0. 5，相应的Taqman探针序列为SEQ ID NO. 6 ；C.多重实时荧光PCR扩增反应采用25ul反应体系，包含模板DNA 2ul(60ng)，两对引物各300nmol/L JgSTaqMan 荧光探针各200nmol/L，IXTaqMan通用PCR混合试剂12. 5ul ；该混合试剂中含有热启动 DNA聚合酶、dNTP、MgC12、荧光染料ROX ；每个DNA标本进行3个平行管的扩增；热循环条件为50°C 2分钟，95°C 10分钟，然后95°C 15秒，60°C 1分钟，循环40次；D.相对定量分析方法采用ABI7500型PCR仪随机附带软件进行荧光相对定量分析；分析参数设定阈值线设在对数期并超过无规则噪音线的最高处，不同批次采用同一 阈值分析，将阈值设定为0. 2 ；基线范围起点为第3个循环，终点为第19个循环；仪器附带软件根据设定参数自动计算出CT值，APP基因部分片段的扩增产物与TYMS 基因部分片段的扩增产物CT值之差为相对定量指标ACT值，取3个平行管ACT值的平均 值；通过Δ CT值来确定21及18号染色体的数目。
2.一种同时对人21及18号染色体数目进行检测的试剂盒，包括多重荧光PCR反应 液、热启动DNA聚合酶、dNTP、MgC12、荧光染料R0X，其特征在于，还包括两对引物和相应的 Taqman荧光探针；所述第一对引物和相应的探针是针对21号染色体21q21. 3上的淀粉样前蛋白基因部 分片段设计的，包括序列为SEQ ID NO. 1的上游引物，序列为SEQ ID N0.2的下游引物；以 及序列为SEQ ID N0. 3的相应Taqman探针；所述第二对引物和相应的探针是针对18号染色体18pll. 32上的胸苷酸合成酶基因部 分片段设计的，包括序列为SEQ ID N0. 4的上游引物，序列为SEQ ID N0. 5的下游引物，以 及序列为SEQ ID N0. 6的相应Taqman探针；探针3'端标记非荧光性的淬灭基因EclipSe，5'端标记FAM或HEX荧光基团。
全文摘要
本发明涉及一种多重实时荧光PCR相对定量法在同一反应管中同时检测人21及18号染色体数目的方法。采用实时荧光PCR技术比较CT值的相对定量法，即ΔCT值法，对人21及18号染色体上的APP及TYMS基因部分片段在同一管中相互作为内参照同时扩增，计算两扩增产物的ΔCT值，对其相对模板量做出判断，通过ΔCT值来确定人21及18号染色体的数目。其优点自动化闭管操作，简单、快速、成本低、无污染、通量大；检测特异性高，灵敏度高，准确可靠，并可同时对人21及18号染色体的数目做出检测。
文档编号G01N21/64GK102086469SQ20091019436
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者孙筱放, 眭建忠 申请人:广州医学院第三附属医院