专利名称：一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法
一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法技术领域：
本发明涉及纳米材料毒性测试技术领域，具体地说，是一种通过转基因斑马鱼 胚胎模型测试纳米材料毒性的方法。
背景技术：
纳米材料是20世纪80年代中期发展起来的新型材料，它既不同于微观原子、分 子，也不同于宏观物质的超常规特性，常定义为在某一维度上尺寸在Inm IOOnm内的 颗粒状、层状材料，它们的尺寸界于微晶材料和原子团簇之间。目前国内外应用较多的 纳米材料主要有碳纳米材料、半导体量子点、纳米氧化物(二氧化钛、二氧化硅、氧化 锌、氧化铝)和纳米铁的化合物等。随着规模化生产和纳米产品的普及，人群的职业接 触和环境暴露的机会将大大增高。纳米材料将进入我们的土壤、空气和水环境，进而不 可避免地进入人体。纳米材料的安全性评价和危险性评定问题已经成为21世纪毒理学的 新课题。目前国内外对纳米材料毒性的研究主要集中在体外细胞以及活体动物上。体外 细胞对材料敏感性强，且试验结果有较大的重复性。但由于体内与体外的差异性，不能 很好的描述材料的体内毒性；活体动物实验一般试验周期长、方法较繁琐。而斑马鱼 作为模式生物具有更多的优势斑马鱼产卵量大、易收集、饲料简单，已经成为一些生 态毒理标准的推荐测试物种，用途十分广泛；斑马鱼体型小，管理成本低，早期胚胎透 明，易于观察，其器官与人器官在结构、生理、分子水平等方面惊人的相似，用来评估 纳米材料对于人的体内毒性十分适合。近年来培育出的斑马鱼flil EGFP品系，其胚胎 的几乎整个循环系统可以在荧光显微镜下发出绿色荧光，使得试验结果可视化，用来评 价纳米材料的毒性更具优势。中国专利公开号CN101481651涉及金属纳米材料毒性检测板及其检测方法，包 括基底、板盖和检测池，其特征在于基底为矩形体容器，在基底内部底面上设有若 干条垂直定位柱使得检测池的边沿定位于基底，板盖的四周设有扣边以扣紧基底边沿； 本发明所述方法充分考虑到了修饰分子在体内的可能存在的降解和代谢因素，通过双步 检测法确认金属纳米颗粒的细胞毒性级别，使今后选择合适的金属纳米颗粒及其修饰分 子都变得标准化、统一化，易于重复和相互比较。中国专利公开号CN101487040涉及检测纳米材料细胞毒性的方法，包括将待 检测细胞种在底部带有微电子传感器的若干个孔板上，然后，将孔板放在细胞分析系统 的检测装置上；监测细胞生长曲线，以得到细胞与孔板的微电极表面贴壁或生长情况； 在细胞贴壁2 30小时后，加入经灭菌处理过的纳米材料的培养液或者缓冲液，继续监 测细胞生长曲线，本发明的检测纳米材料对细胞毒性方法的优点是全过程自动、实时 监测；无需标记；对细胞无创伤，该方法可用于检测多个对象，具有体积小、试样用量 少，成本低廉、检测装置操作简单、方便，可广泛用于高通量、高灵敏度的碳纳米材料 毒性方面的检测，加快了分析速度，并且易于实现在线控制和检测自动化。
本发明首次使用flil EGFP品系斑马鱼胚胎模型检测纳米材料的体内毒性，该 模型比以往的检测模型更简单、经济、直观、周期短，可以评价纳米材料的安全性以及 进一步的机理研究。
发明内容本发明 的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过转基因斑马鱼胚胎模型 测试纳米材料毒性的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法，其具体步骤为(1)向受精6 7小时的斑马鱼胚胎培养液中加入待测纳米材料试液，在人工气 候箱中培养至72hpf或96hpf;其中，hpf表示受精后多少小时；所述的待测纳米材料为任一可能具有生物毒性的纳米粒径物质，包括碳纳米材 料、半导体量子点、纳米氧化物如二氧化钛、二氧化硅；(2)将72hpf或96hpf将胚胎取出，用体积比为4%多聚甲醛固定24 30h，PBS 缓冲液冲洗2 4次，24 48h内固定在载玻片上，荧光显微镜下观察血管；所述的PBS缓冲液为为磷酸盐缓冲液，其原料的组份为NaCl 8g，KC10.2g， KH2PO4 0.24g, Na2HPO4 · 12H20 3.62g,加超纯水至 lOOOmL，pH 为 7.4 ；(3)根据荧光显微镜采集的图像，判断所述纳米材料是否引起血管损伤；其 中与对照组正常发育的斑马鱼胚胎的血管比较，斑马鱼血管表现出断裂、缺失、交错 及分布间距过大等现象，为具有血管损伤；斑马鱼血管没有表现出断裂、缺失、交错， 分布间距相似，为没有血管损伤；其中在所述的步骤(1)中，所述的斑马鱼胚胎为转基因斑马鱼(flil EGFP品 系，其胚胎的几乎整个循环系统可以在荧光显微镜下发出绿色荧光)所产；所述的步骤(1)还包括如下步骤在加入纳米材料试液的同时做对照试验，在 胚胎发育的过程中进行对比观察，记录胚胎死亡、畸形、孵化等指标，并及时清除死亡 胚胎以避免感染其他胚胎引起死亡；在所述的步骤(1)中，加入待测纳米材料试液后，28°C下以光照黑暗= 14h IOh持续培养至72hpf或96hpf;在所述的步骤(2)中，将胚胎浸在体积比为4%的多聚甲醛前，将胚胎周围的待 测液体尽量清除干净；在所述的步骤(2)中，PBS缓冲液冲洗时每次五分钟，冲洗三次，将胚胎表面的 多聚甲醛冲洗干净，以免影响荧光显微镜下观察效果。与现有技术相比，本发明的积极效果是(1)本发明的原材料易得，斑马鱼繁殖速度快，产卵量大、易收集，饲养简单， 管理成本低，是一种理想的脊椎动物模式生物；(2)本发明的待测纳米材料给药方式简单、用量少，可将纳米材料直接加入到胚 胎培养液中，在96孔板中每孔只需加入200 μ L ；(3)本发明的检测方法简便，试验周期短，加入待测纳米材料后经过培养、固 定，在第四天即可进行血管观察；
(4)本发明的应用前景广泛，直接使用可以在荧光显微镜下发出绿色荧光的 flil:EGFP品系斑马鱼，避免了染色步骤，试验过程更加简单，对快速评价纳米材料安全 性具有重要意义。
具体实施方式以下提供 本发明一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法的具 体实施方式。实施例1一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试CdSe量子点纳米材料毒性的方法，具体步 骤为(1)健康性成熟的flil EGFP品系斑马鱼按雌雄1 1的比例放入孵化箱内混 养，胚胎由清晨雌雄鱼交配获得，灯亮0.5h后开始收集，胚胎收集后，经清洗，然后移 入斑马鱼胚胎培养液中，去除未受精卵、分裂不规则或卵膜受损伤的卵，选取正常分裂 受精卵，进行毒性试验；还包括如下步骤在加入纳米材料试液的同时做对照试验，在 胚胎发育的过程中进行对比观察，记录胚胎死亡、畸形、孵化等指标，并及时清除死亡 胚胎以避免感染其他胚胎引起死亡；(2)CdSe量子点溶液用胚胎培养液(60mg/L海盐溶液)配制，其中，海盐为 0.03g,超纯水500mL;将胚胎浸在体积比为4%的多聚甲醛前，将胚胎周围的待测液体
尽量清除干净；(3)胚胎在培养皿中(对照组60mg/L海盐溶液和量子点溶液0.15、1.35、 4.05mg/L)放于28°C光照培养箱中以光照黑暗=14h IOh持续培养至第三天(或第四 天)；(4)第三天(或第四天)时取出胚胎并用超纯水将胚胎表面的液体清除干净，用 体积比为4%多聚甲醛固定24h;用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗胚胎，将胚胎表面的多聚 甲醛冲洗干净；所述的PBS缓冲液为为磷酸盐缓冲液，其原料的组份为NaCl 8g，KCl 0.2g, KH2PO4 0.24g, Na2HPO4 · 12H20 3.62g,加超纯水至 lOOOmL，pH 值为 7.4 ；(5)在荧光显微镜下观察血管，采集图像，通过与对照组正常发育的斑马鱼胚胎 的血管图像比较，加入量子点的斑马鱼胚胎血管表现出断裂、缺失、交错及分布间距过 大等现象，认为具有血管损伤；斑马鱼血管没有断裂、缺失、交错，分布间距相似，认 为没有血管损伤。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术 人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也 应视为本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法，其特征在于，具体步 骤为(1)向受精6 7小时的斑马鱼胚胎培养液中加入待测纳米材料试液，在人工气候箱 中培养至72hpf或96hpf，hpf表示受精后多少小时；(2)将72hpf或96hpf将胚胎取出，用体积比为4%多聚甲醛固定24 30h，PBS缓 冲液冲洗2 4次，24 48h内固定在载玻片上，荧光显微镜下观察血管；(3)根据荧光显微镜采集的图像，判断所述纳米材料是否引起血管损伤；其中与 对照组正常发育的斑马鱼胚胎的血管比较，斑马鱼血管表现出断裂、缺失、交错及分布 间距过大现象，为具有血管损伤；斑马鱼血管没有表现出断裂、缺失、交错，分布间距 相似，为没有血管损伤。
2.如权利要求1所述的一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法，其 特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的待测纳米材料为任一可能具有生物毒性的纳米 粒径物质，包括碳纳米材料、半导体量子点、纳米氧化物。
3.如权利要求1所述的一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法，其 特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的斑马鱼胚胎为转基因斑马鱼所产。
4.如权利要求1所述的一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法，其 特征在于，所述的步骤(1)还包括如下步骤在加入纳米材料试液的同时做对照试验， 在胚胎发育的过程中进行对比观察，记录胚胎死亡、畸形、孵化指标，并及时清除死亡 胚胎以避免感染胚胎弓I起死亡。
5.如权利要求1所述的一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法， 其特征在于，在所述的步骤(1)中，加入待测纳米材料试液后，28°C下以光照黑暗= 14h IOh持续培养至72hpf或96hpf。
6.如权利要求1所述的一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法，其 特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液。
7.如权利要求6所述的一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法，其 特征在于，所述的磷酸盐缓冲液，其原料的组份为NaCl 8g，KC10.2g，KH2P040.24g, Na2HPO4 · 12H20 3.62g,加超纯水至 lOOOmL，pH 值为 7.4。
8.如权利要求1所述的一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法，其 特征在于，在所述的步骤(2)中，将胚胎浸在体积比为4%的多聚甲醛前，将胚胎周围的 待测液体清除干净。
9.如权利要求1所述的一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法，其 特征在于，在所述的步骤(2)中，PBS缓冲液冲洗时每次五分钟，冲洗三次，将胚胎表面 的多聚甲醛冲洗干净。
全文摘要
本发明涉及一种通过转基因斑马鱼胚胎模型测试纳米材料毒性的方法，具体步骤为(1)向受精6～7小时的斑马鱼胚胎培养液中加入待测纳米材料试液，在人工气候箱中培养至72hpf或96hpf；(2)将72hpf或96hpf将胚胎取出，用体积比为4％多聚甲醛固定24～30h，PBS缓冲液冲洗2～4次，24～48h内固定在载玻片上，荧光显微镜下观察血管；(3)根据荧光显微镜采集的图像，判断所述纳米材料是否引起血管损伤。本发明的优点原材料易得，待测纳米材料给药方式简单、用量少，检测方法简便，试验周期短，应用前景广泛。
文档编号G01N33/00GK102023199SQ200910195538
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月11日 优先权日2009年9月11日
发明者刘莉莉, 孙雪, 张卫, 徐圣友, 林匡飞, 殷晓蕾, 苗优娜, 蓝闽波, 赵宇侠, 陆强 申请人:华东理工大学