专利名称：抑制Lewis Y抗原过度表现的药物用途及Lewis Y抗原检测套组的制作方法
技术领域：
本发明关于一种抑制Lewis Y抗原过度表现的药物用途及一种LewisY抗原检测 套组。
背景技术：
败血性休克症候群为微生物感染所引起之宿主过度免疫反应造成的结果，此为住 院病患死亡的主因。败血症的病理及生理改变，包含因致病菌引起免疫细胞如单核球及巨 嗜细胞，不受控制的释出发炎前的调控因子，包括一氧化氮、肿瘤坏死因子(TNF)及介白素 (ILs)。 葛兰氏阴性细菌感染为全身性细菌败血症的主因。葛兰氏阴性菌的外膜含有脂多 醣体(LPS), LPS会引起发炎前调控因子快速增加，导致致命性的全身组织破坏及多重器官 衰竭，与败血性休克症候群之发炎反应类似。 在哺乳动物中，细胞膜上的CD14和类Toll受体(Toll likerec印tor，TLR4)-MD-2 会参与LPS的辨识。LPS与TLR4受体结合时，会活化分裂原活化蛋白激胸(MAPK)路径 上各成员，包括p38， p42/p44细胞外调控信号的激酶(ERK)和c J皿N终端激酶(JNK)。 在未活化的细胞，核因素(NF) -kB系由50及65kDa (p50/p65)蛋白次单位组之复合体 (heterodimeric)，在细胞质中以非活化复合体被保留，和抑制型kBa (IkB a )结合。当细 胞受到LPS前发炎反应的剌激时，IkB a会被磷酸化和降解，造成NF-kB核易位并促进发炎 反应基因的表现，包括诱导型一氧化氮合成酶(iN0S)、TNF-a和其它基因表现。
人类凝血酶调节素(thrombomodulin, TM)是由557氨基酸组成之第一类醣基化 的穿膜蛋白，带有一个N端类凝集素(lectin-like)区位(Dl)，并和六个类表皮生长因子 (EGF-like)结构(D2)连接，及一个0-醣基键结区位(D3)，一穿膜区位(D4)和一个位于 尾端的细胞质区位(D5) (Weiler， H. et al. J Thromb Haemost Jul ;1(7) :1515-24)。人类 凝血酶调节素2区位(TMD2)的EGF类结构藉由改变人类凝血酶(thrombin, TM)对受质 的专一性，使人类凝血酶调节素(TM)具抗凝血活性。TMD2-TM复合体会活化抗凝血蛋白 C (Anticoagulant Protein C，APC)，并抑制凝血前趋辅助因子Va及VIIIa。此外，人类凝血 酶调节素(TM)也存在于角质细胞(karetinocyte)、多形核噬中性球(Polymorphonuclear neutropils， PMNs)、单核球及内皮细胞中，含示人类凝血酶调节素(TM)拥有其它的生理功 能。人类凝血酶调节素(TM)之区位可作为血管新生因子并经由APC依赖路径或非依赖路 径参与抗发炎反应。 近来TMD1被发现有抗发炎的活性，因为TM类凝集素(Lectin)区位被移除的 老鼠对脂多醣(LPS)产生更明显的抗性，经由NF-kB和MAPK路径抑制附着蛋白分子 (adhesion molecule)表现(Conway， E. M. et al. J ExpMed. 2002S印2 ;196(5) :565-77; U. S. Pat. 73419912)。此外，TMD1也被发现经由干扰HMGB1 (High-Mobility Group-Bl)和 进阶非酶醣基化终产物受体(Rec印tors of Advanced Glycation End product, RAGE)的结合，隔离HMGB1 ;HMGB1是致命性毒血症和败血症晚期的细胞激素调节者(Abeyama， K. et al.J Clin Invest. 2005May ;115(5) : 1267-74. Epub 2005Aprl4)。另TMD1也参与补体系统 的活化和预防关节炎(Arthritis)。 TMD1在结构上近似于哺乳类动物C型凝集素(lectin)，其通常由钙离子依赖型碳 水化合物受体区位所组成。不同的C型凝集素有多种类的生物功能如细胞附着、胞吞作用、 病源体中和作用及在先天免疫系统扮演重要角色。 Lewis Y抗原为血液细胞群双岩藻糖化(Difucosylated)寡醣家族的成员，表现 于70%的内皮细胞衍生癌上(Kuemmel A et a 1. ， Tumor Biol2007 ;28 :340-349)。内皮 细胞衍生癌包含乳癌、胰脏癌、卵巢癌、大肠癌、胃癌及肺癌。Lewis Y抗原会高度集中和高 度变异表现于癌细胞，Lewis Y抗原也以相同型态表现于初级和移转性(metastasis)癌 病灶，因此Lewis Y抗原可作为筛选部分内皮细胞癌的抗体作用标靶，如乳癌(Westwood JA etal. PNAS，2005 ;102(52) : 19051-19056 ;Schlimok， G. ， et al.Eur. J. Cancer,31A : 1799-1803，1995 ;Tolcher， A. W. ， et al.J. Clin. Oncol. ，17 :478-484，1999)。抗Lewis Y 抗体可消除恶性肿瘤(Carcinomas)表现Lewis Y抗原。
发明内容
本发明是一种人类凝血酶调节素(TMD1)用于抑制个体的Lewis Y抗原过度表 现的药物用途，其特征在于该药物包含一有效量的TMD1N端类凝集素区位(N-terminal lectin-like domain)或其类似物。前述Lewis Y抗原表现于肿瘤细胞，革兰氏细菌或LPS 上。在实施例中，肿瘤细胞为上皮细胞源性肿瘤，如乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌，结肠癌，胃癌和肺癌。 本发明另提供一种用于侦测一个体的样本中过度表现Lewis Y抗原的癌细 胞、葛兰氏阴性菌或LPS的检测套组，其特征在该检测套组包含TMD1N端类凝集素区位 (N-terminal lectin-like domain)或其类似物。前述TMDIN端类凝集素区位(N-terminal lectin-like domain)包含氨基酸序列SEQ ID No :1所组成的蛋白质区位，其中该蛋白质 区位连接到可检测的标记上。 在本发明中揭露，TMD1和多醣体(LPS)结合后可诱导巨噬细胞凝聚并增强其细菌 吞噬作用。TMD1在由葛兰氏阴性菌所导致的败血症全身性发炎早期，可作为抗发炎反应的 因子。另外，TMDl可和平滑型LPS抗原菌如肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)结合 或和单独的LPS结合，并抑制其下游的讯息传递以减弱LPS或肺炎克雷伯菌诱导的发炎反 应。因此，TMD1似有中和LPS之重要保护功能，对抑制败血性休克症及发炎反应有一定效 果。 本发明显示人类凝血胸调节素(TM)可抑制由葛兰氏阴性菌引起之细菌性败血 症(Bacteria-mediated s印sis) 。 TMD 1的N端区位会和Lewis Y抗原和LPS结合，抑制 LPS引起之抗发炎反应。此外，TMD1可使大肠杆菌(E.Coli)或肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)等葛兰氏阴性菌凝集，并增强噬菌体对此类细菌的吞噬作用。因此，重组的 TMDl对抑制败血症之严重发炎反应，特别是葛兰氏阴性菌感染引发的发炎反应有一定价 值。 本发明实施例中提供一种抑制LPS或葛兰氏阴性菌引起的细菌性发炎反应的药物中的用途，该药物包含重组的人类凝血胸调节素(TMD1)N端类凝集素区位的氨基酸序列 SEQ ID N0:1。在较佳实施例中，发炎反应是由LPS或葛兰氏阴性菌引起的败血症状。在一 更佳实施例中，葛兰氏阴性菌系为大肠杆菌或肺炎克雷伯菌。 TMD1有一调理作用部位，可进行先天免疫对抗葛兰氏阴性菌。该调理作用是由 TMD1和细胞膜或LPS上的Lewis Y抗原结合，并引发巨噬细胞对细菌的吞噬作用。上述反 应可减轻中性粒细胞的肺部浸润或保护肾脏功能。此外，该抑制作用可为TMD1和高流动性 群B1(HMGB1)反应。 在实施例中，该药物会抑制LPS诱导的发炎反应产物TNF-a或一氧化氮的在巨噬 细胞产生，或抑制LPS引起之发炎反应讯息路径。该讯息传递路径包含LPS诱导之发炎反 应中P38和ERK的磷酸化，IkB降解和NF-kB移动至细胞核，及增加诱导型一氧化氮合成胸 (iN0S)和TNF-a的表现。 事实上，任何损害活体组织的有害措施，如细菌感染，过多的热能，感冒，机械损 伤，如粉碎，酸，碱，辐射或病毒感染皆可引起发炎反应，不论甚么器官或组织。被分类为 发炎反应的动物及人类的疾病包括关节炎，皮肤发炎，腹膜炎，脑缺血相关损伤/血液灌 流(如心，肝，肾，脑)，肺部发炎症状(例如，包括哮喘，支气管炎，成人呼吸窘迫综合症 (ARDS)，血管炎，动脉粥样硬化，肾炎，皮肤伤口愈合，败血症，以及局部和全身感染。
在本发明中，凝集系指群聚颗粒，凝集一词源于拉丁文agglutinare，意思是"胶"。 生物学中三个主要的凝集现象如下 1.细胞和抗体群聚，如细菌或红血球细胞和抗体结合，该抗体再和其它分子结合， 并吸引更多不同的分子聚集。 2.在悬浮液中的小分子凝聚，形成较大的颗粒并沉淀。 3.在某种过敏反应中细胞会压縮变的更紧密，以防止外来物质进入。通常是由在 抗原附近的细胞所形成。 本发明另提供一种用于侦测一个体的样本中过度表现Lewis Y抗原的癌细 胞、葛兰氏阴性菌或LPS的检测套组，其特征在该检测套组包含TMD1N端类凝集素区位 (N-terminal lectin-like domain)或其类似物。前述TMDIN端类凝集素区位(N-terminal lectin-like domain)包含氨基酸序列SEQ ID No :1所组成的蛋白质区位，其中该蛋白质 区位连接到可检测的标记上。在较佳实施例中，表达Lewis Y抗原之癌细胞为乳腺癌，胰腺 癌，卵巢癌，结肠癌，胃癌，或肺癌细胞。该样本系从个体之血液，组织，体液，细胞，或粪便取 得。本发明中的个体为哺乳动物或人类。可侦测标记如荧光分子，放射性分子，显色分子， 生物素，吖啶(acridinium)酯和吖啶-9-羧胺。 本发明内容所述之"个体"是指得到医疗照顾，护理，或治疗的任何动物，特别是人 类的。 本发明内容所述之"类似物"在生物化学系指在结构功能上类似于另一物质。本 发明的TMD1类似物包括不同动物之凝血酶调节素凝集素区位，包括但不限于小鼠；该类似 物另包含以及经该领域通常技术修饰之凝血酶调节素，如点突变和化学修饰，该化学修饰 如聚乙二醇化或醣基化。 本发明内容所述之"先天免疫"包括保护宿主被其它生物感染的细胞和机制，以非 专一性的方式。前述是指细胞中固有的系统会以通常方式辨识病原体，并作出反应。和适应性免疫系统不同，宿主并没有被赋予长期或保护免疫。先天免疫系统提供实时感染的防 御，该系统可在所有动植物品种作用。 本发明内容所述的"调理作用"是指以任何分子增强吞噬作用的过程，如以带负电 分子涂在细胞膜。吞噬作用细胞以及被吞噬的细胞之细胞膜皆带负电，使两个细胞难以靠 近。在调理作用过程中，抗原系被抗体或补体分子结合。吞噬作用细胞表现受体和调理素 分子结合。前述分子涂上抗原可增强吞噬细胞和抗原结合作用。此外，抗原调理作用，及接 续和活化巨噬细胞结合可增强邻近巨噬细胞表现补体受体。调理素分子包括IgG和IgA抗 体，和补体系统C3b， C4b及iC3b分子。
图1显示rTMD蛋白影响LPS诱导发炎反应媒介的产生和LPS诱导之讯息传递。(A 及B)由Pichia和哺乳动物之蛋白表现系统产生之rTMD蛋白，在加到RAW 264. 7细胞前会 预先和LPS作用。经过6个小时培养反应后，收集培养液以测量(A)TNF-a和(B) —氧化氮。 mTMDl代表从哺乳动物蛋白表现系统产生之rTMDl。该数量值为平均值+_标准差(n = 3)。 A及B为**P < 0. 01和***P < 0. 001对比经LPS处理之组别，###P < 0. 001和PBS对照组 比较。(C)不同程度的LPS被用来诱导RAW264. 7细胞产生TNF-a，并以此衡量rTMDl的作 用。该数量值为平均值+_标准差(n = 4)。其中*P < 0. 05，**P < 0. 01***而P < 0. 001对 比经LPS处理之组别。Western印染法被用来测量LPS诱导之磷酸化作用和IkBa的降解。 (D)核分馏物p50及p65之NF-kB移动至细胞核。(E) ERK1/2和P38磷酸化和(G) iNOS表 现。所有的结果系由三次独立的实验得到。 图2显示rTMDl导致LPS诱导之发炎反应，及致命性LPS诱导之肺衰减中性粒细胞 群聚，肾损伤，并加强胞内清除LPS。 (A和B)rTMDl系静脉注射LPS(20毫克/千克)在腹腔 注射前。注射LPS后6小时候收集血清以检测(A)TNF-a和(B) —氧化氮的产生。该数量值 为平均值+_标准差(n = 10) ，*P < 0. 05，#P < 0. 01且< 0. 001对比经LPS处理之组 别；###p<o. OOl对比PBS处理之组别(C)为肺部的苏木素(hematoxylin)及伊红(eosin) 染色切片之显微影像。(D)中性粒细胞浸润于单一肺泡之数目系由光学显微镜观察(630倍 放大)。中性粒细胞的数目系随机计算每个老鼠实验每张幻灯片的四个字段，每张幻灯片的 单位字段肺泡量都经标准化。该数量值为平均值+_标准差(n = 10) ，***P < 0. 001对照经 LPS处理之组别，###P < 0. 001对照经PBS处理之组别。该图结果系由三个独立的实验而 得。(E、F和G) rTMDl (5和25毫克/千克)系静脉注射老鼠LPS (20毫克/千克)在腹腔注 射前。12小时后，小鼠被牺牲并切除肾组织。肾脏切片系由苏木素(hematoxylin)及伊红 (eosin)组织染色观察。(E)rTMDl抑制肾损伤，箭头指示肾小球位置(标尺单位为50um)。 rTMDl降低小鼠血清中肾损伤的尿素氮指标(F)及肌酐(G)。对于每个实验组，n = 4，###P < 0. 001对照经LPS处理之组别广P < 0. 01，***P < 0. 001对照LPS治疗之组别，该图结果 系由三个独立的实验而得。(H)将小鼠注射(40毫克/千克)LPS,并接续注射rTMDl (四剂 量2毫克/公斤，LPS注射后0、6、 12和24小时)。对于每个实验组，n = 20， ***P < 0. 001 对照经LPS处理之组别。(I)血液循环rTMDl之清除；rTMDl在血液循环之半衰期系由静 脉注射注射rTMDl (10毫克/公斤)，并以夹心ELISA法测量血清中rTMDl之浓度。其系利 用抗c-Myc及TM-300抗体和rTMDl结合并侦测。该数量值为平均值+_标准差(n = 5)。(J)对给予或未加入rTMDl之血液循环中LPS之清除，LPS (20毫克/千克)系由肠道注射 雄性FVB小鼠，在未加入rTMDl或加入(10毫克/公斤，静脉注射)条件下。在不同时间点 收取血清样本，并以鲎变形细胞溶菌液实验测量LPS量。对每个时间间隔，该数量值为平均 值+_标准差(n = 5) ， *P < 0. 05及***P < 0. 001，对照经LPS处理的组别。
图3显示rTMDl导致肺炎克雷伯氏菌诱导之发炎反应及致命性，并加强细菌清除 作用。(A禾PB)小鼠在注射肺炎克雷伯菌(5X102CFU/mouSe)前先给予rTMDl，在注射肺炎 克雷伯菌12小时后收集血清，以测量(A)TNF-a和(B) —氧化氮的产量。该数量值为平均 值+_标准差(n = 10) ， **P < 0. 01且***P < 0. 001对照经肺炎克雷伯菌处理之组别。###P
< 0. 001对照经PBS处理之组别。(C)在注射肺炎克雷伯菌前(5xl(fCFU/mouse)给予小 鼠rTMDl (10毫克/公斤)，并计算存活率。对每个实验组，n = 20， ***P < 0. 001对照经肺 炎克雷伯菌处理之组别，该图结果系由三个独立的实验而得。(D)rTMDl加强肺炎克雷伯菌 在血液循环中之清除。FVB小鼠以肠道注射肺炎克雷伯菌(5X102CFU/mouSe)在未含或含有 rTMD 1 (10毫克/公斤)条件下。在不同时间点收取血液样本，并测量该不同时间点组别之样 本之不同菌种单位菌落数。该数量值为平均值+_标准差，对每个实验组，n = 5，*P < 0. 05 对照经肺炎克雷伯菌处理之小鼠。(E) (F)rTMDl (10毫克/千克)为在注射肺炎克雷伯菌 (5xl02CFU/mouse)后即刻、30分钟或60分钟后注射；并测量血清中TNF-a含量(E)和肺炎 克雷伯菌清除量(F)。该数量值为平均值+_标准差，对对于每个时间间隔组，n = 8-10， *P
< 0. 05， ***P < 0. 001对照经肺炎克雷伯菌处理之每个时间点组别。###P < 0. 001对照经 PBS处理之组别。在另两个独立的实验也得到类似的结果。 图4显示rTMDl蛋白和肺炎克雷伯菌及LPS结合，并抑制rTMDl对CD14和LPS 结合的功效。(A)肺炎克雷伯菌或小牛血清(BSA) 。 (B)大肠杆菌0111 :B4之LPS或BSA。 (A和B)将肺炎克雷伯菌，LPS或BSA涂布于反应槽，等莫耳量的rTMD蛋白加入每一反应 槽中，并侦测其结合。该数量值为平均值+_标准差，n = 6， ***P < 0. 001对照添加rTMD23 及涂布BSA之组别。(C)LPS系涂布于反应槽并和rTMDl (50克/毫升)反应，在含有或未 含0.2M乳糖或5mM EDTA的含CaCl2结合缓冲液中。结果系以相对结合缓冲液(100%)的 标准吸光百分比表示。该数量值为平均值+_标准差，n = 6， ***P < 0. 001对照结合缓冲液 组，该结果典型系由至少三个独立的实验而得。(D)rTMDl阻挡LPS和CD14的结合。LPS系 涂布于反应槽，并和一定量之rTMDl及CD14反应。LPS和CD14的结合系以CD 14抗体侦 测(M-305, Santa Cruz Biotechnology)。该数量值为平均值+_标准差，n = 4，**P < 0. 01 及***P < 0. 001对照只加入CD14的组别，相似结果系由三个独立的实验而得。
图5显示THP-l细胞中rTMDl对细菌凝集和吞噬作用的影响。(A) FITC标记之肺 炎克雷伯菌和大肠杆菌DH5a系反应于含有或未含0.2M乳糖或5mM EDTA的含CaCl2缓 冲液中。标记荧光的细菌系以荧光显微镜观察并评估细菌凝集。非标签型(non-tagged) rTMDl系由rTMDl和肠激酶反应制备，并依照附件SI所述纯化。哺乳动物表现之rTMDl和 标记rTMD23之内部对照组也包括在内。显微照相来自三个独立的实验。(B)显微照片显示 rTMDl对细菌吞噬作用的影响。分化之THP-l细胞系和预处理rTMDl之FITC标记肺炎克 雷伯菌反应。左侧图显示了明视野影像，右侧图显示荧光显微照片(标尺代表200微米)。 (C)为(B)样本之流式细胞仪分析。该图描绘FITC荧光值(X轴)与相对细胞数量(Y轴)， 上述图的结果来自三个独立的实验。
图6显示以AlphaScreen分析rTMDl配基，Ley抗原对LPS的rTMDl结合的抑制作 用，及分析大肠杆菌0111:B4LPS之Lewis抗原。(A)显示AlphaScreen的分析结果。该数 量值为平均值+_标准差(n = 4)。醣对哺乳动物表现之rTMD 1专一性结合系以相对强度 表示(参照最高吸亮度单位)。以数字表列醣的种类。***P < 0. 001和对照组比较。该结果 由来自4个独立实验的平均。以酵母表现之rTMDl得到相同的结果。(B)Ley抗原对LPS的 rTMDl结合的影响。LPS系涂布于反应槽，并不加入不同浓度之Ley和rTMDl于每一反应槽。 rTMDl的结合之数量值为平均值+_标准差(n = 4) ， *P < 0. 05， **P < 0. 01， ***P < 0. 001 和只加入rTMDl的组别。于两个独立的试验获得类似结果。(C)分析大肠杆菌0111:B4LPS 之Lewis抗原。LPS(5毫克/反应槽)系涂布于高结合微孔板之反应槽。将Lea、Leb、Lex和 Ley抗体(5微克/毫升)加入每一反应槽和结合缓冲液反应37t:，2小时。后接续以过氧 化酶标记之二抗反应2小时。Lewis抗体和LPS结合系以450奈米吸光值测定。该数量值 为平均值+_标准差(n = 4)。于两个独立的试验获得类似结果。(D) Ley对rTMDl阻断LPS 诱导之讯息传递路径的影响。rTMDl (20微克/毫升)和不同浓度之Ley预先以LPS(lOO奈 克/毫升)，然后加入到细胞。培养反应30分钟后，以西方免疫转印法检测用LPS诱导之 ERKl/2的磷酸化，细胞质中IkBa的降解，核分液中NF-kB p50和p652的核易位。于两个独 立的试验获得类似结果。
具体实施例方式
实施例1以酵母菌(Pichia)和哺乳动物蛋白表现系统制备重组人类凝血酶调节
素蛋白(rTMD) 实验材料制备 利用pPICZaA和pCR3_EK载体表现和分泌rTMD，并使用六个His标签和c_Myc抗 原决定区(印itope)标定该重组蛋白，以利在Pichia Pastoris和人胚胎肾细胞(Human Embryonic Kidney, HEK293)的哺乳动物蛋白表现系统中纯化和检测。
TMD1 (氨基酸Ala[Ala155) ， TMD2/EGF123 (氨基酸Ala224-Glu346)和TMD23 (氨 基酸Ala^-Ser479)是以PCR方法从人脐静脉内皮细胞得到相应的cDNA。 PCR引物如下 TMDl(SEQ ID NO :2禾P 3) ， TMD23(SEQ IDN0 :4和5) ， TMD2/EGF123 (SEQ ID NO :6)。肠激 酶之反应切位在rTMD和His/c-Myc标签之间，可和重组蛋白反应以切除该标签。含有 rTMD表现蛋白之酵母发酵培养基或HEK293细胞条件培养基通过镍螯合层析柱，含rTMD的 部分溶液以咪唑(imidazole)梯度洗涤出。该纯化的rTMD以SDS-PAGE和西方转印法侦 测，并以质谱分析该样本。rTMD蛋白N端氨基酸序列另以Edman降解法定序，477A定序仪 (Applied Biosystems)。于ExPAsy网站计算该蛋白浓度以估计rTMD的分子量，其中rTMDl : 22902KDa， rTMD2/EGF 123 :16473KDa， rTMD23 :32823KDa)。 非标定(non-tagged)的rTMDl制备如下将1毫克rTMDl和5奈克肠激酶 (Enterokinase)反应4°C 16小时(New England Biolab)。经过镍螯合层析柱分离非结合 溶液以收集非标定的rTMDl。该样本更进一步以固定化大豆胰蛋白酶(Soybean Trypsin) 抑制琼脂凝胶处理，以吸附残留的肠激酶。每个样本以肠激酶反应前后，皆以SDS-PAGE和 西方转印法进行分析，非标定的rTMDl分子量2000KDa少于有标定的rTMDl分子量。
细胞培养
人类白血病单核细胞THP-1细胞和小鼠巨噬细胞株RAW 264. 7，是得自美国菌种 保存中心。THP-1细胞培养于RPMI-1640悬浮液中，另加入10mM乙磺酸，ImM丙酮酸钠， 0.1% 甲基乙醇，100U/ml青霉素，100克/毫升链霉素和10%胎牛血清(FBS)。 RAW 264. 7细胞培养于Dulbecco改良的Eagle培养基固定层并加入4mM L_麸酰胺，并调整加 入1. 5克/升碳酸氢钠和4. 5克/升葡萄糖，100U/ml青霉素，100克/毫升链霉素和10% 胎牛血清，在37t:二氧化碳含量5X的大气中。为进行细胞分裂，将THP-1细胞移至含10nM PMA的培养基，并反应18小时。
发炎反应媒介物试验 肿瘤坏死因子TNF-a在条件培养基或小鼠血清中以酵素连结免疫吸附分析法测 定(ELISA)。累积在培养基或小鼠血清的亚硝酸盐利用Griess试剂(Sigma-Aldrich)以比 色法测定。血液尿素氮(Blood urea nitrogen, BUN)和肌酐(Creatinine)是由罗氏公司 D&P模块侦测(罗氏诊断系统)。该试验步骤依照厂商提供的规程进行。
西方转印法 rTMDl (0-50微克/毫升，等于0-2. 18奈莫耳/毫升)和大肠杆菌LPS(0111 :B4) (Sigma-Aldrich)预先培养在没有或存在Lewis Y(Ley,DextraLaboratories)条件下30分 钟，用来剌激THP-l或RAW 264. 7细胞。培养期间包括PIkB和IkB (B-9和C_21， Santa Cruz Biotechnology,除非另有说明)15分钟，P38 (C-20)和pp38 (D_8) 20分钟，ERK1/2 (K-23)、 pERKl/2(E-4)、纤层蛋白素(lamin)B2(E-3，Zymed Laboratories) 、NF-kB p50(C-19)、核易 位NF-kB p65(C-20)30分钟，和使用特定的抗体(N-20)表现iNOS 24小时。
模式生物及全身性败血症模型 以雄性FVB小鼠(8到10周大)当作体内败血症模型。实验程序经台南成功大学 动物保育委员会核准。在长期内毒素血症模型，不同浓度的等莫耳数rTMDl或rTMD蛋白以 尾静脉注射给药，注射LPS(20毫克/千克)或肺炎克雷伯菌(5X102CPU/鼠，BCRC)是由 腹腔注射给药。经过6或12小时，将小鼠以戊巴比妥(pentobarnital)麻醉解剖(50毫克 /公斤，腹腔注射)。收集并检测血清中TNF-a、一氧化氮、尿素氮(BUN)和肌酐。肺及肾组 织被移除，以福尔马林固定，并内嵌石蜡以利组织化学检查。致命性败血症模型，rTMD蛋白 系以静脉注射(2毫克/公斤，相当于87. 3nmole/公斤)，于LPS(40毫克/千克)肠注射 后0、6、12和24小时给药。rTMDl在血液循环中的半衰期以静脉注射rTMDl量决定(2毫 克/公斤，相当于436. 64nmole/公斤)，并收集不同的时间点的血清标本。该样本血清中 的rTMDl量以夹心ELISA测定，利用抗c-Myc的单株抗体和TM-H300当作撷取和检测抗体 (Santa Cruz Biotechnology)。对致命菌血症模型，rTMDl (10毫克/公斤)以肠注射给药， 在注射肺炎克雷伯菌(5X 103CPU/鼠)前。每6 12小时监测死亡率，直到所有实验组小 鼠死亡。 确定LPS半衰期的实验方法如下。LPS(20毫克/千克)以肠注射雄性FVB小鼠， 在没有或rTMDl (10毫克/公斤)条件下。收集不同的时间间隔血清样本，以鲎变形细胞溶 菌试验(Limulus amebocyte lysate test)测定LPS量。操作另一实验以确定rTMDl是否 影响细菌清除。肺炎克雷伯菌(5X102CPU/鼠)以肠注射雄性FVB小鼠，在没有或rTMD1(10 毫克/公斤)条件下，并收集不同时间间隔血清样本。在血液琼脂培养基上以电镀系列稀 释该血清样本，以定量该样本的肺炎克雷伯菌数，隔夜培养37t:并计算菌落数。
肺炎克雷伯菌和LPS结合试验 肺炎克雷伯菌(3Xl()5CFU/反应槽)，大肠杆菌0111:B4中光滑型LPS(5微克/反 应槽)，或牛血清蛋白(BSA，5微克/反应槽)于IOO微升重碳酸盐缓冲液(pH值9.6)，涂 布于层高结合性微孔培养皿(CorningCostar)。非专一性结合以结合缓冲液阻断(20mM， 三盐酸，pH值7. 4，0. 15M氯化钠，5mM氯化钙)含50毫克/毫升BSA。不同浓度的rTMD无 或加入CD14 (10微克/毫升)的结合缓冲液，于反应槽加入1毫克/毫升BSA培养2小时。 在某些实验中，O. 2M乳糖、5mM EDTA或Ley被加入结合缓冲液中以对抗LPS和rTMDl结合。 抗c-Myc和rTMD结合之抗原结合位之抗体，系加入反应槽培养2小时，并接续和过氧化酶 (peroxidase)标记的第二抗体反应。rTMD结合复合物系以450奈米吸光值侦测。
rTMD 1对细菌凝集的影响 肺炎克雷伯菌和大肠杆菌DH5 a (BRBC)以0. 1M重碳酸氢钠缓冲液(pH值9. 6)冲 洗两次并和0. 1毫克/毫升异硫氰酸荧光素(FITC)在37t:黑暗反应。每20微克/毫升 rTMDl ，非标定rTMDl ，哺乳动物rTMDl ，及重组第2和第3区位TM(rTMD23)以FITC标定的 细菌共同培养(1Xl()SCFU/毫升)，在缓冲液(20mM三盐酸，pH值7. 4，0. 15M氯化钠，5mM氯 化钙，1毫克/毫升BSA)含有或不含0. 2M乳糖或5mM ETDA。样本分别放置于玻片，在显微 镜下观察荧光标记细菌，以评估凝集程度。
THP-1吞噬作用试验 FITC标记之肺炎克雷伯菌(1 X 105CFU/反应槽)系以rTMDl预先培养37°C 30分 钟，于加入使THP-1细胞分裂前。培养反应后2小时，以冰PBS冲洗THP-1细胞两次，在荧 光显微镜观测前。或进一步以胰切酶(trypsin)反应，悬浮于PBS，并以荧光激活细胞分类 仪(流式细胞仪)测量THP-1细胞内荧光量。收集10， 000个细胞的530奈米绿色荧光数 据，该数据的对数值以CellQuestTM软件(Becton Dickinson公司)分析。
rTMDl配基分析 生物素-聚丙烯酰胺-醣(Biotin-PAA) ， rTMDl，兔抗鼠IgG抗体(Zymed)，鼠抗 6组胺酸标签(6XHis tag)抗体(Abeam) ， str印tavidin (卵白素)予体涂布在A蛋白复 合受体珠(bead, PerkinElmer)上，以缓冲液稀释至适当浓度(25mM三盐酸(tris-HCl)， pH值7. 0，25mM氯化钙，1毫克/毫升BSA)。抗6组胺酸(6XHis-tag)标签抗体，兔抗鼠 IgG抗体和受体珠，在使用前先以试验缓冲液培养l小时，25t:(作为受体的混合物)。生 物素_聚丙烯酰胺_醣，rTMDl和予体珠(donor bead)，分别加入ProxiPlate-384检测板 (PerkinElmer)反应槽培养反应25°C 1小时。将受体的混合物一等分加入反应槽培养反应 25t:，再2个小时。该试验结果经AlphaScreen软件分析后可在PerkinElmer Envision仪 器读取。所有的步骤和培养反应皆在黑暗中进行。 [OO54] 分析大肠杆菌0111:B4LPS上之Lewis抗原 大肠杆菌0111:B4LPS(5微克/反应槽)系涂布于高结合微孔板反应槽。反应槽 的非专一性结合由结合缓冲液阻断，缓冲液含50毫克/毫升BSA，抗Lewis A(Lea) 、 Lewis B(Le"、Lewis X(Lex)和Ley的各种抗体(Abeam) 5微克/毫升，加到反应槽中。前述缓冲液 和结合缓冲液(l毫克/毫升BSA)共同反应37t:，2小时。后皆续和羊抗鼠山葵过氧化酶 在37t:反应2小时。过氧化酶反应使用3，3' ，5，5' _四甲基联苯胺为受质，并以2NH2S04 停止该反应。侦测该样本在450奈米之吸光值。
统计分析 以对数阶层(log-rank)试验分析生存率数据，该数量值为平均值+_标准差(标
准差)。以非成对t试验(impaired t-test)分析统计上意义。比较超过2组以上的实
验数据差异，以单向变异数分析(ANOVA)或双向变异数分析，并接续邦费罗尼的事后检验
(Bonfer皿i， s post hoc test) ， P < 0. 05代表有统计上意义。 实施例2 :rTMDl治疗降低LPS诱导发炎反应巨噬细胞之中介物生成 若要测试TMD1是否具抗发炎特性，rTMD以Pichia Pastoris和哺乳动物蛋白表现
系统制备。从两个表现系统得到的rTMDl蛋白有相似的分子量与糖基化修饰，约35kDa并以
银染免疫转印法(silver blotting)检测。首先以LPS测试rTMD在RAW 264. 7和THP-1细
胞抗发炎反应作用。Pichia Pastoris表现rTMDl但不包含似表皮生长因子1，2，3之TMD2
区位(rTMD2/EGF123)，剂量依赖性抑制TNF- a的生产，在RAW 264. 7细胞中，有LPS剌激条
件下(图1A) ;THP-1细胞获得类似的结果(数据未显示)。同样，只有rTMDl可以有效地
抑制一氧化氮的产生在RAW264. 7细胞(图IB);哺乳动物蛋白表现系统制备的rTMDl得到
同样的结果(图1A-B)。为了测试rTMDl降低LPS是否来自rTMDl和LPS结合，以不同浓
度的LPS和rTMDl进行测试。在缺乏rTMDl条件下，LPS剂量依赖型使TNF产量增加(图
1C) ， rTMDl剂量依赖型抑制LPS诱导TNF产生(图1C)，该结果与LPS-rTMDl结合使LPS减
少其诱导发炎反应中介物产生的假设相符。 实施例3 :rTMDl阻断LPS诱导之讯息传递路径 LPS (100奈克/毫升)剌激RAW 264. 7细胞会引发IkB a磷酸化和降解。该作用 效果被rTMDl (50微克/毫升，相当于2. 18nmole/毫升)完全逆转(图ID) 。 LPS诱导的 NF-kB核易位也被rTMDl剂量依赖型抑制(图IE) 。 LPS诱导的ERKl/2和p38磷酸化也被 rTMDl抑制(图IF)。在THP-1细胞也显示类似rTMDl影响LPS活性的结果(数据未显示)。 在RAW 264. 7细胞，LPS引起之iNOS作用也被rTMDl抑制(图1G)。 实施例4 :rTMDl减少细胞素释放，减轻肺和肾损伤，改善败血症存活率，并提高细 菌LPS清除 由于rTMDl能够抑制LPS诱导发炎反应中介物产生和讯息传递路径，rTMDl可作为 一种治疗剂，以减低体内LPS诱导之发炎反应和致命性。在肠注射LPS 20毫克/千克6小 时后，TNF-a和一氧化氮含量增加，相比于对照组。给予静脉注射rTMDl (1-5毫克/千克， 相当于43. 66-218. 3nmole/千克)的小鼠，TNF-a和一氧化氮含量显着降低(图2A-B)。 给予LPS老鼠，6小时候肺部出现明显中性粒细胞浸润(图2C-D);在注射rTMDl后，肺部中 性粒细胞的群聚现象被有效抑制(图2C-D)。然而，rTMD2/EGF123无明显影响LPS诱导发 炎反应的现象，可作为酵母重组蛋白的负控制组(图2C-D)。同样，LPS会造成严重肾小球 损伤。经rTMDl处理之小鼠，肾小球肾炎的程度明显降低(图2E)。给予LPS后12小时，血 尿素氮及血肌酐的增加和肾功能衰竭同步。经rTMDl处理，之后再给予LPS剌激的小鼠，与 只有LPS处理小鼠相比尿素氮和肌酐显着降低(图2F-G)。欲研究rTMDl是否可防止LPS 致命性，以静脉注射给予小鼠四个单位剂量的rTMDl (2毫克/千克)或PBS，并持续观察直 到所有实验组及对照组小鼠死亡。 图2H显示，rTMDl治疗可有效防止LPS致命性，并改善内毒素血症生存率(给予 LPS —天后，rTMDl治疗组存活率100%， PBS治疗组存活率10% ;给予LPS四天后，rTMDl治疗组的存活率60% ， PBS治疗组存活率0% )，前述表明rTMDl可能的治疗潜力。静脉注入rTMDl后12小时内可在血液侦测到，每次注射后小时为其半衰期，以ELISA法检测(图21) 。 LPS (20毫克/千克)在肠注入后2小时达到最大值，后以血液循环清除，半衰期6-8小时(图2J)。给予rTMDl显着提高LPS清除(图2J)。此外，另制备和设定兔多株抗体。预先以抗rTMDl抗体处理rTMDl，会扭转rTMDl抑制LPS诱导TNF-a释放的效力，这表明rTMDl对发炎反应中介物产生的影响是rTMDl专一性。 实施例5 :rTMDl降低肺炎克雷伯菌诱导之发炎反应及致命性，并加强细菌清除
欲测试rTMDl可否防止葛兰氏阴性菌诱导之致命性，肠注射葛兰氏阴性菌至小鼠以诱导全身性败血症，并以rTMDl治疗(图3A-C)。接受肺炎克雷伯小鼠(5xl02CFU) 12小时后TNF- a和一氧化氮含量增加，rTMDl治疗(5-25毫克/千克，静脉注射)有效减少TNF- a和一氧化氮生成(图3A-B)。生存率测量实验，所有小鼠接受肺炎克雷伯菌(5xl03CFU)18小时后死亡，而50%的小鼠接受一单位剂量rTMDl (10毫克/公斤)存活超过24小时(图3C)。为探讨rTMDl是否影响在肺炎克雷伯菌诱导条件下的存活率与细菌清除作用的关联，检测血液中细菌数量。FVB小鼠以腹腔注射肺炎克雷伯菌(5xl(^CFU)，并给予或不予rTMDl治疗(10毫克/公斤，静脉注射)。rTMDl显着提升血液循环中肺炎克雷伯菌清除，在注射后12、24和36小时(图3D)。为证明rTMDl具有治疗潜力，在细菌感染后输入rTMDl 。在时间点实验，在肠注射后的30或60分钟，立即以静脉注射rTMDl (10毫克/千克)。该结果显示，rTMDl可有效抑制肺炎克雷伯菌诱导之TNF-a释放(图3E)，并增强血液中肺炎克雷伯菌清除于12、24和36小时后，甚至在rTMDl治疗后30或60分钟即可见效(图3F)。未给予rTMDl小鼠在感染肺炎克雷伯菌42小时后死亡，但所有rTMDl治疗组的生存率都增加。
实施例6 :rTMDl与葛兰氏阴性菌和LPS直接结合，膜人类凝血酶调节素(TM)与LPS直接结合 欲测试TMD1是否有能力和葛兰氏阴性菌和LPS结合，rTMDl和rTMD23被用来测试与肺炎克雷伯菌、LPS或BSA结合。rTMDl但非rTMD23可和肺炎克雷伯菌专一性结合(图4A)。由于rTMDl能和葛兰氏阴性菌结合，葛兰氏阴性菌之LPS被当作rTMDl的候选配基。于是测量rTMDl和rTMD23对LPS或BSA的结合。rTMDl但非rTMD23可和LPS结合(图4B)，该结合可被乳糖和EDTA抑制，表明TMD1醣识别区位系以钙离子依赖方式与LPS作用(图4C)。从图4B可看出，LPS和TMD1结合度50%的视Kd估计值为1. 6x10—6莫耳/升，LPS和rTMDl浓度依赖型结合的Kd值介于8. 24X 10—6莫耳/升至9. 01 X 10—8莫耳/升，利用表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)检测。LPS和rTMDl结合会阻碍LPS和其结合分子作用，并抑制LPS诱导发炎反应巨噬细胞的中介物生成和讯息传递路径。由图4D可看出，CD14和LPS的结合被rTMDl浓度依赖型抑制，但LPS结合蛋白和LPS的结合不受rTMDl抑制(数据未显示)。为了探讨内生性TMD1是否可如rTMDl —样专一性和LPS结合，内生性膜TM14和过度表现之全长或类凝集素区位删除之膜TM17'29系用来测试和LPS结合的能力。结果显示，THP-1细胞膜表现之TM可和生物素LPS结合。此外，全长但非类凝集素区位删除的膜TM可和生物素LPS结合。这些结果表明，膜TM可经由N端类凝集素区位和LPS结合。 实施例7 :rTMDl诱导葛兰氏阴性菌凝集作用，增强THP-1细胞的细菌升吞噬作用
由于TMD1调节细胞和细胞间的附着，藉由rTMDl碳水化合物配基(ligand) 17执行LPS和肺炎克雷伯菌清除作用(图2J和3D) ， rTMDl可参与结合并吞噬细菌，如果该细菌表面碳水化合物基团包含rTMDl配基。rTMDl专一性结合检测系由和荧光标记的葛兰氏阴性菌(肺炎克雷伯菌和大肠杆菌)凝集反应侦测。rTMDl (20微克/毫升)诱导肺炎克雷伯菌和大肠杆菌DH5a显着性的凝集反应(图5A)。此外，钙离子依赖型凝集活性会由乳糖和EDTA减弱(图5A)。为排除六组胺酸(6His-tag)或c-Myc标定对rTMD的可能干扰，也进行了非标定rTMDl测试。非标定rTMDl和标定rTMDl显示相同的结果，但rTMD23无法诱导凝集反应。哺乳动物表现的rTMDl显示相同的结果(图5A)。检测rTMDl对THP-1细胞的肺炎克雷伯菌的凝集作用活化效果，rTMDl显着增加THP-1细胞的吞噬作用(图5B-C)。因此，rTMDl不仅可以干扰细菌诱导的发炎反应，而且可诱导细菌凝集作用，促进巨噬细胞之吞噬作用。 实施例8 :确定rTMDl配基的专一性，及确定Ley对HMGB 1-rTMDl结合无竞争性
欲识别TMD1配基之专一性，以AlphaScreen方法测试一组醣配基(图6A)对rTMDl的亲和性。结果显示，Ley抗原对哺乳动物或酵母菌表现的rTMDl有专一性(图6A) 。 Ley抗原专一性剂量依赖型抑制rTMDl与醣配基结合(图6B)，这表明rTMDl之醣配基结合位参与rTMDl与LPS的作用。ELISA显示大肠杆菌0111 :B4之LPS为Lex and 1^抗原而非1^3和Leb抗原(图6C)，和rTMDl专一性结合一致。此外，Ley可以剂量依赖型中和并抑制rTMDl对LPS诱导之ERKl/2磷酸化，IkBa之降解，和NF-kB p50和p65的核易位(图6D)。以一实验，观察Ley对HMGB1和rTMDl结合影响，是否LPS/Ley-rTMDl作用干扰HMGB1和rTMDl作用，因此LPS/Ley和HMGB1对TMD1之结合位重迭。结果显示，Ley无法废除HMGB1和rTMDl作用，这表明TMD1和HMGB1结合之调解结构区位并未与LPS/Ley之TMD1结合位重迭。
序列表
〈110〉吴华林施桂月 〈120〉抑制Lewis Y抗原过度表现的药物用途及Lewis Y抗原检测套组
〈130>9P04062-TW
〈160>6 〈170>PatentIn version 3. 4 〈210>1 〈211>187 〈212>PRT 〈213〉人类(Human) 〈220〉 〈221〉区位 〈222〉 (1) (187) 〈400〉 1 Glu Phe Ala Pro Ala Glu Pro Gin Pro Gly Gly Ser Gin Cys Val Glu
15 10 15 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala
20 25 30 Ser Gin lie Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser4045Ser Val AlaAlaAspVallieSer LeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGly505560Val Gly ArgArgArgLeuTrplie GlyLeuGinLeuProProGlyCys65707580Gly Asp ProLysArgLeuGlyPro LeuArgGlyPheGinTrpValThr859095Gly Asp AsnAsnThrSerTyrSer ArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsn100105110Gly Ala ProLeuCysGlyProLeu CysValAlaValSerAlaAlaGlu115120125Ala Thr ValProSerGluProlie TrpGluGluGinGinCysGluVal130135140Lys Ala AspGlyPheLeuCysGlu PheHisPheProAlaTyrLeuGlu145150155160Asp Asp AspAspLyslieGluGin LysLeulieSerGluGluAspLeu165170175Asn Ser AlaValAspHisHisHis HisHisHis180185〈210>2〈211>29〈212>DNA〈213〉人工设计序列〈220〉〈223>PCR引物(TMD-1S6I1S6)<220>〈221>misc_feature〈222〉 (1) (29)〈400>2ttggaattcgaggggcgag ccgcagccg29〈210>3〈211>29〈212>DNA〈213〉人工设计序列〈220〉〈223〉PCR引物(TMD-1 antisense)〈220〉〈221>misc_feature〈222〉 (1) (29):0131] 〈400〉3
:0132] aattctagat agcaggtggc tgggaagtg 29
:0133] 〈210>4
:0134] 〈211>35
:0135] 〈212〉DNA
:0136] 〈213〉人工设计序列
:0137] 〈220〉
:0138] 〈223>PCR引物(TMD-2 sense)
:0139] 〈220〉
:0140] 〈221〉misc_feature
:0141] 〈222〉 (1) (35)
:0142] 〈400>4
:0143] aaggaattcg cttgggactg cagcgtggag aacgg 35
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:0145] 〈211〉32
:0146] 〈212〉DNA
:0147] 〈213〉人工设计序列
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:0149] 〈223〉PCR引物(TMD-3 antisense)
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:0152] 〈222〉 (1) (32)
:0153] <400>5
:0154] aattctagat acgaatgcac gagccccacg gc 32
:0155] 〈210〉6
:0156] 〈211〉32
:0157] 〈212>DNA
:0158] <213>人工设计序列
:0159] 〈220〉
:0160] 〈223〉PCR引物(TMD2/EGF3 antisense) 〈220〉 〈221>misc_feature <222>(1). (32) 〈400>6 aattctagat actccacaca ctcgccgtcc ac 3权利要求
一种人类凝血酶调节素(thrombomodulin domain 1，TMD1)在抑制个体的Lewis Y抗原过度表现的药物用途，其特征在于该药物包含一有效量的TMD1 N端类凝集素区位(N-terminal lectin-like domain)或其类似物。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于该TMD1 N端类凝集素区位(N-terminal lectin-like domain)包含氨基酸序列SEQ ID No :1。
3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于该类似物是指不同种动物来源的凝血酶调 节素凝集素区位。
4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于该类似物另包含经点突变和化学修饰的凝 血酶调节素。
5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于该化学修饰包括聚乙二醇化或醣基化。
6. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于该个体是哺乳动物。
7. 根据权利要求l所述的用途，其特征在于减缓多形核噬中性球(Polymorphonuclear neutropils， PMNs)的肺部浸润，并保护肾脏功能。
8. 根据权利要求l所述的用途，其特征在于该Lewis Y抗原表现于癌细胞、葛兰氏阴性 菌或脂多醣(lipopolysacharide， LPS)。
9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于该癌细胞为内皮细胞衍生肿瘤包含乳癌、 胰脏癌、卵巢癌、大肠癌、胃癌或肺癌。
10. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于抑制LPS或葛兰氏阴性菌诱导的发炎反应 和败血性休克。
11. 根据权利要求10所述的用途，其特征在于降低LPS诱导发炎反应的中介物TNF-a 或一氧化氮生成。
12. 根据权利要求11所述的用途，其特征在于LPS诱导发炎反应的讯息传递路径包括 ERK及p38的磷酸化，IkB降解，NF-kB往细胞核移动及增加诱导型一氧化氮合成酶(iNOS) 和TNF-a的表现。
13. 根据权利要求12所述的用途，其特征在于将人类凝血酶调节素(TMDl)N端类凝集 素区位(N-terminal lectin-like domain)和LPS或葛兰氏阴性菌的Lewis Y抗原结合， 诱导细菌的凝集作用或调和作用(opsonization)，以抑制发炎反应和败血性休克。
14. 根据权利要求13所述的用途，其特征在于该细菌凝集会使巨噬细胞(macrophage) 对细菌进行胞吞作用。
15. —种用于侦测一个体的样本中过度表现Lewis Y抗原的癌细胞、葛兰氏阴性菌 或LPS的检测套组，其特征在于该检测套组包含TMDl N端类凝集素区位(N-terminal lectin-like domain)或其类似物。
16. 根据权利要求15所述的检测套组，其特征在于该TMD1 N端类凝集素区位 (N-terminal lectin-like domain)包含氨基酸序列SEQ ID No :1所组成的蛋白质区位 (domain)。
17. 根据权利要求16所述的检测套组，其特征在于该蛋白质区位连接到可检测的标记上。
18. 根据权利要求15所述的检测套组，其特征在于该个体为哺乳动物。
19. 根据权利要求15所述的检测套组，其特征在于该样本为血液，组织，体液，细胞或个体的排泄物。
20.根据权利要求17所述的检测套组，其特征在于该可检测的标记选自于荧光物质、 冷光物质、放射物质、呈色物质、生物素、吖啶(acridinium)酯或吖啶-9-羧胺。
全文摘要
本发明提供一种抑制Lewis Y抗原过度表现的药物用途，该药物包含一有效量之人类凝血酶调节素(TMD1)N端类凝集素区位(N-terminallectin-like domain)或其类似物。本发明另包含利用前述药物侦测过度表现Lewis Y抗原之癌细胞，葛兰氏阴性菌或脂多醣的检测套组。
文档编号G01N33/52GK101721679SQ20091020945
公开日2010年6月9日 申请日期2009年10月30日 优先权日2008年10月30日
发明者吴华林, 施桂月 申请人:吴华林;施桂月