专利名称：一种定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，特别是一种定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的
试剂盒，该试剂盒以实时荧光定量聚合酶链反应技术，能够早期、快速判断样品是否被副溶 血性弧菌污染。
背景技术：
副溶血性弧菌(又称嗜盐菌Vibrio Parahaemolyticus VP)是革兰氏阴性多形态 杆菌或稍弯曲弧菌。本菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，3% 6%食盐水繁殖迅速， 每8 9分钟为1周期，低于0. 5%或高于8%盐水中停止生长。在食醋中1 3分钟即死 亡，加热至56t:，在5 10分钟灭活，在浓度1%的盐酸中，5分钟内死亡。它在自然界中广 泛存在，是一种条件致病菌，可引起人和动物致病，引起内脏出血、胃肠中毒症状，临床上可 引起败血症、胃肠道感染、内脏出血等。由于副溶血性弧菌有12种0抗原及59种K抗原， 据其发酵糖类的情况可分为5个类型。各种弧菌对人和动物均有较强的毒力，其致病物质 主要有致热性溶血素(TDH)和TDH类似溶血素(TRH)，具有溶血活性、肠毒素和致死作用。
副溶血性弧菌食物中毒也称嗜盐菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要 来自海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬 菜。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。主要病理变化为空肠及回 肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏(肝、脾、肺)淤血等。 传统的副溶血性弧菌的检测方法主要依靠副溶血性弧菌的生物学特征(如革兰 阴性菌，嗜盐惧酸、能产致热性溶血素等)结合多种生化试剂进行检测，该方法具有一定的 特异性和敏感性，但操作繁琐且耗时长，主要用于对大规模样品进行检测。由于副溶血性 弧菌感染进展快，易耐药，病死率高，传统的检测方法有可能延误诊断和治疗，因此，开发早 期、快速的检测技术非常必要。 近年来，随着分子诊断技术的飞速发展，聚合酶链反应(PCR)技术已经广泛应用 于细菌、病毒基因水平的研究，也给卫生条件的快速鉴定提供了可能。国内外已经有部分实 验室采用PCR扩增核酸来检测副溶血性弧菌，如钟凯等通过扩增16S rRNA基因来检测冷冻 虾仁、沙丁鱼是否受到副溶血性弧菌的污染。 实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电 偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环 的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性的发出特定波长的激发光，收集检测荧光信 号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。T叫man PCR技术是实时荧光PCR的一 禾中(Mackay IM et al. Real—time PCR in virology. Nucleic AcidsRes. 20025 ;30 (6): 1292—1305 ;Lie， Y. s. ， Petropoulos， c.j. ， Advancesin quantitative PCR technology : 5'皿clease assays. CurrentOpinion in Biotechnology 1998. 9，43-48.)。 与传统的PCR 相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针 结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相 互解离，阻断了二者荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进 行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。 与普通PCR相比，T叫Man PCR技术有如下有点通过对扩增曲线以及对数增长期 的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的重点分析方法，能够对检测 样品进行准确定量分析，从而有效检测药物治疗的效果将DNA扩增与检测过程融合为一 体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程，大大縮短了结果分析时 间，使得该方法更加快捷、方便；由于采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和 由此造成的假阳性；由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，进 一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析 中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。 美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂 盒，如用于HIV，结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光检测的试剂盒。同样，中国目前也 已批准了乙型肝炎、丙型肝炎、HPV、 HIV和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临 床应用。因此，现在亟待需要发展一种能够检测副溶血性弧菌的实时荧光PCR方法，满足副 溶血性弧菌的检测与监测工作的需要。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂
盒，该试剂盒使用实时荧光PCR技术来定性及定量检测样品中副溶血性弧菌微量污染及感
染早期在实验室诊断中的应用。其基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物和一条靶
多核苷酸的特异性探针，在耐热DNA聚合酶、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及
Mg2+等PCR反应缓冲液中，通过TL988、 ABI7500等荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环
扩增，从而达到快速、实时、定量检测靶多核苷酸的目的。 为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案 —种定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，该试剂盒包括分别包 装的DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量标准品并加盖密封的多 个试剂瓶或试管，其特征在于，所述的PCR扩增反应液中含有靶多核苷酸扩增的正向引物 VP-F、反向引物VP-R、寡核苷酸探针VP-P、耐热DNA聚合酶以及脱氧核糖核苷三磷酸。
所述的正向引物VP-F和反向引物VP-R以及寡核苷酸探针VP-P的核苷酸序列是
正向引物VP-F : 5' -CGGTAGTAAACACACTGTCAG-3';
反向引物VP-R : 5' -GTTTCAGGCTCACCATGACG-3'; 其中，正向引物VP-F可向5'和3'端方向各延伸3个碱基，反向引物VP-R可向5'
和3'端方向各延伸3个碱基； 所述的寡核苷酸探针的核苷酸序列是 寡核苷酸探针VP-P :5'-CATATCCACACGCAAACTTACCG-3' (SEQ IDN0:3)，该寡核苷 酸探针可向5'和3'端方向各延伸3个碱基。 所述的PCR扩增反应中的正向引物VP-F和反向引物VP-R的浓度均为0. 33umo1/ L，所述的寡核苷酸探针VP-P浓度为0. 22umol/L。
所述的PCR扩增反应液中还有浓度为2. 5mmol/L的镁离子。
所述的PCR扩增反应液中的耐热DNA聚合酶的浓度为2U/人份。
所述的PCR扩增反应液中的脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为0. 2mmol/L。
所述的DNA提取液由chelex-lOO、 NaOH、 EDTA组成。 本发明的定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，可以检测出副溶血
性弧菌的最低浓度为5X 102个/ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。 本发明针对副溶血性弧菌的外毒素基因保守区设计特异性引物和寡核苷酸探针，
可检测出副溶血性弧菌病原体，但不能检出非副溶血性弧菌病原体，说明本试剂盒具有很
好的特异性。 本发明的定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，可以检测食品样品 及临床胃肠道炎症、内脏出血等疾病患者的呕吐物、血液、粪便等样品中的副溶血性弧菌病 原体，可为灵敏、快速早期诊断副溶血性弧菌污染及感染和诊断副溶血性弧菌反复感染提 供可靠的实验证据；同时由于能够准确定量，所以可对临床用药进行有效监测。
图l显示3个阳性参考品的检测结果图，3个阳性参考品的Ct值为17 28，扩增 曲线有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳性。 图2显示阴性参考品的检测结果图，7个阴性参考品的扩增曲线平直且与阈值线 无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。7个阴性参考品包括近源种明斯特沙门氏菌，痢 疾志贺氏菌，奇异变形杆菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌，阴沟肠杆菌，蜂房哈夫尼亚菌，粘质沙 雷氏菌，都是从中国微生物菌种保藏管理委员会所购买的标准菌株。 图3显示线性与灵敏度标准品扩增结果的标准曲线。针对模板数为5. OX 101 1.0Xl(f个/ml的反应体系进行TaqMan PCR分析。当副溶血性弧菌个数为5. 0 X 102个时， 检测样品的Ct值在35左右，即检测下限灵敏度可达5. OX 102个/ml。绘制得到的标准曲 线斜率为-3.43，在Y轴的的截距为34.64，相关系数(R2) = 0.994。 图4显示同一份阳性标本10次重复性实验的检测曲线，可看出不同的扩增曲线均 在同一Ct值范围，变异系数CV〈5X，说明试剂盒的重复性好。 图5显示六个临床阳性标本的扩增曲线。六个标本的Ct值分别是23.83，24.63， 26. 02,27. 05,27. 28,29. 61 ;结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式
本发明是一种检测怀疑被副溶血性弧菌污染的食品样品和临床上怀疑因感染副 溶血性弧菌而发生的胃肠炎，内脏出血性疾病等患者样品中的病原体副溶血性弧菌存在的 试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断副溶血性弧菌污染 或感染的试剂盒。 众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析食品及临床样品 某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准 确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。申请人将实时荧光定量PCR技术应用于副溶血性弧菌的所有已知变异 体之基因组多核苷酸的检测和定量分析，成功地实现了本发明。 本发明的定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，包括分别包装的 DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量标准品并加盖密封的多个试 剂瓶或试管，和分隔并集中包装这些试剂瓶或试管的包装盒，PCR扩增反应液中含有靶多核 苷酸扩增的正向引物VP-F、反向引物VP-R、寡核苷酸探针VP-P、耐热DNA聚合酶以及脱氧核 糖核苷三磷酸。 上述正向引物VP-F和反向引物VP-R以及寡核苷酸探针VP-P的核苷酸序列是 正向引物VP-F :5'—CGGTAGTAAACACACTGTCAG-3， (SEQ ID N0:1); 反向引物VP-R :5'-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3' (SEQ ID NO :2); 其中，正向引物VP-F可向5'和3'端方向各延伸3个碱基，反向引物VP-R可向5'
和3'端方向各延伸3个碱基。 寡核苷酸探针的核苷酸序列是 寡核苷酸探针VP-P :5'-CATATCCACACGCAAACTTACCG-3' (SEQ IDN0:3)，其中该寡
核苷酸探针序列可向5'和3'端方向各延伸3个碱基。 上述DNA提取液由chelex-100、NaOH、EDTA组成。 上述PCR扩增反应液中至少含有 (a)耐热DNA聚合酶，最佳用量为2U/人份； (b)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，最佳浓度为0. 20mmol/L ; (c)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物VP-F，最佳浓度均为 0.33umol/L ; (d)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物VP-R，最佳浓度均为 0.33umol/L ; (e)能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团 的寡核苷酸探针VP-P，最佳浓度为0. 22umol八 (f)PCR扩增反应液中还有镁离子，最佳镁离子浓度为2. 5mmol/L。 其中，正向引物VP-F和反向引物VP-R的浓度均为O. 33umol/L，所述的寡核苷酸探
针VP-P浓度为0. 22umol/L。 用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为93°C ，预变性5 8分钟；然后93°C ， 15 秒，58 °C ， 40秒，共40个循环。 上述阴性质控品为不含副溶血性弧菌的液体培养基或生理盐水。 上述阳性质控品为副溶血性弧菌弧菌标准菌株培养液，包括3X 107个/ml的强阳
性质控品和3X 103个/ml的临界阳性质控品。 上述定量标准品为副溶血性弧菌标准株培养液，包括4个浓度梯度即3Xl(f个 /ml、3X106个/ml、3Xl()5个/ml和3Xl()4个/ml。
以下是发明人给出的具体的实施例。
实施例1 :副溶血性弧菌检测试剂的研制 1、引物和探针的设计通过对Genbank数据库已有的全部副溶血性弧菌核酸序列 以及国内外已发表文献中报导的核酸序列进行序列比对分析，以与副溶血性弧菌致病有关的主要毒力因子外毒素基因为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物 和探针设计的基本原则，利用软件和人工设计多对引物和探针。
2、临床样本的选择根掘国内外相关文献报道，检测的样品可选自各种食品标本， 如海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜； 也可选自临床上因食用副溶血性弧菌污染可疑的患者的血液、尿液、粪便等样品。
3、反应体系的建立与优化 1)样品的准备以中国微生物菌种保藏管理委员会的副溶血性弧菌标准菌株作 为副溶血性弧菌检测的阳性标准品；以明斯特沙门氏菌，痢疾志贺氏菌，奇异变形杆菌，小 肠结肠炎耶尔森氏菌，阴沟肠杆菌，蜂房哈夫尼亚菌，粘质沙雷氏菌作为阴性参考品。分别 用DNA提取液煮沸法提取上述阳性标准品与阴性参考品的基因组DNA待用。
2)引物和寡核苷酸探针的筛选以上述1中设计的多组引物探针分别检测上述的 阳性质控品与阴性质控品的基因组DNA，经反复试验，筛选出以下特异性、灵敏度和重复性 好的最佳引物和寡核苷酸探针组合 正向引物VP-F :5'—CGGTAGTAAACACACTGTCAG-3， (SEQ ID N0:1)
反向引物VP-R :5'-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3' (SEQ ID NO :2)
寡核苷酸探针VP-P :5'-CATATCCACACGCAAACTTACCG-3' (SEQ IDNO :3);
3)正向引物、反向引物和寡核苷酸探针浓度的优化 在PCR扩增反应液中其他组分不变的情况下，分别使用从O. 15umol/L至0. 5咖o1/ U农度梯度的引物和从O. 075umol/L至0. 5umol/L浓度梯度的寡核苷酸探针进行PCR反应， 经多次重复试验，最终确定最佳的正向引物VP-F和反向引物VP-R浓度为0. 33umol/L、寡核 苷酸探针VP-P浓度为0. 22umol/L。
4)镁离子浓度的优化 在反PCR扩增反应液其它组分不变的情况下，分别使用从lmmol/L至3mmol/L浓 度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为2. 5mmo1/ L。 5)耐热DNA聚合酶用量的优化 在40uL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1U (酶单位)至8U浓度 梯度的酶用量/人份进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的酶用量为2U/人份。
6)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)浓度的优化 在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从O. lmmol/L至0. 25mmol/L浓度 梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0. 20mmol/L。
5)反应温度的优化根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸 时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的退火温度和时间为93t:预变性，5 8min ;然后93°C ， 15s， 58°C ， 40s，共40个循环。 4、灵敏度实验以麦氏比浊法测定上述ATCC的副溶血性弧菌标准株纯培养物的 浓度为3. 0 X 109个/mL，然后10倍梯度稀释成3. 0 X 106个/mL、3. 0 X 105个/mL、3. 0 X 104 个/mL、3. OX 103个/mL、3. OX 102个/mL、3. OX 101个/mL。作为副溶血性弧菌线性灵敏度 定量标准品，检测结果表明，本试剂盒的灵敏度为5. OX 102个/mL。 5、临床标本检测以怀疑被副溶血性弧菌污染的食品作为待检标本，分别用DNA提取液煮沸法提取标本的基因组DNA后，经上述优化建立的核酸扩增体系检测，结果表明
本试剂盒可以很灵敏的检测出临床标本中的副溶血性弧菌病原体。 实施例2 :副溶血性弧菌检测试剂盒及其应用 1、制备包括下列组成成分的试剂盒DNA提取液2管(500ul/管)、PCR扩增反应 液20管(20ul/管)、阴性质控品l管(100ul/管)、阳性质控品l管(50ul/管)、定量标准 品4管(50ul/管)。
2、标本采集、运送和保存 (1)标本采集包括各种食品标本，如血液、尿液、痰液、脓汁以及穿剌液等，亦包 括来自医院临床上的各种标本，如呕吐物、血液、粪便等，按照PCR取样要求进行操作；按照 国家化妆品微生物检验标准进行操作。密闭送检。
(2)标本保存和运送标本可立即用于测试，也可保存于一 2(TC待测，保存期为6
个月。标本运送时应保存在(TC 8°C 。 3、检测步骤 (1)标本处理与DNA提取 增菌处理与DNA提取上述采集的各类标本都可以按照国家有关副溶血性弧菌 标准培养方法进行增菌后，取菌液50ul加入50ul DNA提取液中充分混匀，IO(TC恒温处理 10±1分钟，12，000rpm离心5分钟，备用; 非增菌处理与DNA提取根据不同类型的标本选择合适的方法或以常规的核酸提 取试剂盒方法进行DNA提取。 以痰液为例痰液中加入4倍体积的4% NaOH溶液，混匀后室温或65。C水浴30分 钟；用枪头或吸管混匀后吸取lml至1. 5ml离心管中，5， OOOrpm离心5分钟；去上清，留沉 淀及液体约20ul，加入lml灭菌生理盐水，混匀后12， OOOrpm离心5分钟；去上清，留沉淀 及液体约20ul，加入30ulDNA提取液充分混匀，IO(TC恒温处理10±1分钟，以12， OOOrpm离 心5分钟，备用。 (2)PCR反应与结果分析 分别取阴性质控品、标本、阳性质控品、定量标准品各5ul，加入PCR反应管中进行 PCR扩增。PCR循环条件是93°C ，预变性5min ;然后93°C ， 15s， 58°C ， 40s，共40个循环。
反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线图调节分析参 数，使标准曲线(Std curve)窗口下的标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值> 0. 97) (参见附图3所示)。由附图1可以看出，阳性样品的荧光曲线与设定的阈值线有一交点， 由交点所在位置得出Ct值分别为26. 77,30. 34,33. 04 ;在附图2中，由于阴性标本的荧光 曲线低于阈值，故没有Ct值。最后由仪器自动分析装置计算出未知标本的测定数值(Qty)， 即标本中副溶血性弧菌的浓度分别为6. 04X 105、8. 38X 103、1. 36X 103(个/ml)。
实施例3 :应用副溶血性弧菌检测试剂盒定量检测临床样品 临床样品来自南京儿童医院的半固体培养物，直接取上层培养物50ul作为待测 物，标本处理与DNA提取、PCR反应与结果分析参照实施例2进行。 PCR反应结束后，根据扩增曲线先调节分析参数，使标准曲线(Std curve)窗口 下的标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值>0.97)，然后分析临床样品。临床样品的 检测结果如附图5所示六个临床阳性标本扩增曲线的Ct值分别是23. 83,24. 63,26. 02，27.05,27. 28，29.61，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。参照同一次试 验中线性定量参考品的标准曲线图(如附图3所示)可以判定六个临床阳性标本的副溶血 性弧菌浓度分别为1. 53X 1067、5. 37X 106、9. 12X105、5. 11X105、4. 22X 105、9. 14Xl(f个
'ml。
0091]核苷酸序列表
0092]〈110〉西安天隆科技有限公司
0093]〈120〉 一种定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒
0094]〈140〉
0095]〈141〉
0096]〈160>3
0097]〈210>SEQ ID NO :1
0098]〈211>21
0099]〈212>DNA
0100]〈213〉人工序列
0101]〈220〉
0102]〈223〉
0103]〈400>SEQ ID NO :1
0104]CGGTAGTAAACACACTGTCAG
0105]〈210>SEQ ID NO :2
0106]〈211>20
0107]〈212>DNA
0108]〈213〉人工序列
0109]〈220〉
0110]〈223〉
0111 ]〈400>SEQ ID NO :2
0112]GTTTCAGGCTCACCATGACG
0113]〈210>SEQ ID NO :3
0114]〈211>23
0115]〈212>DNA
0116]〈213〉人工序列
0117]〈220〉
0118]〈223〉
0119]〈400>SEQ ID NO :3
0120]CATATCCACACGCAAACTTACCG
权利要求
一种定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，该试剂盒包括分别包装的DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量标准品并加盖密封的多个试剂瓶或试管，其特征在于，所述的PCR扩增反应液中含有靶多核苷酸扩增的正向引物VP-F、反向引物VP-R、寡核苷酸探针VP-P、耐热DNA聚合酶以及脱氧核糖核苷三磷酸。
2. 如权利要求1所述的定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在 于，所述的正向引物VP-F和反向引物VP-R以及寡核苷酸探针VP-P的核苷酸序列是正向引物VP-F:5' -CGGTAGTAAACACACTGTCAG-3'; 反向引物VP-R:5' -GTTTCAGGCTCACCATGACG-3';其中，正向引物VP-F可向5'和3'端方向各延伸3个碱基，反向引物VP-R可向5'和 3'端方向各延伸3个碱基；所述的寡核苷酸探针的核苷酸序列是寡核苷酸探针VP-P :5'-CATATCCACACGCAAACTTACCG-3' (SEQ IDN0 :3)，该寡核苷酸探 针可向5'和3'端方向各延伸3个碱基。
3. 如权利要求1所述的定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在 于，所述的PCR扩增反应中的正向引物VP-F和反向引物VP-R的浓度均为0. 33umol/L，所述 的寡核苷酸探针VP-P浓度为0. 22umol/L。
4. 如权利要求1所述的定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在 于，所述的PCR扩增反应液中还有浓度为2. 5mmol/L的镁离子。
5. 如权利要求1所述的定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在 于，所述的PCR扩增反应液中的耐热DNA聚合酶的浓度为2U/人份。
6. 如权利要求1所述的定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在 于，所述的PCR扩增反应液中的脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为0. 2mmol/L。
7. 如权利要求1所述的定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在 于，所述的DNA提取液由chelex-100、 NaOH、 EDTA组成。
8. 如权利要求1所述的定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在 于，所述的阴性质控品为不含副溶血性弧菌的液体培养基或生理盐水。
9. 如权利要求1所述的定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在 于，所述的阳性质控品为副溶血性弧菌弧菌标准菌株培养液，包括3X 107个/ml的强阳性 质控品和3X 103个/ml的临界阳性质控品。
10. 如权利要求1所述的定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，其特征 在于，所述的定量标准品为副溶血性弧菌标准株培养液，包括4个浓度梯度即3X 107个/ ml、3X106个/ml、3Xl()5个/ml和3Xl()4个/ml。
全文摘要
本发明公开了一种定量检测食品及临床样品中副溶血性弧菌的试剂盒，该试剂盒包括分别包装的DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性标准品、阳性参考品和定量标准品并加盖密封的多个试剂瓶或试管，其特征在于，所述的PCR扩增反应液中含有靶多核苷酸扩增的正向引物VP-F、反向引物VP-R、寡核苷酸探针VP-P、耐热DNA聚合酶以及脱氧核糖核苷三磷酸。可以检测食品样品及临床胃肠道炎症、内脏出血等疾病患者的呕吐物、血液、粪便等样品中的副溶血性弧菌病原体，可为灵敏、快速早期诊断副溶血性弧菌污染及感染和诊断副溶血性弧菌反复感染提供可靠的实验证据；同时由于能够准确定量，所以可对临床用药进行有效监测。
文档编号G01N21/64GK101709331SQ20091021860
公开日2010年5月19日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者彭年才, 李红东, 焦刚, 赤宏涛 申请人:西安天隆科技有限公司