白前提取物的质量控制方法

文档序号:5843187阅读:276来源:国知局

专利名称::白前提取物的质量控制方法
技术领域
:本发明涉及白前提取物的质量控制方法,更具体的是通过高效液相色谱对白前提取物质量进行控制的方法。
背景技术
:植物性杀虫、杀菌和除草剂的研究和利用,一直广受世界各国的重视。我国是最早利用植物性生物制剂的国家,但应用水平一直处于比较低级层次,主要是利用植物的初提物,而且应用领域狭窄,面积不大,没有形成规模,且大都没有建立系统的制剂质量控制标准,使得产品质量不稳定,难以形成规模。因此,近几十年来几乎没有推出成功的新产品。国外对植物性杀虫剂的研究相对较多,比较成功的有除虫菊素、印楝素等,印楝素类杀虫剂的产值已经超过数亿美元,人工种植的印楝树已经遍及世界各地,印楝树也被认为是解决全球化学农药污染的希望之树。另外,除虫菊素等药源植物也已经在发达国家的有机生产中广泛应用,其人工种植技术、活性成分提高技术等均在深入研究之中。目前,各国科学家均在寻找有效的植物资源,以期开发出更高效的植物源杀虫杀菌除草剂。从我国现实情况来看,发展和选用药源植物并从中提取植物性杀虫剂是一条非常有效的途径。一方面可以使废弃甚至有害资源综合利用,另一方面,又可为我国无害化农产品生产提供新的技术支持。白前提取物对鳞翅目害虫具有很高的拒食活性,因此利用白前提取物开发生产的杀虫剂具有绿色环保,低毒无害等优点,符合可持续发展的目标。但是,目前还没有建立起白前生物活性提取物的质量控制标准,这在很大程度上限制了白前提取物作为杀虫剂的应用。因此,建立白前提取物质量控制标准对白前类生物制剂进行质量控制,有利于提升我国药源植物生物制剂的质量控制技术,也可为今后在我国促进一类新型植物性杀虫制剂的开发应用,提高植物性杀虫或抗菌剂的杀灭效果提供新的技术支持。
发明内容本发明的目的是提供白前提取物的质量控制方法。本发明所提供的白前提取物的质量控制方法,包括下述步骤1)将白前提取物溶于乙腈和水的混合溶剂中,得到白前提取物溶液;2)采用高效液相色谱法分析所述白前提取物溶液,色谱条件为色谱柱为C18半制备柱,规格20mmX250mm;检测波长230nm±2.Onm;流动相为乙腈-水,体积比为70-85:30-15;流速12-18ml/min;得到白前提取物的高效液相色谱;3)采用面积归一化法计算各色谱峰的含量,将保留时间为4.0-7.5min的所有色谱峰的含量进行加和,若含量大于等于23%,则视为合格,含量小于23%,则视为不合格。其中,步骤2)中所述流动相优选体积比为80:20的乙腈-水的混合溶剂;所述流速优选为15ml/min。步骤1)所述混合溶剂中乙腈与水的积比具体可为70-85:30-15,优选80:20。所述白前提取物溶液中白前提取物的浓度可为0.02-0.07g/ml,优选0.05g/ml。在对白前提取物溶液进行高效液相色谱分析前,还需对所述白前提取物溶液进行过滤,以除去不溶物,得到澄清的绿色溶液。本发明中所述白前提取物可按照专利CN101156604"白前提取物及其制备方法与应用"中的方法进行制备,具体方法如下采用酸乙醇溶液作为提取溶剂,浸提白前植株,得到白前粗提物,然后将所述白前粗提物溶于O.5-0.6mol/L盐酸水溶液中,用氯仿萃取,收集水层,加氨水调节pH值为9-10,再以氯仿萃取,回收氯仿层,除去氯仿,得到白前提取物;所述酸乙醇是由无机酸和乙醇组成的溶液。本发明根据白前提取物对鳞翅目害虫具有很高的拒食活性、生物活性提取物在紫外下显色、提取物的拒食活性与其中所含的活性成分的含量密切相关以及活性成分含量与其峰面积含量有关等特点,采用紫外扫描和高效液相色谱等技术,系统地建立了白前生物活性提取物质量控制标准,对白前类生物制剂进行质量控制。本发明系统地提出了白前活性成分提取物质量控制方法,有利于提升我国药源植物生物制剂的质量控制技术,从而为今后在我国促进一类新型植物性杀虫制剂的开发应用,提高植物性杀虫或抗菌剂的杀灭效果提供新的技术支持,为此类中草药植物的综合开发利用提供新技术手段。图1为检测波长依次为210nm、230nm、254nm、260nm、270nm和280nm的条件下,白前提取物溶液的高效液相色谱图。图2为230nm波长条件下分析白前提取物溶液的高效液相色谱图。图3为白前提取物质量控制流程图。具体实施例方式以下通过具体实施例,对本发明提供的白前提取物的质量控制方法加以说明,但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。下述实施例中"乙腈_水"表示为乙腈和水的混合溶剂。实施例1、白前提取物的质量检测按照图3中的流程图对白前提取物进行质量控制。1)分析样品的制备a:白前提取物的制备用2L酸乙醇(其中,盐酸的摩尔浓度为12mol/L,乙醇的摩尔浓度为17mo/L)浸提2kg白前植株6目干法72小时,浸提4次,将4次的浸提液混合,得到浸膏,将浸膏溶于0.5-0.6mol/L盐酸水溶液中,用氯仿萃取,收集水层,加氨水调节pH值为9_10,再以氯仿萃取,回收氯仿层,除去氯仿,得到3.30白前粗提物,重复上述萃取步骤,得到l.16g精制的白前提取物。b、将lg精制的白前提取物溶于20ml乙腈_水(体积比80:20)中,得到浓度为0.05g/ml的绿色溶液,过滤除去不溶物,得到澄清的绿色溶液,4t:冷藏保存。2)检测波长的确定4高效液相色谱P3000型高压输液泵,UV2000型可变波长紫外分光检测器;色谱条件流动相乙腈-水(体积比80:20),流速15ml/min,进样量5-8ul,色谱柱C18半制备柱(20mmX250mm)(北京创新通恒科技有限公司)。按照上述色谱条件,分别选择210nm,230nm,254nm,260nm,270nm和280nm的波长,对白前提取物溶液进行HPLC分析,得到色谱图见图1。根据分离情况(见图1),确定230nm±2.Onm为合适的检测波长。3)分离不同的组分采用高效液相色谱仪进行分离制备,检测波长为230nm±2.Onm,其它色谱条件同2),得到的色谱图见图2。活性物质分7段收集提取物,得到7个组分,即组分1:1.0-4.Omin;组分2:4.0-7.5min;组分3:7.5-9.Omin;组分4:9.0-12.Omin;组分5:12.0-14.Omin;组分6:14.0-22.Omin;组分7:22.0-32.Omin。4)确定活性组分将分离得到的7个组分,进行室内生物活性测定。具体方法为采用传统的叶碟法,将上述组分1-7均配成浓度为2070mg/ml的溶液,然后选取结净的甘蓝叶片,用打孔器打出叶碟,将叶碟分别在组分1-7的溶液中浸ls后取出,放在洁净的台面上自然晾干,然后将叶碟置于垫有保湿滤纸的9cm培养皿中;另设只浸泡无水乙醇的甘蓝叶片为对照,每皿4片叶,放入三龄的斜纹夜蛾1头。24h、48h后用叶面积测定仪分别测定剩余叶面积,据此计算取食叶面积和拒食率。选择性拒食率=(对照组取食叶面积-处理组取食叶面积)+(处理组取食叶面积+对照组取食叶面积)。试验设3次重复。结果见表l,表1中的数据为三次重复平均值±标准差。结果表明,组分2为高活性组分,判定组分2为质量控制对象。表1高效液相色谱分离制备所得各组分的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注同列数据后标不同字母者,表示经LSD法于0.5X水平有显著差异,大写字母表示在1%水平不同组分之间有极显著差异。5)测定活性组分色谱峰的含量及制定控制标准采用3)中的色谱条件,重复测试待测提取物15次,采用面积归一化法计算各色谱峰的含量,将组分2(保留时间为4.0-7.5min)的所有色谱峰的含量进行加和,结果见表2。组分2的峰含量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>将上述15次的测定结果进行统计分析,计算得到15次结果的平均值为25.17%,变异系数为O.08,。25.172%*0.92=23.158%,故制定标准大于等于23%的样品视为合格。权利要求白前提取物的质量控制方法,包括下述步骤1)将白前提取物溶于乙腈和水的混合溶剂中,得到白前提取物溶液;2)采用高效液相色谱法分析所述白前提取物溶液,色谱条件为色谱柱为C18半制备柱,规格20mm×250mm;检测波长230nm±2.0nm;流动相为乙腈-水,体积比为70-85∶30-15;流速12-18ml/min;得到白前提取物的高效液相色谱;3)采用面积归一化法计算各色谱峰的含量,将保留时间为4.0-7.5min的所有色谱峰的含量进行加和,若含量大于等于23%,则视为合格,含量小于23%,则视为不合格。2.根据权利要求l所述的方法,其特征在于步骤2)中所述流动相为体积比为80:20的乙腈-水的混合溶剂;3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于步骤2)中所述流动相的流速为15m1/min。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于步骤1)所述混合溶剂中乙腈与水的体积比为70-85:30-15。5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于步骤1)所述混合溶剂中乙腈与水的体积比为80:20。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于步骤1)所述白前提取物溶液中白前提取物的浓度为0.02-0.07g/ml。7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于步骤l)所述白前提取物溶液中白前提取物的浓度为0.05g/ml。8.根据权利要求1-7中任一所述的方法,其特征在于所述白前提取物是按照下述方法提取得到的采用酸乙醇溶液作为提取溶剂,浸提白前植株,得到白前粗提物,然后将所述白前粗提物溶于0.5-0.6mol/L盐酸水溶液中,用氯仿萃取,收集水层,加氨水调节pH值为9-10,再以氯仿萃取,回收氯仿层,除去氯仿,得到白前提取物;所述酸乙醇是由无机酸和乙醇组成的溶液。9.根据权利要求1-8中任一所述的方法,其特征在于所述方法还包括对步骤1)中得到的白前提取物溶液进行过滤的步骤。全文摘要本发明公开了一种白前提取物的质量控制方法。该方法包括下述步骤1)将白前提取物溶于乙腈和水的混合溶剂中,得到白前提取物溶液;2)采用高效液相色谱法分析所述白前提取物溶液,色谱条件为色谱柱为C18半制备柱,规格20mm×250mm;检测波长230nm±2.0nm;流动相为乙腈-水,体积比为70-85∶30-15;流速12-18ml/min;得到白前提取物的高效液相色谱;3)采用面积归一化法计算各色谱峰的含量,将保留时间为4.0-7.5min的所有色谱峰的含量进行加和,若含量大于等于23%,则视为合格,含量小于23%,则视为不合格。本发明提出了白前活性成分提取物质量控制方法,有利于提升我国药源植物生物制剂的质量控制技术,为此类中草药植物的综合开发利用提供新技术手段。文档编号G01N30/36GK101696961SQ20091023551公开日2010年4月21日申请日期2009年9月29日优先权日2009年9月29日发明者凌云,杨新玲,石旺鹏,郭艳艳申请人:中国农业大学;
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