专利名称：一种用于小麦白粉病流行监测的微量病菌Real-time PCR定量检测方法
技术领域：
本发明涉及植物病害流行监测领域，特别是涉及一种小麦白粉病的监测方法。
背景技术：
由布氏白粉菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)引起的小麦白粉病在世界各麦区均有发生。目前此病害已成为我国小麦生产上的重要病害之一，病害流行的预测预报和风险估计是综合防治的重要部分。尽早、准确地估计病害发生趋势是有效预测预报的关键。虽然我国小麦白粉病发生规律因地区和气候条件而异，但对越冬麦苗和越夏自生麦苗的潜育侵染程度做及时、准确的监测成为不同地区病害预测预报和风险估计中普遍存在的关键环节。而这方面的进展受到传统、落后方法的制约，如叶片或幼苗取样培养方法耽工、 费时、灵敏性差。快速发展的分子生物学技术为准确检测潜育侵染阶段的病害提供了有效的工具。分子生物学技术已经广泛用于病害诊断和检测，但用于病害流行监测的报道不多。常规PCR技术是最基础的一种分子检测技术，但是它只能检测到一定量以上的病原菌 DNA，对于含量较低的情况，很难检测到病原菌的存在即检测的敏感性不好；同时它只能检测到病菌的有无，无法定量检测一定单位寄主小麦中病原菌的侵染数量，就不能为植保工作人员提供病害真实的发生程度，从而影响对病害准确的预测预警。
发明内容
本发明根据上述领域的缺陷，提供一种用于小麦白粉病流行监测的微量病菌 Real-timePCR定量检测方法，具有精确、快速、简便的优点。一种用于小麦白粉病流行监测的微量病菌Real-time PCR定量检测方法，步骤如下(1)在目标监测地区的麦田内随机采取分蘖期GS22的小麦叶片，并提取DNA为模板，以如下白粉菌特异引物5，-AAGCTATGCGGAACTTCGTTT-3，；5，-TAAGGAGTTTTGGCAAGTCCC-3，进行 Real-time PCR 检测，根据标准曲线 Y1 =-3. 034X1+11. 485，r2 = 0. 994，其中 Y1 为 Real-time PCR 反应的 Ct 值，X1 为白粉菌 DNA 的起始浓度对数值，计算得到白粉菌DNA浓度；(2)以第(1)步中提取的DNA为模板，以如下小麦特异引物 5' -CAACCACTCTCAACGGGAA-3, 5‘ -TCAAAGGTCATAATGCCAGC-3‘进行 Real-time PCR检测， 记录根据标准曲线 Y2 = -3. 163X2+6. 252，r2 = 0. 998，其中 Y2 为 Real-time PCR 反应的 Ct 值，X2为小麦DNA的起始浓度对数值，计算得到小麦DNA浓度；(3)若在彡0. 000023时，说明在所述目标监测地区的麦田内将会发生白粉病流行感染，比值越高，病情指数越高，说明白粉菌流行程度越高。步骤(1)中所述对小麦白粉菌Real-time PCR反应的体系为SYBR Prermix ExCN 102229975 A
说明书
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Taq 12. 5μ 1、5μΜ 的正、反引物各 1μ 1、模板 DNA lyl、ddH20 9. 5 μ 1, Real-time PCR 反应程序为95°C预变性30sec ；95°C变性5sec，59°C退火20sec, 72°C延伸20sec，45个循环， 在每个循环的延伸阶段收集荧光。步骤O)中所述对小麦Real-time PCR反应的体系为SYBR Prermix Ex Taq 12. 5μ 1、5μΜ 的正反引物各 1μ 1、模板 DNA 2 μ UddH2O 8. 5 μ 1，Real-time PCR 反应程序为95°C预变性30sec ；95°C变性kec，65°C退火延伸30sec，40个循环，在每个循环的退火延伸阶段收集荧光。本发明提供一种用于小麦白粉病流行监测的微量病菌Real-time PCR定量检测方法，通过一对白粉菌特异性引物，一对小麦特异性引物，采用Real-time PCR方法，分别扩增待测小麦叶片提取的DNA，定量检测小麦白粉菌的DNA浓度和小麦叶片的DNA浓度，通过二者比值估计待测小麦所在的地区的小麦白粉病流行程度。本发明通过实验室的研究发现， 苗期潜伏侵染白粉菌DNA浓度与小麦DNA浓度比值与小麦白粉病发生的病情指数之间存在显著相关性；田间调查取样实验进一步证明该相关性。本领域技术人员知道，病情指数代表病害的流行程度，植保人员可根据该比值作出病害流行的预测预警，并采取进一步的预防和防治措施特别是对于潜伏期的小麦，由于外观上没有任何症状，但是一旦出现症状，传染流行速度非常迅速，因此对未表现症状的监测田，本发明的定量检测方法尤其有意义，本发明根据田间实验数据发现，白粉菌DNA与小麦DNA的比值大于等于0. 000023时，测定比值之后一定天数内，能够测到大于0病情指数，因此本发明将0. 000023定为病害发生的阈值， 若检测到的比值更大，说明白粉菌流行程度会更严重，需采取有效的预防和防治措施。本发明的方法之所以能够对未表现症状的麦田区进行预测预警，与real-time PCR方法能够提高检测的灵敏性有关，real-time PCR方法能够提高检测的灵敏性，这能够降低检测潜伏期白粉菌的假阴性，另外PCR方法中两对引物的特异性对于预测预警的准确性也起着关键的作用，从图4、图5可以看出，小麦特异性引物能够将小麦与小麦病原微生物及大麦、燕麦、 黑麦分开，使PCR扩增检测到的DNA仅仅包括小麦的DNA，从而保证比值中的分母不大于实际值，进而保证测得的比值的准确性，因此降低了检测的假阴性可能。总而言之，与现有方法相比，本发明具有以下的技术优势1.检测准确性高。本发明应用的小麦白粉菌特异性引物是已报道的根据ITS序列设计的引物，能够将其与其它小麦病害区分开来。同时本方法根据小麦ITS序列设计的小麦特异引物具有特异性，能将其与小麦病害及大麦、燕麦、黑麦区分开。2.灵敏度高。本发明利用Real-time PCR方法，可定量检测小麦白粉菌DNA的最低浓度为1X10—V g/μ 1，大大提高了检测的灵敏度，对处于潜伏期的病原菌也能检测到。3.检测快速。Real-time PCR方法不需常规PCR反应后处理，简便迅速。4.定量准确。Real-time PCR方法可以对初始模板量准确定量，同时采用小麦白粉菌DNA/小麦DNA的比值，可以校正DNA提取的差异和PCR扩增效率的不同，降低系统误差，因此本发明可满足不同试验者在不同仪器上进行试验，定量结果更准确。因此本方法实用性强，可满足植物病害检测和监测的需要。
图1 小麦白粉菌引物Bgt-F/Bgt-R Real-time PCR标准曲线制作扩增曲线图
图2 小麦白粉菌引物Bgt-F/Bgt-R Real-time PCR标准曲线制作熔解曲线3 小麦白粉菌引物Bgt-F/Bgt-R Real-time PCR标准曲线制作标准曲线4 小麦引物Wheat-Fl/Wheat-Rl引物特异性检测结果(1)其中M:D2000Marker，1 :ddH20，2 6 小麦Chancellor、京双 16、铭贤 169、京411、 保丰104，7 10小麦白粉菌菌株E01、E10、E42、E45，11 12 杆锈菌株34C2、21C3CTH，13 15 叶锈菌株 PHT08-5-18、THT08-23-2、THP4-932201，16 19 条锈菌株 CY29.CY30XY3U CY33，20 :CM,21 :WK,22 :GF，23 24 叶枯 YB1、YB2。图5 小麦引物Wheat-Fl/Wheat-Rl引物特异性检测结果O)其中M :D2000Marker, 1 4 小麦阿夫、蚂蚱麦、郑9023、摩洛哥，5 8 大麦浙秀 12、县无芒六棱、倍取 10 号、义乌二棱；9 13 黑麦 Z1649、Z1650、Z1651、Z1652、Z1653 ； 14 18 燕麦 ZIF00025、ZIF00026、ZIF00027、ZIF00029、ZIF00030。图6 小麦引物Wheat-Fl/Wheat-Rl引物灵敏性检测结果其中M :D2000Marker, 1 :ddH20，2 :1Χ1θΛ^/μ 1,3 :lXl(T5mg/y 1,4 JXlO—mg/ μ 1,5 :lXl(T7mg/y 1,6 :lXl(T8mg/y 1。图7 小麦Wheat-Fl/Wheat-RlReal-time PCR标准曲线制作扩增曲线8 小麦Wheat-Fl/Wheat-RlReal-time PCR标准曲线制作熔解曲线9 小麦WheT-Fl/Wheat-RlReal-time PCR标准曲线制作标准曲线10 接种后第一天小麦白粉菌Real-time PCR检测扩增曲线11 接种后第一天小麦白粉菌Real-time PCR检测熔解曲线12 室内接种试验第1天比值与病情指数之间的关系横坐标表示小麦白粉菌DNA/小麦DNA ( μ g/mg)比值，纵坐标表示病情指数。图13 室内接种试验第2天比值与病情指数之间的关系横坐标表示小麦白粉菌DNA/小麦DNA ( μ g/mg)比值，纵坐标表示病情指数。图14 室内接种试验第3天比值与病情指数之间的关系横坐标表示小麦白粉菌DNA/小麦DNA ( μ g/mg)比值，纵坐标表示病情指数。图15 室内接种试验第4天比值与病情指数之间的关系横坐标表示小麦白粉菌DNA/小麦DNA ( μ g/mg)比值，纵坐标表示病情指数。图16 田间试验病情指数与比值之间的直线方程，采样后7天横坐标表示小麦白粉菌DNA/小麦DNA ( μ g/mg)比值，纵坐标表示病情指数。图17 田间试验病情指数与比值之间的直线方程，采样后12天横坐标表示小麦白粉菌DNA/小麦DNA ( μ g/mg)比值，纵坐标表示病情指数。图18 田间试验病情指数与比值之间的直线方程，采样后17天横坐标表示小麦白粉菌DNA/小麦DNA ( μ g/mg)比值，纵坐标表示病情指数。
具体实施例方式实施例1 小麦白粉菌Real-time PCR扩增及标准曲线的制作1.用于检测小麦白粉菌的特异性引物。Bgt-F :5’ -AAGCTATGCGGAACTTCGTTT-3’Bgt-R :5，-TAAGGAGTTTTGGCAAGTCCC-3，
2. Real-time PCR扩增小麦白粉菌的反应体系Real-time PCR扩增小麦白粉菌的25 μ 1反应体系包括dYBR Prermix Ex Taq (TaKaRa) 12. 5 μ 1、正反引物(5 μ Μ)各 1 μ 1、模板 DNA 1 μ 1、ddH20 9· 5 μ 1。3. Real-time PCR扩增小麦白粉菌的反应程序PCR 反应程序95°C 预变性 30sec ；95°C 变性 5sec，59°C 退火 20sec，72°C 延伸 20sec，45个循环，在每个循环的延伸阶段(72°C )同步多次收集荧光。熔解曲线生成程序95 °C，20sec, 59 V，20sec,从55 °C 95 °C每升高0. 5 V保持 IOsec读取荧光一次，获取熔解曲线。4.制作标准曲线所需小麦白粉菌DNA模板的制备接种白粉菌于小麦幼苗，当叶片上出现褪绿斑后，将叶片剪成叶段放在培养基 (琼脂粉5g，0. 苯骈咪唑溶液60ml，蒸馏水1000ml)上，待分生孢子生长旺盛时收集孢子粉，提取病原菌DNA。利用微量光吸收检测仪Nano Drop (ND-1000)测定DNA的浓度和纯度，并将DNAlO倍梯度稀释，使浓度为1 X 10_2 μ g/ μ 1-1 X 10_8 μ g/ μ 1。5.标准曲线的制作将10倍梯度稀释的模板DNA每个浓度3次重复进行标准曲线的制作。实施结果建立并优化STOR Green I荧光染料法Real-time PCR反应体系，获得了小麦白粉菌定量检测的标准曲线y = -3. 034X+11. 485 (r2 = 0. 994)，其中y表示Real-time PCR反应的Ct值，χ表示DNA浓度的对数值。并且Real-time PCR能检测到的小麦白粉菌DNA的最低浓度为lX10_Vg/yl(见附图1、2、3)。实施例2 小麦Real-time PCR扩增及标准曲线的制作1.用于检测小麦的特异性引物Wheat-Fl 5' -CAACCACTCTCAACGGGAA-3‘Wheat-Rl 5' -TCAAAGGTCATAATGCCAGC-3‘2.小麦引物特异性及灵敏性检测1)反应体系25 μ 1 反应体系包括10 X iTaq Buffer (含 Mg2+) 2. 5 μ 1、IOmM dNTP Mixture 0. 5μ 1、正反引物(5μΜ)各 1μ 1、模板 DNA 2 μ l、Taq 酶 2. 5U/μ 1 0. 5 μ l、ddH2017. 5μ 1。2)反应程序94°C预变性:3min ；94°C变性 lmin，59°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，30 个循环；最后72°C延伸IOmin3)特异性检测利用小麦白粉菌、小麦条锈菌、小麦叶锈菌、小麦杆锈菌、小麦赤霉菌、小麦纹枯菌、小麦根腐菌、小麦叶枯菌及大麦、燕麦、黑麦DNA检测引物的特异性。4)灵敏性检测将提取的小麦DNA使用微量光吸收检测仪Nano Drop (ND-1000)测定DNA的浓度和纯度，10倍梯度稀释，检测引物的灵敏性。5)检测结果的分析取10 μ 1 PCR产物用1. 5 % (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色、凝胶成像后根据扩增产物的大小判定结果。3. Real-time PCR扩增小麦的反应体系Real-time PCR 扩 ±曾小麦的 25 μ 1 反应体系包括SYBR Prermix Ex Taq (TaKaRa) 12. 5 μ 1、正反引物(5 μ Μ)各 1 μ 1、模板 DNA2y l、ddH20 8· 5μ 1。4. Real-time PCR扩增小麦的反应程序PCR反应程序95°C预变性30sec ；95°C变性5sec，65°C退火延伸30sec，40个循环，在每个循环的退火延伸阶段(65°C)同步多次收集荧光。 熔解曲线生成程序95 °C，20sec，65 V，IOsec,从55 °C 97 °C每升高0. 5 V保持 IOsec读取荧光一次，获取熔解曲线5.标准曲线的制作将提取的小麦DNA使用微量光吸收检测仪Nano Drop (ND-1000)测定DNA的浓度和纯度，10倍梯度稀释，使浓度为IX 10_4mg/μ l_lX10_8mg/y 1，每个浓度重复3次，制作标准曲线。实施结果通过特异性检测，除小麦模板DNA能得到171bp的扩增产物外，其余模板均不能得到扩增产物，说明引物能将小麦同小麦病害及大麦、燕麦、黑麦区分开来(见附图4、
5)。在常规PCR检测下，该引物能检测到的小麦DNA最低浓度为1X 10_6mg/ μ 1 (见附图
6)。同时建立并优化STORGreen I荧光染料法Real-time PCR反应体系，得到标准曲线y =-3. 163x+6. 252 (r2 = 0. 998)，其中 y 表示 Real-time PCR 反应的 Ct 值，χ 表示 DNA 浓度的对数值(见附图7、8、9)。实施例3 应用Real-time PCR定量检测室内潜伏侵染小麦白粉菌1.取样不同浓度接种，以接种后第1天 第4天每天取样，将采集的叶片提取DNA作为 PCR模板。采样后剩余的叶片继续培养，调查严重度和发病率，计算病情指数。表1.室内试验病情指数及小麦白粉菌DNA/小麦DNA ( μ g/mg)比值
接种密度病情第1天取第2天取第3天取第4天取(孢子/cm2)指数样比值样比值样比值样比值119900.2970.2380.2600.6921.736213880.2250.0280.0710.0391.21436620.1180.1010.0570.3900.87144200.0520.0180.0110.1080.13552130.0240.0150.0040.1880.055对照0000002.引物小麦白粉菌引物Bgt-F/Bgt-R及小麦引物Wheat_Fl/Wheat-Rl分别为
Bgt-F :5’ -AAGCTATGCGGAACTTCGTTT-3’Bgt-R :5，-TAAGGAGTTTTGGCAAGTCCC-3，Wheat-Fl 5' -CAACCACTCTCAACGGGAA-3‘Wheat-Rl 5' -TCAAAGGTCATAATGCCAGC-3‘3. Real-time PCR 反应体系1)小麦白粉菌Real-time PCR反应体系Real-time PCR扩增小麦白粉菌的25 μ 1反应体系包括SYBR Prermix Ex Taq (TaKaRa) 12. 5 μ 1、正反引物(5 μ Μ)各 1 μ 1、模板 DNA 1 μ 1、ddH20 9· 5 μ 1。2)小麦 Real-time PCR 反应体系Real-time PCR 扩增小麦的 25 μ 1 反应体系包括SYBR Prermix Ex Taq (TaKaRa) 12. 5 μ 1、正反引物(5 μ Μ)各 1 μ 1、模板 DNA2y l、ddH20 8· 5μ 1。4. Real-time PCR 反应程序1)小麦白粉菌Real-time PCR程序PCR 反应程序95°C 预变性 30sec ；95°C 变性 5sec，59°C 退火 20sec，72°C 延伸 20sec，45个循环，在每个循环的延伸阶段(72°C )同步多次收集荧光。熔解曲线生成程序95 °C，20sec, 59 V，20sec,从55 °C 95 °C每升高0. 5 V保持 IOsec读取荧光一次，获取熔解曲线。2)小麦 Real-time PCR 程序PCR反应程序:95°C预变性30sec ；95°C变性5sec，65°C退火延伸30sec，40个循环，在每个循环的退火延伸阶段(65°C)同步多次收集荧光。熔解曲线生成程序95°〇，2086(3，651，1086(3，从551 971每升高0. 5°C保持 IOsec读取荧光一次，获取熔解曲线。5.小麦白粉菌DNA/小麦DNA的比值与病情指数的相关性通过小麦白粉菌的Real-time PCR的标准曲线计算出未知样品的白粉菌浓度，小麦的Real-time PCR的标准曲线计算出未知样品的小麦的浓度，将其比值与病情指数做相关性分析。实施结果根据小麦白粉菌的Real-time PCR反应体系和反应程序，以接种不同天后叶片 DNA为模板，结果接种1天后，就能检测到叶片中潜伏的小麦白粉菌，大大提高了检测的灵敏度(见附图10、11)。通过室内接种不同密度，以接种不同天后的叶片DNA为模板，根据小麦白粉菌和小麦的Real-time PCR反应体系和反应程序分别进行扩增，结果表明小麦白粉菌DNA/小麦 DNA的比值与叶片培养后的病情指数之间有极显著相关性(见附图12、13、14、15)，此结果表明，本发明的检测方法可以定量监测小麦白粉病的发生程度，对小麦白粉病的早期、快速和准确的预测预报提供有效的数据。实施例4 应用Real-time PCR定量检测田间潜伏侵染小麦白粉菌2008年在北京市房山区张坊镇、河北省易县西陵镇西大地和桥头乡采样，采样日期2008年3月27日，采样时的苗期为分蘖期(GS 22)，每点采集3个重复，每个重复采集30 叶片，提取DNA，根据实施例3的步骤进行PCR扩增，计算菌DNA/小麦DNA比值，第7天、第12天、第17天调查病情指数，如表2所示，结果表明小麦白粉菌DNA/小麦DNA的比值与叶片培养后的病情指数之间有极显著相关性，白粉菌DNA/小麦DNA的比值达到0. 000023时， 说明在所述目标监测地区的麦田内将会发生白粉病流行感染，比值越高，病情指数越高，说明白粉菌流行程度越高。表2田间试验病情指数及小麦白粉菌DNA/小麦DNA ( μ g/mg)比值
权利要求
1.一种用于小麦白粉病流行监测的微量病菌Real-time PCR定量检测方法，步骤如下(1)在目标监测地区的麦田内随机采取分蘖期GS22的小麦叶片，并提取DNA为模板，以如下白粉菌特异引物 5，-AAGCTATGCGGAACTTCGTTT-3，；5，-TAAGGAGTTTTGGCAAGTCCC-3，进行 Real-time PCR 检测，根据标准曲线 Y1 =-3. 034X1+11. 485，r2 = 0. 994，其中 Y1 为 Real-time PCR 反应的 Ct 值，X1 为白粉菌 DNA 的起始浓度对数值，计算得到白粉菌DNA浓度；(2)以第(1)步中提取的DNA为模板，以如下小麦特异引物 5' -CAACCACTCTCAACGGGAA-3, 5‘ -TCAAAGGTCATAATGCCAGC-3‘进行 Real-time PCR检测， 根据标准曲线 Y2 = -3. 163X2+6. 252，r2 = 0. 998，其中 Y2 为 Real-time PCR 反应的 Ct 值， X2为小麦DNA的起始浓度对数值，计算得到小麦DNA浓度；(3)当\J\^ 0. 000023时，说明在所述目标监测地区的麦田内将会发生白粉病流行感染。
2.根据权利要求1所述的用于小麦白粉病流行监测的微量病菌Real-timePCR定量检测方法，步骤(1)中所述对小麦白粉菌Real-time PCR反应的体系为STORR I^rermix Ex Taq 12. 5μ 1、5μΜ 的正、反引物各 1μ 1、模板 DNA lyl、ddH20 9. 5 μ 1, Real-time PCR 反应程序为95°C预变性30sec ；95°C变性5sec，59°C退火20sec, 72°C延伸20sec，45个循环， 在每个循环的延伸阶段收集荧光。
3.根据权利要求1所述的用于小麦白粉病流行监测的微量病菌Real-timePCR定量检测技术，步骤O)中所述对小麦Real-time PCR反应的体系为R I^rermix Ex Taq 12. 5μ 1、5μΜ 的正反引物各 1μ 1、模板 DNA 2 μ UddH2O 8. 5 μ 1，Real-time PCR 反应程序为95°C预变性30sec ；95°C变性kec，65°C退火延伸30sec，40个循环，在每个循环的退火延伸阶段收集荧光。
全文摘要
本发明一种用于小麦白粉病流行监测的微量病菌Real-time PCR定量检测方法属于植物病害流行监测领域，通过一对白粉菌特异性引物和一对小麦特异性引物，采用Real-timePCR检测方法，分别扩增待测小麦叶片提取的DNA，定量检测小麦白粉菌的DNA浓度和小麦叶片的DNA浓度，通过二者比值评估待测小麦所在的地区的小麦白粉病流行程度。
文档编号G01N21/64GK102229975SQ20091024434
公开日2011年11月2日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者周益林, 曹学仁, 段霞瑜, 郑亚明, 骆勇 申请人:中国农业科学院植物保护研究所