专利名称：：一种基于整体观评价中药活性和作用机理的方法
技术领域：
：本发明涉及中药效应物质基础研究领域，具体涉及一种基于中药整体观通过敲除和捕获中药化学成分来评价其活性及作用机理的方法，为一种利用液相色谱-质谱-阀切换技术联用研究中药不同成分对整体活性的影响以及各成分之间相互作用机制的方法。
背景技术：
：长期以来，国内中药研究的主流模式主要是借鉴了西方对天然产物活性成分研究的基本策略在化学成分提取、分离和结构鉴定基础上利用药理模型(整体动物、离体器官、细胞和分子等模型)对得到的化合物纯品进行生物活性测试(参见屠鹏飞，生药学的发展及其研究思路，中国天然药物，2006，4:411-419)。虽然这样的研究方法阐明了一些中药的有效部位和作用机制，但却忽视了中药的整体作用特点。随着研究的深入，中药的多成分、多靶点和整体作用模式逐步成为国内外学者的共识(参见J.Qiu.Acultureinthebalance.Nature,2007，448:126—128;J.Qiu.Chinaplanstomodernizetraditionalmedicine.Nature,2007，446:590-591;T.H.Han，R.Roy.StudyingtraditionalChinesemedicine.Science,2003，300:740_741;周俊，中药复方_天然组合化学库与多靶作用机理，中国中西医结合杂志，1998，18:67;肖培根等，21世纪与中药现代化，中国中药杂志，2000，25:67-70)。中药指纹图谱可以直接控制中药提取物中尽量多的成分，成为目前中药质量控制的有效方法。传统的化学指纹图谱通过评价药材中各色谱峰的峰面积或峰高比值来确定样品中化学成分的相对含量，并结合数理统计方法通过相似度的比较来评价中药材或制剂质量的优劣(参见屠鹏飞，高效液相色谱法制定中药材和中药注射剂特征指纹图谱的探讨，中成药，2000，22:516。果德安等，中药质量控制研究的思路与方法，中国天然药物，2005，4:332-337。蔡少青等，基于拟分布的中药色谱指纹图谱的相似性分析，北京大学学报，2008，44:695-699)。虽然该方法涉及到了中药"多成分"的特点，但各成分与其药效之间的关联性在现阶段还没有得到有效的表达，不足以说明中药的整体作用特点。近几年来，生物技术迅猛发展，生命科学与色谱分离技术的交叉形成了一种新的综合技术-生物色谱法，这为中药效应物质基础研究另辟蹊径。该法是应用最早的生物指纹图谱技术，包括分子生物色谱、生物膜色谱和细胞生物色谱等，其基本原理是以各种具有生物活性的材料作为固定相，将活性生物大分子或者活性细胞膜固着在色谱担体上作为靶标。根据中药与酶、受体或细胞膜等靶标的相互作用的强弱不同而将不同的成分分离开来，能够对中药的多种活性成分进行快速筛选，弥补了目前化学指纹图谱控制中药质量会与药效脱钩的不足，具有一定的药理学或生理学意义。(参见汪海林等，分子生物色谱用于中药活性成分筛选及质量控制方法的研究，色谱，1999，17(2):123-127。毛希琴等，生物膜色谱及其在药物活性成分分析中的应用，分析化学，2002，30(2):231-236。盛亮洪等，固定化脂质体色谱研究中药方剂的细胞膜通透性成分及其质量控制，分析化学，2004，32(12):1595-1598。袁秉祥等，细胞膜生物亲和色谱药物筛选系统，中国药理学通报，2003，20(3):368。)然而该方法在实际应用中存在诸多问题，如酶、受体等活性大分子或细胞膜与硅胶等载体结合后其生物学特征会受到一定的影响等，且这种方法只能说明中药不同成分之间的活性强弱差异，并不能解释各个成分之间以及各成分与药材整体活性之间的关联作用。发明人在前期研究中，发明了一种基于靶蛋白亲和选择的活性成分高通量筛选方法。其基本原理是将靶蛋白与中药提取物在缓冲液中共孵育，此时有活性的化合物与靶蛋白结合成靶蛋白-活性成分复合物，孵育得到的混合溶液中包括靶蛋白-活性成分复合物和没有与靶蛋白结合的游离小分子化合物。孵育溶液上样于分子排阻色谱柱或第一根在线固相提取柱，用缓冲液洗脱柱子，洗脱液流经紫外检测器，在吸收波长280nm下检测并收集首先出峰的洗脱液；然后将洗脱液与解离液混合进行解离，解离溶液中与靶蛋白结合的活性成分被解离成游离化合物；随后将解离溶液上样于第二根在线固相提取柱，耙蛋白和缓冲盐被高流速的水溶液洗脱，而活性成分则保留在第二根在线固相提取柱上；再把上述步骤得到的被保留的活性成分洗脱进入高效液相-质谱系统进行分析。这样就可筛选出中药中的活性化合物，对筛选到的活性化合物进行结构确证(见CN200810124611.1)。但此技术只能筛选出中药中孤立的化学活性成分，并不能从整体上分析中药中不同成分对整体活性的贡献度、各成分之间的相互作用以及全部活性成分群的整体活性。
发明内容本发明建立了一种基于中药整体观的通过对化学成分进行敲除和捕获来评价中药活性和整体作用特点的研究方法。本发明可以敲除和捕获中药指纹图谱中的任意一个色谱峰，分析色谱峰的变化与中药活性之间的关联度以得到每个色谱峰在中药整体活性中的贡献度；同时还可以利用基于靶蛋白亲和选择的活性成分筛选技术，在快速筛选确定活性成分峰后对其进行敲除和捕获，以研究中药提取物里一个或多个活性成分与中药整体活性之间的关系，且可通过将捕获的活性成分以不同方式组合来进一步探讨各个活性成分之间的协同或拮抗作用。本发明基于中药整体观的中药成分作用特点的检测方法，包括将待测中药用溶剂提取，得到中药提取液，然后按如下步骤进行a.中药提取液经高效液相色谱法检测，得到中药指纹图谱；b.确定指纹图谱中的目标峰；c.确定目标峰后，将高效液相色谱检测器的流出管路与六通切换阀相连，通过阀切换，把洗脱液按下列方式收集l)单个目标峰、2)任意组合的目标峰群和3)指纹图谱中敲除目标峰(群)后的剩余成分群，这三部分中，可以三部分都收集，也可以收集第一和第三部分，或收集第二和第三部分；d.对c步骤收集得到的样品进行药效学评价，得到目标峰群的整体活性、单个目标峰的活性排序、单个目标峰在中药提取物中的贡献度，和各个成分之间的相互作用关系。下面结合上述方法作进一步的阐述上述方法中，待测中药可以是单味中药也可以是中药复方。提取中药的溶剂按本领域常用的方法提取，可以是水和/或有机溶剂。优选的溶剂是选自水、C「Cs的醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚，或它们的混合物。所述C「C5的醇优选甲醇、乙醇、正丁醇。更为优选地，用70-100%乙醇或70-100%甲醇提取制备中药提取液。提取中药的溶剂是中性、酸性或碱性均可；可选用无机酸、无机碱、有机酸或有机碱中和酸性或碱性的中药提取液，如酸提碱沉法或碱提酸沉法。由于中药中含有许多成分，加上高效液相色谱具有很高的分离效能，中药提取液通过高效液相会出现许多峰，一般而言，在一种色谱条件下，一个峰就代表一个成分或者结构相似的几个成分。同时，如果在某种色谱条件下不能分开的成分，可以换一种色谱条件将之分开。最优色谱条件应使峰形稳定、分离度好。实际操作过程中，技术人员可根据具体待测中药参阅相关文献资料，目前大部分的中药都有比较成熟的得到中药指纹图谱的方法。指纹图谱中目标峰的确定有以下两种方法①经活性筛选得到将中药提取液与靶蛋白在缓冲液中共孵育，同时将不含靶蛋白的中药提取液作为空白对照，分别用基于靶蛋白亲和选择的活性成分高通量筛选方法检测，确定能与靶蛋白结合的峰，即活性成分峰，作为目标峰。；②未经活性筛选得到将指纹图谱峰按照峰高值或者峰面积值由大到小排序，选取排序靠前的色谱峰作为目标峰，即主成分峰，以5-20个为宜。目前，确定指纹图谱中活性成分峰的方法有多种，比如本实验室之前开发的一些方法(参见李萍，盛亮洪，李睿岩，李松林，齐炼文，一种中药有效成分的检测方法，中国发明专利，ZL200410041024.8;李萍，盛亮洪，李睿岩，李松林，王伟，一种中药有效成分的检测方法，中国发明专利，ZL200410041115.l和李萍，周建良，安婧婧，李会军，基于靶蛋白亲和选择的活性成分高通量筛选方法，CN200810124611.1)。本发明中，优选使用靶蛋白亲和选择的方法，具体为将中药提取液与靶蛋白在缓冲液中共孵育，同时将不含靶蛋白的中药提取液作为空白对照，分别用多维液_质联用技术检测，比较两者图谱，峰面积发生明显改变的峰，即是目标峰。上述活性成分筛选方法中的中药提取液如果包含有机溶剂，应浓縮去除全部有机溶剂，用缓冲液溶解或加入低浓度的增溶剂，以免破坏靶蛋白。缓冲液优选pH6.08.0的磷酸盐缓冲液、P朋.08.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、p朋.08.0乙酸铵缓冲液或pH6.08.0碳酸氢铵缓冲液。增溶剂的选择基于不破坏或基本不破坏靶蛋白的活性。在实际操作中，靶蛋白可以承受的增溶剂的比例可以通过简单实验来检验。例如通过Ellman分光光度分析法证明乙酰胆碱酯酶在含有5%甲醇的缓冲盐体系中活性几乎不受影响。所述增溶剂优选自吐温、二甲基亚砜、聚乙二醇、曲拉通、甲醇、乙醇中的一种或几种的混合溶液。优选的增溶剂体积占缓冲液体积的比例为0.1-5%。所有来自人体和动物的与疾病密切相关的活性蛋白均可作为筛选中药的靶标。优选的靶蛋白来自于人体或动物组织的与老年痴呆、心血管疾病或肿瘤疾病相关的酶或受体，本发明中优选乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、血管紧张素转化酶或组蛋白脱乙酰基酶等，目前有大量的商品化的活性蛋白可以购买，如乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶等，亦可自己进行纯化制备。具体筛选中药时可根据文献资料和预试验选择合适的活性蛋白，如文献显示石蒜生物碱部位能显著抑制乙酰胆碱酯酶的活性，那么在筛选石蒜生物碱中活性成分时可以选择乙酰胆碱酯酶作为靶蛋白。主成分峰的确定如上所述，操作简便，不需要运用筛选方法，只用将指纹图谱中各峰按照峰高值或者峰面积值由大到小排序，选取排序靠前的色谱峰作为目标峰，即主成分峰，以5-20个为宜。操作者可根据实验需要，选择合适的目标峰确定方法。确定目标峰后，将高效液相色谱检测器的流出管路与六通切换阀相连，具体装置5如图l所示。通过阀切换，可以把洗脱液分成两部分收集一部分为b步骤确定的目标峰(群)，即目标峰的捕获；另一部分为目标峰(群)缺失后的剩余成分，即目标峰的敲除。收集的样品在与待测中药提取液相同条件(浓度、色谱检测条件等)下进行高效液相色谱分析来检测目标峰的敲除是否完全。上述步骤中，目标色谱峰出峰时立即切换六通阀，出峰结束时六通阀再切回至原位，从而从洗脱液中捕获得到目标色谱峰，因此检测器的流出口到六通阀之间的管路优选管径小、管路短的peek管(如Agilent的红色peek管线，内径O.13mm，色谱峰经过此管线仅需0.02秒，延迟时间几乎可以忽略)，从而减少色谱峰的延迟体积，降低峰敲除时的误差。对上述收集得到的样品进行生物学检测来评价捕获或敲除化学成份的生物活性。具体生物学评价方法可根据文献资料和预试验选择合适的测试方法。以靶蛋白为胆碱酯酶为例，可通过经典的Ellman分光光度分析法来计算捕获得到的目标峰(群)和目标峰(群)缺失后剩余的成分群对胆碱酯酶的抑制率，将其与没有进行任何敲除的中药洗脱液相比，即可分析得到目标峰在中药提取物中的贡献度及其活性排序，从而挖掘中药的多成分作用特点。另外，将捕获的单目标峰以不同方式组合，评价得到的目标峰群的活性，还可进一步探讨各个成分之间的协同或拮抗作用。抑制率中药洗脱液一抑制率敲除后剩余物贡献度(100%)=-^-xioo%fflflj帛中药洗脱液由于上述洗脱收集得到的样品含有机溶剂，最好将其浓縮至干后，用缓冲液溶解或加入低浓度的增溶剂，以免在活性测试时破坏靶蛋白。缓冲液与增溶剂的选取同前。对目标峰进行捕获时，可以分别得到不同的单目标峰，操作者可根据实验需要将单个的目标峰组合成新的样品后再评价其生物活性，进而可对成分之间的协同或拮抗作用做出解释若两个样品组合后检测的活性超过了它们单独检测时所应有的活性之和，则说明样品之间可能会有协同作用；若两个样品组合后检测的活性低于它们单独检测时的活性，则说明样品之间可能会有拮抗作用。运用本发明方法，可对各个目标峰(群)进行捕获和敲除，运用生物学方法测试收集样品的活性，利用数理统计方法计算目标峰(群)的贡献度和活性排序。另外还可将收集得到的单个目标峰以任意方式组合后进行活性测定，从而可对中药各成分之间的协同、拮抗作用开展进一步的研究。这大大拓宽了中药效应物质基础研究方向，是一种操作简单、成本较低的中药整体作用机制研究方法，克服了传统方法只能筛选出中药活性成分却不能说明活性成分之间作用方式的不足。运用本发明的研究方法，发明人已从石蒜生物碱提取液中筛选确定四个活性成分峰，将其敲除后，再以一定方式把捕获得到的活性成分峰进行组合。对收集到的样品进行活性测试，发现四个活性成分峰缺失会导致剩余物的活性显著降低，而各个活性成分峰之间也存在一定的协同或拮抗作用。运用本方法，发明人已从石杉生物碱提取液中选取确定了11个主成分峰，将其敲除及捕获后，对收集到的样品进行活性测试。测试结果表明活性贡献大以及活性强的指纹峰并不一定是指纹图谱中峰面积高的峰，而将活性高的峰敲除后，剩余物的活性也并不会显著降低，这表明中药是一个多成分起作用的整体，各成分之间也存在着复杂的相互作用。6以上两种方法充分说明本发明用于中药效应物质基础研究，揭示中药多成分、多靶点、整体作用特点的可行性。图l是目标峰敲除和捕获装置图。a.C18反相色谱分析柱b.紫外检测器c.六通切换阀。图2是靶蛋白亲和选择活性成分在线筛选装置图。1.HLB固相提取柱2.线圈3.六通切换阀4.C18反相色谱分析柱5.质谱检测器6.MCX固相提取柱。蠓是靶蛋白-活性成分复合物，，是靶蛋白，錄是活性成分。图3中，a为石蒜生物碱提取液的指纹图谱；b为四个活性成分峰被敲除后的紫外图谱；c为捕获的四个活性成分峰的紫外图谱。图4是石杉生物碱提取液的指纹图谱。图5是石杉生物碱主要的主成分峰敲除验证图谱。A、2号峰被敲除后的紫外图谱；B、3号峰被敲除后的紫外图谱；C、5号峰被敲除后的紫外图谱。具体实施方式实施例1石蒜生物碱活性成分的检测和评价活性成分峰敲除与捕获筛选石蒜生物碱提取液中可以与乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)有相互作用的峰作为目标峰，即活性成分峰，并对其进行敲除和捕获。石蒜生物碱的制备石蒜粉末5g，10倍体积的70%甲醇超声提取两次，每次30min，合并提取液浓縮至干，加入20mL2%HC1调节pH至1，过滤。滤液用l丽aOH调pH至10。2倍体积的氯仿对其萃取3次，取氯仿层合并浓縮至干。10mL甲醇溶解，离心后进样，高效液相色谱法分析，得其指纹图谱。AChE的制备乙酰胆碱酯酶冻干粉2000U(Acetylcholinesterasefromelectriceel，Sigma)，用2ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液(20mM，含100mMNaCl，pH7.5)充分溶解，配制成1000U/ml，置-20°〇冰箱中分装备用。活性成分峰的筛选取200iU石蒜生物碱提取液，氮吹仪将其浓縮至干，再用100ia三羟甲基氨基甲烷缓冲液(含2%甲醇作为增溶剂)溶解作为待测液。取10iU待测液与10iilAChE溶液(1000U/ml)均匀混合，在25。C环境下静置lh。20yl孵育溶液上样于SPE1(WatersOasisHLB)，甲酸铵缓冲液(20mM，pH7.5)3ml/min洗脱30s，洗脱液(3ml/min)与解离液(0.2X甲酸水溶液，lml/min)混合于线圈(2ml)解离30s，同时解离后样品上样于SPE2(WatersOasisMCX)，此时六通切换阀处于附图2的上样(LOAD)位置，用二乙胺水溶液(pH10.0)4ml/min冲洗SPE21min，随后将六通切换阀切换至附图2的进样分析(INJECT)位置，富集于SPE2上的活性成分被洗脱入LC-MS系统进行分离分析。同时另取10iU待测液与10ia三羟甲基氨基甲烷缓冲液(含2%甲醇作为增溶剂)均匀混合作为空白对照，用同样的方法进行分析。比较两者图谱，峰面积有明显改变的峰，即是与靶细胞有相互作用的峰，作为目标峰，即活性成分峰。运用基于靶蛋白亲和选择的活性成分高通量筛选方法(参见李萍，周建良，安婧婧，李会军，基于靶蛋白亲和选择的活性成分高通量筛选方法，CN200810124611.1)对石蒜生物碱提取液进行活性筛选，确定了四个峰可以和乙酰胆碱酯酶结合，如附图3中a所示。经与加兰他敏标准品比对，峰4为活性成分加兰他敏。活性成分峰的敲除与捕获石蒜生物碱提取液进样20iU，此时六通切换阀处于附图1的上样(LOAD)位置。目标峰开始出峰时迅速将六通切换阀切换至附图1的进样(INJECT)位置对其收集。出峰结束时再次切换六通阀至上样(LOAD)位置，此时目标峰收集结束。而六通阀在上样(LOAD)位置时的收集物即为目标峰缺失后的剩余成分群。将敲除目标峰后的剩余成分群与石蒜生物碱提取液在相同条件(浓度、色谱检测条件等)下进样分析，验证敲除效果，如附图3中b所示。从图中可以看出，本发明可以将目标峰敲除。捕获到的目标峰如附图3中c所示。色谱与质谱分析条件C18色谱柱，高效液相色谱-电喷雾四级杆质谱(HPLC-ESI/QuadrupoleMS);流动相乙腈水(各含0.05%二乙胺)梯度洗脱；紫外检测波长为280nm;ESI离子源；正离子模式，质量范围1001000m/z;喷雾毛细管电压3500V;干燥气(N2)流速9.0L/min;干燥气温度32(TC;雾化压力16psi;碎片电压100V。活性测试测试体系要兼顾靶蛋白的高活性和小分子化合物的溶解性。因收集得到的样品含有较多的有机溶剂，故将其浓縮至干后用缓冲液溶解，以免在活性测试时破坏靶蛋白。然而石蒜总碱极性较小，在缓冲盐体系中不易溶解，需要选择合适的溶媒使二者共存，如加入低浓度的增溶剂等，本实验使用含有2%甲醇的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐体系，乙酰胆碱酯酶在体系中活性几乎不受影响。另外还对四个活性成分峰进行组合(峰群123、峰群124、峰群134、峰群234)以考察各峰之间的相互作用。样品的胆碱酯酶抑制活性测试方法为经典的Ellman分光光度分析法。取4ylAChE(2U/ml)、80y1DTNB(lmM)、4yl样品禾口10iil三羟甲基氨基甲烷缓冲液混合均匀，室温孵育10min，随后加入2y1ATCh引发反应，反应10min后加入100ii1甲醇终止反应，酶标仪测定412nm下吸光度。同时另取4y1缓冲液代替样品再进行测定，即为空白对照溶液吸光度。吸光度空白溶液一吸光度样品溶液抑制率(100%)=-^-X100%卩^^fiis空白溶液检测结果对平行制备的三批样品进行活性测试，抑制率平均值如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>考虑到提取液在经过色谱柱分析后，成分会有一定的损失，我们将石蒜总碱提取液进样后的全部洗脱液也收集起来作为一份样品，即为石蒜总碱洗脱液。由实验数据我们可以得出1、药材总体活性与活性成分峰群1234活性相当，且敲除峰群1234后的剩余成分群与药材总体活性相比大大降低，说明本发明方法拟定的活性成分基本可代表药材的活性。同时药材中剩余成分多数为无活性成分，或活性较差，在与筛选出的高活性成分峰竞争乙酰胆碱酯酶结合位点时处于劣势，所以未被筛出。当去除活性高的成分后，这些活性较差的成分对乙酰胆碱酯酶表现出较弱的抑制作用。2、四个活性成分峰抑制作用排序为峰4>峰2>峰3>峰1;将活性峰三个为一组进行组合后测定抑制率，活性排序结果为峰群123<峰群134<峰群124<峰群234，即缺4<缺2<缺3<缺l，相应的贡献度排序为峰4>峰2>峰3>峰l，说明各活性峰的贡献度是与其活性成正比的。且去除峰4后，峰群123的活性显著下降，再次说明峰4为活性最好的成分，而峰4加兰他敏已为上市抗老年痴呆药物，因而再次证实了本方法的准确性和可靠性。3、峰群123的活性较峰1、峰3均高，但却低于峰2单独存在时的活性，说明峰1、3与峰2竞争靶蛋白中的同一结合位点。4、峰群124缺失了一个峰，但与四个峰全收集相比，其活性却略微升高，可能就是因为消除了高含量的低活性峰3对其他峰的竞争作用，因为活性低但含量高的化合物会影响高活性成分对靶蛋白的结合，即影响其抑制活性。5、虽去除了活性较好的峰2，但峰群134的活性较四个峰全收集时只略微下降，可能是因为峰4的活性很好，在整体活性中一直处于主导地位，所以峰2去除后活性下降并不多。同时峰群134的活性却没有峰4单独存在时高，说明峰1、3与峰4存在竞争作用，因为峰1、3活性较低，因此最终导致组合时活性反而下降。6、虽然缺失了一个活性峰，但峰群234的活性较四个峰全收集时反而有所增高，原因同上述第4点。由上述数据可以发现，某些成分虽活性不好(如峰1、峰3)，但含量较高，会占据一定数量的结合位点，因此可能会影响亲和力较强的成分(如峰2、峰4)与蛋白的结合，使得整体(四个峰全收集)抑制活性有所下降。由此可见，中药是一个多成分起作用的整体，各个成分对整体的贡献并不是简单的加和，而各个成分之间亦存在着复杂的相互作用。实施例2石杉生物碱主成分的活性检测和评价主成分峰敲除与捕获确定石杉生物碱提取液中峰高值较大的峰作为目标峰，即主成分峰，并对其进行敲除和捕获。石杉生物碱的制备石杉粉末5g，浸入10倍体积pH值为3的盐酸，超声提取两次，每次30min。合并滤液，氨水调pH值至9，用10倍体积的氯仿萃取3次。取氯仿层合并浓縮至干。10mL甲醇溶解，离心后进样，高效液相色谱法分析，得其指纹图谱。主成分峰的确定将得到的石杉指纹色谱峰按照峰高值由大到小排序，选取排序靠前的色谱峰作为目标峰，即主成分峰，最终确定了11个主成分峰，如附图4所示。经与石9杉碱甲标准品比对，5号峰为石杉碱甲。主成分峰的敲除与捕获石杉生物碱提取液进样10iU，目标峰为主成分峰，敲除与捕获步骤同实施例1。将敲除目标峰后的剩余成分群在与石杉生物碱提取液相同条件(浓度、色谱检测条件等)下进样分析，验证敲除效果，如附图5(A-C)所示。从图中可以看出，本发明可以将目标峰敲除。色谱与质谱分析条件C18色谱柱，高效液相色谱-电喷雾四级杆质谱(HPLC-ESI/QuadrupoleMS);流动相乙腈水(含50mM甲酸铵)梯度洗脱；紫外检测波长为230nm;ESI离子源；正离子模式，质量范围1001000m/z;喷雾毛细管电压3500V;干燥气(N2)流速9.OL/min;干燥气温度32(TC;雾化压力16psi;碎片电压100V。活性测试考察了捕获得到的11个主成分峰以及每个主成分峰被敲除后剩余成分群的活性。样品处理要求及活性测试方法同实施例1。检测结果对平行制备的五批样品进行活性测试，抑制率平均值如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由实验数据我们可以得出1、含有活性成分石杉碱甲的5号峰活性最好，将其敲除后，剩余成分群活性有所下降，但是却没有显著降低。很有可能是因为当5号峰存在时，由于其和靶点的亲和性强，其他成分峰虽也有一定的胆碱酯酶抑制作用但很难和靶点结合，5号峰则起活性主导作用。当5号峰缺失后，其他峰就可以和靶点结合，从而发挥活性，使得整体活性不会出现显著下降。2、峰10的活性仅次于峰4，然而将其敲除后，剩余成分群的活性反而升高，甚至比石杉总碱提取液的活性还要高，这说明峰10很可能与提取液中的多个峰都有拮抗作用，将其去除后，其他峰的活性得以发挥出来。3、峰面积高即石杉总碱提取液中含量较大的成分不一定活性好，如峰3和峰11;峰面积低即含量较小的成分不一定活性弱，如峰10。由以上数据可以发现，活性贡献大以及活性强的指纹峰并不一定是指纹图谱中峰面积高的峰，反之，峰面积高的峰并不一定活性就好，因此只靠单纯的分析中药中的某一或几个主成分而控制中药质量有失偏颇，忽视了中药多成分、多靶点、整体作用的特点。通过本发明，可考察中药主成分对中药整体的作用。权利要求一种基于整体观的中药成分作用特点的检测方法，包括将待测中药用溶剂提取，得到中药提取液，然后按如下步骤进行a.中药提取液经高效液相色谱法检测，得到中药指纹图谱；b.确定指纹图谱中的目标峰；c.确定目标峰后，将高效液相色谱检测器的流出管路与六通切换阀相连，通过阀切换，收集下列洗脱液单个目标峰和/或任意组合的目标峰群，还收集指纹图谱中敲除目标峰或目标峰群后剩余的成分群；d.对c步骤收集得到的样品进行药效学评价，得到目标峰群的整体活性、单个目标峰的活性排序、单个目标峰在中药提取物中的贡献度，和各个成分之间的相互作用关系。2.权利要求1的检测方法，其中确定指纹图谱中的目标峰的方法如下将指纹图谱峰按照峰高值或者峰面积值由大到小排序，选取排序靠前的色谱峰即主成分峰，以5-20个为宜，作为目标峰。3.权利要求1的检测方法，其中确定指纹图谱中的目标峰的方法如下将中药提取液与靶蛋白在缓冲液中共孵育，孵育溶液上样于在线固相提取柱，缓冲液洗脱，将洗脱液与解离液混合进行解离，解离溶液上样于第二根在线固相提取柱，耙蛋白和缓冲盐流出柱子，而活性成分则保留在固相提取柱上，将被保留的活性成分洗脱进入液相-质谱系统进行分析，取不含靶蛋白的中药提取液作为空白对照，同样用上述方法检测，比较两者图谱，峰面积发生明显改变的峰即活性成分峰，作为目标峰。4.权利要求3的检测方法，其中缓冲液选自p朋.08.0的磷酸盐缓冲液、p朋.08.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、pH6.08.0乙酸铵缓冲液或p朋.08.0碳酸氢铵缓冲液；靶蛋白为来自人体或动物的与疾病密切相关的活性蛋白。5.权利要求4的检测方法，其中人体或动物的与疾病密切相关的活性蛋白选自乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、血管紧张素转化酶或组蛋白脱乙酰基酶。6.权利要求l的检测方法，其中阀切换装置中从检测器的流出口到六通阀之间的管路为色谱peek管。7.权利要求l的检测方法，其中用于提取中药的溶剂选自水、C「CJ勺醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚中的一种或几种的混合溶剂。8.权利要求1的检测方法，其中c步骤收集得到的样品在进行d步骤前先将其浓縮，再用缓冲液溶解或加入低浓度的增溶剂。9.权利要求8的检测方法，其中缓冲液选自pH6.08.0的磷酸盐缓冲液、pH6.08.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、pH6.08.0乙酸铵缓冲液或p朋.08.0碳酸氢铵缓冲液；增溶剂选自吐温、二甲基亚砜、聚乙二醇、曲拉通、甲醇、乙醇中的一种或几种。全文摘要本发明涉及中药效应物质基础研究领域，具体涉及一种基于整体观评价中药活性和作用机理的方法，其特征是将中药提取液经高效液得到中药指纹图谱；再确定指纹图谱中的目标峰；将高效液相色谱检测器的流出管路与六通切换阀相连，通过阀切换，收集单个目标峰、任意组合的目标峰群和指纹图谱中敲除目标峰(群)后的剩余成分群；将收集得到的样品进行药效学评价，得到目标峰群的整体活性、单个目标峰的活性排序、单个目标峰在中药提取物中的贡献度，和各个成分之间的相互作用关系。本发明拓宽了中药效应物质基础研究方向，是一种操作简单、成本较低的中药整体作用机制研究方法。文档编号G01N30/06GK101793883SQ20091026416公开日2010年8月4日申请日期2009年12月31日优先权日2009年12月31日发明者刘朋,刘颖,周建良,李萍申请人:中国药科大学