专利名称：一种体外评价甲型h1n1流感病毒抗体效价的检测方法的建立及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于人畜共患病研究领域，涉及一种人畜共患病的鉴别诊断方法。选择了 公开的甲型H1N1加利福尼亚病毒株(A/California/08/2009(HlNl))cDNA序列中HA基因 为研究内容，首先根据结构生物学软件分析出HA蛋白漏在包膜外部分的序列，再根据抗 原性分析，选出免疫原性比较高的部分，通过基因合成方法获得基因片段构建原核表达载 体pGEX-6P-l-HA ;将阳性重组质粒转化到大肠杆菌中得到重组菌株(Escherichia coli BL21rosseta/pGEX-6P-l-HA截短蛋白)；通过多种层析方法获得纯化后的H1N1的HA截短 蛋白，并利用所述的表达蛋白建立酶联免疫吸附试验间接法实验原理评价病人体内因为流 感病毒感染或疫苗免疫产生的抗体效价。 本发明提供重组强致病性的甲型H1N1流感病毒HA重要抗原表位蛋白的表达与纯 化方法以及用该蛋白建立的H1N1抗体的诊断方法。
背景技术：
甲型H1N1流感是一种由A型猪流感病毒引起的猪呼吸系统疾病，该病毒可在猪群 中造成流感暴发。2009年3月底至4月中旬，墨西哥、美国等多国接连暴发甲型H1N1型流 感疫情，接着在短短的几个月时间在全世界迅速蔓延。此次引发疫情的病毒是猪流感病毒 A(H1N1)亚型，是一种从未在人和猪身上出现过的新型猪流感病毒。截止2009年9月3日， 全球188个国家和地区发生了疫情，共报告25万病例，累计死亡病例2800多例，实际上发 病人数要远远超过报告的病例数。目前，北半球进入秋季，疫情呈快速上升趋势。从我国内 地来看，近期疫情形势也发生了一些新的变化，疫情从沿海向全国、从城市向农村扩散，由 输入为主变为本土为主，由散发病例向聚集疫情发展。目前，内地31个省份都发现疫情，每 日报告病例数呈上升趋势，近期还陆续出现了重症病例。我们面临的疫情防控形势不容乐 观。截至9月10日，我国内地31个省份累计报告甲型H1N1流感确诊病例6968例。
甲型H1N1流感的潜伏期，较普通流感、禽流感潜伏期长，潜伏期时长七天。早期症 状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛等，有些还会出现腹泻或呕吐、 肌肉痛或疲倦、眼睛发红等症状。部分患者病情可迅速进展，来势凶猛、突然高热、体温超过
39t:，甚至继发严重肺炎、急性呼吸窘迫综合症、肺出血、胸腔积液、全身血细胞减少、肾功
能衰竭、败血症、休克及Reye综合症、呼吸衰竭及多器官损伤，导致死亡。甲型H1N1流感的 蔓延给人群健康和经济社会发展带来巨大危害。疫情暴发后，我国高度重视防治防控工作， 果断决策，统一部署，采取了一系列有序有效的防控措施。秋冬季节，甲型H1N1流感会进入 一个高峰期。学校开学成为聚集性发病的重要风险因素。所以，我国防控甲型H1NI流感形 势严峻。日前，国务院对秋冬季节我国甲型H1NI流感防控工作做出了一系列重要部署。下 一阶段的防控方针是强化预防措施，严控社区传播，加强重症救治，全力减少疫情危害。所 谓"社区"，重点包括学校、医院等。我国将完善信息发布机制，制定针对人员密集流动情况 下的铁路、民航防控预案。同时，充分发挥疫苗手段，特别是在参加国庆游行的人员中首先启动疫苗接种。中国首批甲型H1N1流感疫苗6月22日正式下线，在经过一系列生物、生化 实验和临床实验后，这批疫苗有望于9月上市。预计在国庆之前将产出满足500万人份的 用量，并将全部用于国家储备。目前，我国已成为世界上第一个可以应用甲型H1N1流感疫 苗的国家。 全国范围内的疫苗接种工作正在紧锣密鼓的展开，但一些质疑也随之而来。这些 质疑主要针对甲流疫苗"一针免疫"是否能达到真正免疫的效果，免疫的持久性等方面。在 2009年9月8日召开的新闻发布会上，国家食品药品监督管理局药品注册司司长张伟回应 有关甲流疫苗"一针免疫"的质疑时表示，目前只是暂定接种一针。甲流疫苗接种一针到底 够不够，能不能产生有效的抗体？免疫的持久性如何？广大民众任然会有这样的担心。有 没有一种快速，简便的方法对疫苗免疫效果作出精准的评估？ 本公司所研制的试剂盒能够快速、准确、廉价的检测抗体效价，有效的解决了这一难题。
发明内容
其中所述的重组蛋白的制备方法，它包括下列步骤 1)公开的甲型H1N1加利福尼亚病毒株(A/California/08/2009(HlNl))cDNA序列 中HA基因为目的基因，通过基因合成的方法获得基因片段； 2)在原核表达载体pGEX-6p-l多克隆位点中定向插入甲型H1N1流感病毒非结构 蛋白基因HA截短蛋白的DNA序列，构建得到原核表达载体质粒pGEX-6p-l-HA截短蛋白基 因； 3)将步骤2)所说的原核表达载体质粒pGEX-6p-l-HA截短蛋白转化至大肠杆菌 BL21Rosseta感受态细胞，用氨苄霉素抗性筛选单个重组菌。 4)所述纯化具体是pGEX-6p-l-HA截短蛋白在大肠杆菌Rosetta中表达，克 隆接种至3ml含有100ug/ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37°C ，过夜，220rpm ;将过夜培养 物l : 100稀释至1L含有100ug/ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37。C，220rpm，培养5h;加 入终浓度为0. lmM的IPTG，22°C， 180rpm，继续培养22h ;以8000g， 15min， 4°C离心收菌； 菌体用50mM Tris-cl，200mM NaCl pH8. 0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，0. 5h ;用超 声破碎仪超声至溶液澄清，12000rpm，20min离心3次；将上清液使用GE healthcare的 Glutathione-S印harose4B柱料纯化，得到纯化融合蛋白。PSP酶切GST标签，柱料纯化，得 到除去标签的HA截短蛋白。 实验证明，纯化后HA截短蛋白可溶性极高，一年内未有聚合物出现。 本发明提供的利用Pgex-6p-l系统融合表达再经酶切处理去掉标签制得的HA截
短蛋白，可以在大肠杆菌中成功表达，表达量与前人的结果类似，相对于真核表达，原核表
达制备工程化抗体技术相对简单，成本更低； 本发明的目的之二是提供一种快速、准确、安全、廉价的检测甲型H1N1流感病毒 抗体水平的ELISA诊断方法及诊断试剂盒。 所述诊断试剂盒制备的具体方法经离心破碎BL21rosseta细胞，提取并纯化表 达的HA重要抗原表位。用该蛋白包被ELISA酶标板制备ELISA抗原酶标板。用空白对照 菌(Escherichia coli BL21Rosseta/HA)诱导产物制备血清稀释液，按照普通ELISA方法检测待检血清。根据反应后的吸光值确定阴性、可疑、阳性的判断临界值。 按照如下的配方制备包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、底物液、终止液包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液):Na2C032. 322g， NaHC032. 352g， ddH20加至
1000mL(pH9. 6)。 1倍洗涤液NaCl 8g， KC1 0. 2g， Na2HP04 12H20 3. 63g， KH2P04 0 . 44g，双蒸水加至 1000mL(pH7. 4)。 封闭液2g牛血清白蛋白(BSA)溶于lOOmL洗涤液。
稀释液lg牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗涤液
底物液购买自天健生物生物制药(天津)有限公司
终止液2N H2S04 将HA抗原酶标板、洗涤液(25倍)、稀释液、HRP标记的抗人IgG抗体、底物缓冲 液、终止液组装成HA-ELISA鉴别诊断试剂盒。
本发明的有益效果是 1.本发明的有益效果之一是生物安全性高。本发明所用的检测抗原是重组蛋白， 制备过程中不涉及活病毒，因此没有活病毒逃逸、扩散的潜在危险。 2.本发明的有益效果之二是生产成本低。本发明所提供的甲型H1N1流感抗体检 测方法和检测试剂盒所需抗原是甲型H1N1流感病毒的HA的重要抗原表位。该蛋白可以通 过重组大肠杆菌BL21Rosseta/HA截短蛋白在体外得到大量的表达，适合大规模的生产。
3.本发明的有益效果之三是提供的检测试剂盒使用方便。本发明在提供了检测方 法的基础上，还将该方法所需的各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行，非常适合临床大规 模检测。
图1、显示Pgex-6P-1载体图谱。 图2、 HA截短蛋白融和蛋白小量表达鉴定SDS-PAGE电泳图。其中1为未诱导菌 株；M为蛋白分子量标准，从上到下依次为115KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18. 4KD、14. 4KD ;2 为1号诱导后菌株；3为2号诱导后菌株；4为3号诱导后菌株； 图3、显示的是纯化后的HA截短蛋白融和蛋白SDS-PAGE电泳图。其中1为纯化后 的融和蛋白；M为蛋白分子量标准，从上到下依次为115KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18. 4KD、 14. 4KD ; 图4、酶切后除掉标签的HA截短蛋白SDS-PAGE电泳图。其中1为酶切后不带标 签的HA蛋白；M为蛋白分子量标准，从上到下依次为115KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18. 4KD、 14. 4KD。 专利
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 实施例1甲型H1N1流感病毒HA截短蛋白基因原核表达载体的构建 BamHI及Sail酶切PUC57-HA截短蛋白和载体pGEX-6P-1，回收HA截短蛋白基因
和载体pGEX-6p-l ;然后用T4DNA ligase连接，22度水浴1小时，转化大肠杆菌Rossetta
感受态细胞，37— C培养，从中随机挑选多个单菌落，分别放入LB液体培养基中37t:培养5小时后，菌体0D值约0. 6时加IPTG至终浓度lmM，经小量表达鉴定，挑取阳性克隆。
实施例2甲型H1N1流感病毒HA的大量诱导表达和蛋白纯化
pGEX-6p-l-HA截短蛋白在大肠杆菌Rosetta中表达，克隆接种至3ml含有lOOug/ ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37t:，过夜，220rpm;将过夜培养物1 : IOO稀释至IL含有 100ug/ml氨苄青霉素的LB缓冲液，37。C，220rpm，培养5h ;加入终浓度为0. ImM的IPTG， 22。C，180rpm，继续培养22h ;以8000g， 15min， 4°C离心收菌；菌体用50mM Tris-Cl， 200mM NaCl pH8.0悬起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，O. 5h ;用超声破碎仪超声至溶液澄清， 12000rpm， 20min离心3次；将上清液使用GE healthcare的Glutathione-S印harose4B柱 料纯化，得到纯化融合蛋白。PSP酶切GST标签，柱料纯化，得到除去标签的HA截短蛋白。
实施例3甲型H1N1流感病毒抗体-ELISA诊断试剂盒构成
1. 1包被抗原的微孔板(8孔X 12条X 1块)
1. 2HRP标记抗人IgGl瓶(120ul/瓶)
1. 325倍洗涤液浓縮液1瓶(20m1/瓶)
1. 4稀释液2瓶(20m1/瓶)
1. 5底物液1瓶(10m1/瓶)
1. 6终止液1瓶(10m1/瓶) 实施例4甲型H1N1流感病毒抗体ELISA检测操作步骤
1)从4t:冰箱中取出试剂盒，平衡各组分至室温。 2)取预包被的微孔条板(根据标本多少，可拆开分次使用)，除空白对照孔外，每
孔加入以样品稀释液i : 40稀释的待检样品，每孔加iooui，同样i : 40稀释对照血清，设
阳性对照2 L阴性对照2 L空白孔不加，轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37t:温育1小时。 3)甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200u1/次，每次静置3分钟倒掉，最后 一次拍干。 4)每孔加酶标二抗100ul，置37。C温育30分钟。 5)洗涤4次，200ul/次，每次静置3分钟倒掉，最后一次拍干。 6)每孔加底物90ul ，室温避光显色(30分钟以内)。 7)每孔加终止液50ul， 15分钟内测定结果。
权利要求
一种体外评价针对甲型H1N1流感病毒抗体效价的检测方法的建立。
2. 根据权利要求1所述的甲型H1N1流感病毒，其特征是，包括但不限于活体甲型H1N1 流感病毒的全病毒颗粒、灭活的甲型H1N1流感病毒的全病毒颗粒病毒颗粒的部分结构、重 组甲型H1N1包膜蛋白及重组甲型H1N1非结构蛋白。
3. 根据权利要求1所述的抗体，其特征是，包括但不限于活体甲型H1N1流感病毒的全 病毒颗粒、灭活的甲型H1N1流感病毒的全病毒颗粒病毒颗粒的部分结构、重组甲型H1N1包 膜蛋白及重组甲型H1N1非结构蛋白作为抗原通过某些途径进入宿主后产生的抗抗原的免 疫球蛋白。
4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征是，基于免疫学方法建立包括但不限于免 疫比浊法以及酶联免疫(ELISA)法的免疫学方法检测样品中抗H1N1的抗体效价的方法。
全文摘要
本发明属于人畜共患病研究领域，涉及一种人畜共患病的鉴别诊断方法。选择了公开的甲型H1N1加利福尼亚病毒株(A/California/08/2009(H1N1))cDNA序列中HA基因为研究内容，首先根据结构生物学软件分析出HA蛋白漏在包膜外部分的序列，再根据抗原性分析，选出免疫原性比较高的部分，通过基因合成方法获得基因片段构建原核表达载体pGEX-6P-1-HA；将阳性重组质粒转化到大肠杆菌中得到重组菌株(Escherichia coli BL21 Rosseta/pGEX-6P-1-HA截短蛋白)；通过多种层析方法获得纯化后的H1N1的HA截短蛋白，并利用所述的表达蛋白建立酶联免疫吸附试验间接法实验原理评价病人体内因为流感病毒感染或疫苗免疫产生的抗体效价。
文档编号G01N33/569GK101710119SQ20091027220
公开日2010年5月19日 申请日期2009年9月25日 优先权日2009年9月25日
发明者华权高, 沈鹤霄 申请人:武汉华美生物工程有限公司