专利名称:用于非常规可传播因子的体外检测和/或滴定的方法
技术领域:
本发明涉及用于非常规可传播因子(NCTA)相关感染性的体外测定的方法及其应 用,特别是用在体外评估和/或监测用于获得或处理生物学样品的方法的有效性的方法 中,或用在消除污染步骤的体外评估和/或监测方法中,或用在体外评估化合物调节NCTA 相关感染性的能力的方法中。
背景技术:
可传播海绵状脑病(TSE)将许多以中枢神经系统(CNS)退化为特征的遗传性或获 得性疾病合并为一组。在人类中最常见的形式是克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease) (CJD),但是TSE也存在于许多哺乳动物中(特别是绵羊中的瘙痒病和牛海绵状脑病)。这 些疾病的病原因子被分类在“非常规可传播因子”(NCTA)类别中。疾病的标志是存在被称 为朊病毒蛋白(PrP)的细胞外蛋白,该蛋白在疾病过程中被转变成对蛋白酶例如蛋白酶K 具有抗性的不溶形式,并在中枢神经系统中积累。这种被称为PrPsc的病理学异常形式的 PrP与感染性共纯化,并且其积累在时间上先于组织学病变的出现。它源于PrP朊病毒蛋白 构象的改变。已经证实编码PrP的基因表达没有改变,其翻译也没有任何损伤(Prusiner, Biochemistry 1992 ;31 ;12277-88) 目前可以获得的数据还不能证明在血液衍生物中发现了感染形式的造成TSE的 可传播因子(Brown et al. ,2001, Semin Hemato 1. ;38(4Suppl 9) :2_6)。但是,不能做出它不存在的结论,这种不确定性首先是由于血液中可能非常低的 浓度,其次是由于这些疾病在临床征兆出现之前特征性的非常长的无临床症状潜伏期。此外,NCTA不寻常的抗性阻止了对常规使用的失活方法例如吐温-TNBP溶剂/去 污剂处理的依靠,所述处理方法已被证明能够有效降低血液衍生物例如低温沉淀血浆蛋白 (因子VIII,von Willebrand因子等)的病毒载量。因为考虑到治疗性应用,生物学样品 例如血浆凝结蛋白的获得或治疗应该包括病毒消除/失活步骤,因此制造血液衍生药物的 制药工业如今正在设法评估变体CJD通过血液衍生制品传播的理论风险。目前,常规使用的用于NCTA相关感染性的滴定方法通过脑内注射各种稀释度的 载有NCTA的测试产品使用体外滴定方法(例如金色仓鼠用于滴定与263k毒株相关的感染 性)。根据对应于所执行的稀释的各种不同组中受感染动物的数量,有可能计算出感染性 滴度并在未治疗参照组的基础上建立起给定方法的降低系数。但是,这种方法具有时间长 (约1年)、昂贵以及相对来说与需要尽可能快地获得朊病毒消除效率相关结果的工业规模 开发不相容的缺点。此外,为了增加滴定方法的灵敏度,通常需要引入浓缩感染性因子的步骤。目前所 有用于浓缩造成TSE的感染性因子的步骤都包括PrPsc的纯化。已经提出了用于TSE感染性因子的体外滴定的其他方法。通过 Western 印迹法(MacGregor, Transfusion J. Medicine 2001 ;11, 3-14)或 通过ELISA检测PrPsc的技术一般需要用蛋白酶K预先消化待分析样品或用离液剂进行变性,以便将病理性蛋白(PrPsc)与正常蛋白(PrP)区分开。最近,基于使用不识别PrP的PrPsc特异性抗体,已经开发出另一种滴定方法 (Korth 等,Nature 1997 Nov 6,390 (6655) ;74-7) 美国专利6,150,583在其一部分中,描述了表达用异源表位标记的PrP的转基因 动物的生产,所述异源表位根据朊病毒蛋白的构象而暴露或不暴露在朊病毒蛋白的表面 上。文件WO 2005/022148描述了被称为“TCIA”(“组织培养物感染力测定法”)的生物 制品中NCTA的体外滴定方法,所述方法为将耐受所述NCTA复制的稳定的转基因细胞与生 物制品相接触,然后将这些细胞培养一代或多代,以便通过NCTA的复制扩增生物制品中存 在的NCTA的量。更具体来说,TCIA包括将感染性勻浆液(瘙痒病毒株127-S)的连续稀释液 与多孔板上培养的细胞,以每个稀释度5个孔的比例进行接触。然后通过在8到10代后检 测PrPsc (与感染性不可分离的标志物)来评估阳性细胞的数量,并通过Spearman-Karber 方法确定滴度。在Saborio 等的文献(Nature ;2001,411,810-3)中描述的被称为 “PMCA”(蛋白 错折叠循环扩增)的方法,在其一部分中设想了将源于来自被污染动物的组织或流体的病 理形式与非病理形式的NCTA蛋白相接触,以便将后者转变成病理形式。但是,TCIA和PMCA方法具有缺点。因此,对于日常应用来说,体外TCIA滴定方法 仍被证明是长时间的(10周)。此外,在目前,它的灵敏度略低于包含实验室动物感染的生 物测定法。PMCA方法尽管仍在开发中,但已发现至少与生物测定法同样灵敏。但是,它不提 供与被检测PrPsc相关的感染性方面的任何证据,并被证明难以使用血浆基质来进行。此 外,不确定的可重复性和假阳性结果也已被报道(TSE meeting, Cambridge Healthtech Institute's 12thannual,2008 Feb 11-12)。因此,对于开发工业规模上适用的、用于确定 感染性的方法,仍存在极大需求,所述方法具体来说可重复,与各种不同基质(例如血液 衍生物)相容,灵敏(具有与生物测定法相当的灵敏度),并且相对快速。发明简述现在,本发明提供了改进的体外方法,用于样品中非常规可传播因子(NCTA)或作 为NCTA相关感染性标志物的病理构象蛋白的体外检测和/或滴定。本发明的方法包括在 体外细胞培养系统中,在培养的细胞中或在其表面上复制或繁殖样品中存在的NCTA,然后 重复地与允许NCTA或病理构象蛋白扩增的底物温育,然后确定样品中NCTA或病理构象蛋 白的存在和/或量。本发明人事实上已经证实,通过将源自于细胞培养的产物与用于病理构象蛋白和 /或NCTA的底物源(对于底物来说含有例如PrP是可能的)混合,将这种底物转变成能够 被检测和定量的病理构象蛋白(PrPsc)和/或NCTA是可能的。更具体来说,本发明涉及用于样品中非常规可传播因子(NCTA)或作为NCTA感染 性标志物的病理构象蛋白的体外检测和/或滴定的体外方法,所述方法包括下列步骤i)将所述样品与耐受NCTA复制或繁殖的细胞相接触,ii)培养所述细胞以便复制或繁殖所述样品中存在的NCTA,iii)将NCTA与用于病理构象蛋白和/或NCTA的底物源相接触并温育,通过其扩增了病理构象蛋白和/或NCTA的量,iv)将可能形成的聚集物解聚,ν)确定样品中病理构象蛋白和/或NCTA的存在和/或量,步骤(iii)和(iv)构成了一个操作循环,在步骤(ν)之前该循环被重复至少两 次。优选情况下,样品选自血液制品及其衍生物、食品和美容用品。本发明还涉及对用于获得或处理可能被NCTA污染的生物制品或材料的过程进行 评估和/或监测的体外方法,在所述方法中,在所述过程的(A)上游和(B)下游对所述生物 制品或材料施用了如上定义的滴定方法,并对获得的两个滴定值(A)和(B)进行比较。本发明的另一个主题涉及对用于去除生物制品或材料污染物的步骤进行评估和/ 或监测的体外方法,在所述方法中,在所述步骤的(A)上游和(B)下游对所述生物制品或材 料施用了如上定义的滴定方法,并对获得的两个滴定值(A)和(B)进行比较。本发明的另一个主题是用于在人类或非人类动物个体中诊断可传播海绵状脑病 的体外方法,所述方法包括在来自所述个体的生物学样品中,利用如上定义的方法检测非 常规可传播因子(NCTA)或作为NCTA感染性标志物的病理构象蛋白的存在。最后,本发明的另一个主题是用于对化合物调节(即抑制或增加)NCTA的感染性 或复制或繁殖的能力进行评估的体外方法。本发明的检测方法使得有可能检测到由现有技术的已知方法、包括被当作参比方 法的生物测定方法所能检测到的至少相当的NCTA量。此外,它使得有可能比现有技术的已 知方法更快地获得结果。
图是凝胶的放射自显影照片,显示了利用本发明的方法检测PrPse。各个道如下1 分子量标准品2到12 用LN-3326接种并分别从第1到第10代收获的细胞的裂解液13 用LN-3777接种的细胞的裂解液(健康脑勻浆液)14 稀释IO6倍的被感染脑(LN-3326)的勻浆液。发明详述定义在本发明的上下文中,术语“NCTA”表示任何非常规可传播因子,例如在人类中造 成家族性或散发性CJD、库鲁病或变体CJD的可传播因子,或可替选地在动物中造成天然 TSE例如羊瘙痒症、牛或猫海绵状脑病、鹿的慢性消耗性疾病或水貂的海绵状脑病的非常规 可传播因子,或最后在实验上适应于实验动物的TSE毒株。本文中的术语“PrPsc”是指朊 病毒病理构象蛋白(或病理性构象子(conformer))。PrP的“病理”形式是其构象与被感 染人类或非人类动物中TSE的出现相关联的蛋白形式。在本发明的上下文中,NCTA也用术语“感染性因子”表示。利用本发明的方法滴定 的NCTA优选为羊、牛、鼠、仓鼠、鹿、灵长动物或人类来源的。优选情况下,NCTA可以是病理 构象蛋白自身。术语“样品”表示任何可能被NCTA污染的材料来源。这样的材料来源可以是例如液体、食品、饮料、美容用品或源自于遗传工程的产品、能够抑制NCTA感染性的分子,该名 单不是限制性的。优选情况下,它是生物学样品,例如生物学流体或组织或组织提取物。在 组织的情况下,本发明的方法可以在勻浆液上或直接在离体样品上进行。这样的组织可以 是脑组织、脊柱组织或扁桃腺组织,该名单不是限制性的。样品也可以是源自于人类或动物 来源的组合物,例如生长激素或细胞提取物,例如垂体提取物。这样的组合物事实上能够被 NCTA污染。在生物学流体的情况下,后者可以是血液、淋巴、尿液或乳汁,该名单不是限制性 的。优选情况下,样品是血液制品或衍生物,例如血浆衍生物或血浆蛋白浓缩物。在步骤(i)中使用的表述“耐受NCTA复制或繁殖的细胞”表示能够被NCTA感染、 能够复制或繁殖这种NCTA并产生PrPsc和/或感染性的任何细胞。这些细胞优选为其中 已经整合有和/或过表达了 PrP朊病毒蛋白的非病理性构象子的编码基因的细胞。更优选 情况下,这些细胞是能够表达PrP的稳定的转基因细胞。“传代”一般是将培养皿中的一部分细胞传代培养到另一个含有新培养基的培养 皿中。因此每次传代使得有可能将不再有空间分裂的细胞稀释到另一个培养皿中,在培养 皿中培养的时间能够使NCTA复制。表述“用于NCTA的底物源”表示能够通过体外扩增循环支持NCTA复制的任何非 感染性基质。表述“用于病理构象蛋白的底物源”表示不能改变另一种蛋白的构象以使其不溶 的任何非病理构象蛋白的来源。优选情况下,用于NCTA和/或蛋白的非病理的正常形式的 底物源,可以与待测试生物制品属于相同物种,或属于不同物种。该源可以例如源自于与测 试样品中所包含的相同制品的蛋白的非病理性正常形式。或者,非病理性正常形式源可以 通过本领域技术人员已知的手段重组地或通过合成来生产。步骤⑴的细胞有利情况下,本发明方法的步骤(i)中使用的细胞表现出下列标准条件-细胞的复制或繁殖速度与证实NCTA在被感染细胞中的复制所需的温育时间之 间的相容性;-细胞在已经与感染性因子接触后的稳定性,这可以通过不存在与NCTA在细胞中 积累相关的细胞毒性来证明;-细胞对感染的良好敏感性,这通过例如用于在暴露于感染性因子的细胞中获得 NCTA积累所需的低感染复数来评估。由于神经细胞(神经元、神经胶质细胞)在培养中不良的适应性,对于体外滴定来 说它们不一定是最好的底物,因此优选情况下利用已知技术,通过特定细胞类型和特定转 基因的组合,建立起为NCTA复制提供理想环境所需的转基因细胞系。在一个优选实施方案中,步骤(i)的细胞是兔上皮细胞,特别是Rov9系的细胞 (Vilette 等,PNAS, March 2001 ;98 ;4055-9)。Vilette等已经显示了来自表达羊PrP(转基因)的兔的转基因上皮细胞,在用含 有羊PrPsc的感染性脑勻浆液感染后,能够复制瘙痒病毒株并产生羊PrPsc。构建的细胞模 型Rov9系诱导性表达外来PrP,在这些与感染性材料接触的细胞中PrPsc积累所需的温育 期中保证了其维持。在另一个实施方案中,步骤(i)的细胞是鼠神经胶质细胞,特别是MovS2或MovS6
6系的细胞(Archer 等,Journal of Virology,2004 ;78p. 482-90)。这些系由表达羊 PrP 并 耐受羊来源的NCTA复制的鼠神经胶质细胞构成。与测试样品进行接触将耐受NCTA复制或繁殖的细胞,与可能被该NCTA感染的测试样品或作为参比材 料的含有NCTA的感染性材料、例如来自被NCTA例如羊朊病毒感染的动物的脑提取物进行 接触。这种接触按照本领域技术人员已知的方法进行(参见例如Archer等,Journal of Virology, Jan. 2004,p.482—490)。然后将这些细胞培养一代或多代,以便使NCTA复制或繁殖。有利情况下,可以将转基因细胞与可能被NCTA感染的样品在生物可接受水性溶 液中的至少一种稀释液、特别是与几种稀释液、最特别与系列或连续稀释液进行接触。这些 稀释液使得有可能对被测试样品中的感染性更精确定量。可以将几个细胞平行样品与同样的生物制品稀释液进行接触,以便给结果提供更 精细的统计学分辨率。细胞培养(步骤ii):按照本领域技术人员已知的任何技术培养可能被生物制品感染的细胞的步骤,是 NCTA的复制或繁殖所需的,并因此用于扩增最初不足以被检测的NCTA的量。在一个示例性实施方案中,所进行的用于通过NCTA的复制扩增所述生物学样品 中存在的NCTA的量的培养稳定的转基因细胞的步骤ii),在添加有谷氨酰胺和胎牛血清 (终浓度5% )的DMEM+Ham-F12(4 1)培养基中进行。将细胞在5% CO2下在37°C温育。 每周进行一次细胞传代(分裂比为1到10)。从细胞培养得到的产物含有病理形式的标志物蛋白(特别是PrP),其量大于生物 学样品中最初存在的量,如果所述样品含有它的话。处于其病理形式的标志物蛋白(特别 是PrP)和NCTA积累在细胞培养物中(在被感染细胞的水平上和培养基中)。与用于病理构象蛋白和/或NCTA的底物源进行接触(步骤iii):在本发明方法的步骤ii)之后,将从细胞培养得到的产物与用于病理性构象子和 /或NCTA的底物源进行接触并温育。该底物源可以例如动物来源的制品例如健康脑勻浆液、或其他源自于体外培养 物的材料的形式提供。该材料可以例如源自于细胞例如MovS或Rov N2A(Weissmann等, (2003),PNAS Vol. 100 No. 20p. 1666-11671),或者也可以源自于酵母、真菌或细菌,该名单 不是限制性的。这种源自于体外培养物的材料可以表达在各种不同的细胞区室中,例如细 胞外区室(例如上清液、外来体,该名单不是限制性的)和/或膜和/或/胞质区室(例如 细胞裂解液)。该步骤的作用是通过将非病理形式的标志物蛋白(特别是PrP)(包含在底 物中)转变成病理形式,而使步骤ii)中收获的病理构象蛋白(特别是PrPsc)和/或NCTA 得以体外扩增,非病理形式的自发转变在理论上是不可能的。病理形式的蛋白将引发非病 理形式向病理形式的转化。正如将在下面解释的,在转化反应结束时,未转化的非病理形式不被检测系统检 测。步骤(ii)的细胞培养产物与用于病理构象蛋白和/或NCTA的底物源的温育所进 行的时间长度,足以允许至少一部分具有非病理形式的蛋白转变成病理形式的蛋白,或允许NCTA扩增。优选情况下,每个温育步骤进行的时间长度在10秒到4小时之间,优选在20 分钟到1小时之间,特别优选为30分钟。扩增介质有利情况下可以由缓冲液构成,其典型地包含(lx PBS)、150mM NaCl和 Triton,以及至少含有非病理构象的标志物蛋白(特别是PrP)的底物(例如比待扩增
样品的体积大10倍以上体积)。聚集物分离已经发现,转变成病理形式(PrPse类型)的蛋白能够彼此和与其他病理形式 (PrPsc)粒子聚集,阻止了其他非病理形式的蛋白转变成病理形式。这是一种障碍,因为由 于反应介质中存在低数量的“转化焦点”,方法因此可能被减慢。因此,本发明方法的步骤iv)由将可能形成的聚集物解聚,以便释放出病理构象 的标志物蛋白粒子和/或NCTA,使它们能够转化其他非病理蛋白。许多方法能够用于在本发明方法的步骤vi)中解聚聚集物。例如,可以提到的是 用溶剂(例如十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、乙腈、胍、尿素、三氟乙醇、稀三氟乙酸、稀甲 酸,该名单不是限制性的)处理,改变溶液的物理化学性质例如PH、温度、离子强度或介电 常数,以及物理方法例如超声、激光辐射、冷冻/融化、高压釜温育、高压、温和均质化或可 替选的其他辐射源,该名单不是限制性的。优选使用超声。超声是本领域技术人员公知的 方法,通过有可能增加聚集物的溶解度而经常用于纯化PrP"的方法中。有可能在执行单次解聚步骤中不是所有的聚集物都将被解聚。在这种情况下,病 理性蛋白的浓度随着解聚步骤的进程而增加。解聚步骤的持续时间可以由本领域技术人员容易地确定,并且它可以取决于所选 的解聚方法。优选情况下,解聚步骤的持续时间在1秒到60分钟之间,更优选在5秒到30 分钟之间,更特别在5秒到30秒之间。有利情况下,被称为循环的连续的步骤iii)和iv),被重复至少2次、优选5到100 次、优选20到60次。该重复2到100次的循环构成了一系列扩增循环。一系列循环也可以被重复几次。 在这种情况下,新的系列将从前一个系列的体积而不是最初的NCTA样品开始。蛋白检测检测病理蛋白的步骤(V)可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行。PrPsc的特异性检测可以利用首先分离两种同种型PrPc和PrPsc的步骤来进行。 这种分离在PrPsc的能够使其与非病理蛋白区分开的生物化学性质的基础上进行,特别是 已报道的PrPsc对基于蛋白酶的处理更有抗性和即使在去污剂存在情况下溶解性也较低 这一事实。因此,优选情况下,扩增后的第一个步骤是从样品中分离PrPc (非病理性可溶的 正常形式的PrP),这可以例如利用蛋白酶处理例如蛋白酶K处理或通过离心来进行,以便 将可溶形式(PrPc)与不溶形式(PrPsc)分离开。 在一个具体实施方案中,在Western印迹之前的步骤是用蛋白酶K消化,它主要消 化PrPc而不是PrPsc。事实上,PrPsc的特性是与PrPc相比它对PK相对有抗性。因此,随 后的检测步骤不再检测到非病理形式的蛋白,因为所述形式已被蛋白酶消化。
检测步骤可以使用下述方法进行免疫细胞化学(例如通过细胞标记和Facscan 分析)或免疫化学(例如Western印迹或ELISA测定法)、或放射活性测定法、荧光测定法、电子显微镜测定法、用于检测聚集物的比浊法测试,以及结构测试包括NMR(核磁共振)、圆 二色性、拉曼光谱、UV吸收、识别病理形式蛋白的单克隆抗体,该名单不是限制性的。利用特异性识别病理形式而不是非病理形式的抗体检测病理形式的蛋白也是可 能的。该抗体自身可以被标记,以便使其更容易检测。这样的抗体可以是例如15B3抗体 (Korth 等,1997,Nature 1997 Nov. 6,390 (6655) :74_7)。NCTA 滴定病理形式的标志物蛋白或NCTA的检测可以与这些蛋白或NCTA在样品中存在的量 的测定组合进行。滴定可以利用本领域技术人员已知的任何滴定方法来进行。具体来说,它可以按 照文献W02005022148和W02006117483 (特别是参比例A和B)中描述的方法模型来进行。各种稀释液和各种平行样品的Western印迹的所有结果可以利用本领域技术人 员已知的能够建立起感染滴度的统计学方法来分析,例如Spearman-Karber方法(Schmidt N.J.,Emmous R. W.,《用于病毒、立克次氏体和衣原体感染的诊断步骤》(Diagnostic Procedures for viral, ricketsial and chlaveydial Infection),1989,第 6 片反)。在本发明的一个实施方案中,计算滴度的方法是Spearman-Karber方法。该方 法将测试样品按照几何级数稀释,即连续稀释之间具有恒定比率,并将恒定体积(一般 0. 150ml)的每种稀释度接种到至少5个孔中。最常用的稀释系数是十进制系数。为了使Spearman-Karber公式适用,需要使用恒定数量的接种有每种稀释度的 孔、恒定的稀释系数,并且稀释度的范围宽得足以涵盖下述两个稀释度,一侧的稀释度在 100%的孔中将给出阳性反应,另一侧的稀释度在100%的孔中将给出阴性反应。如果这些条件中的一个或多个没有满足,有时假定对于恒定的稀释系数来说,与 执行的最后稀释紧邻的较高或较低稀释度将给出所需结果。这种数据的“编造”不是基于 任何理论基础,但是如果足够小心地施用,它没有危险。但是,优选使用更适合的稀释度范 围重复滴定,并且如果在数据中存在严重缺口,这是必需的。根据 Spearman-Karber 公式Log10 中值剂量=(X0) - (d/2) +dS (巧/叫)其中X0 =所有测试接种物都为阳性的最低稀释度的倒数值的log1(l。d =稀释系数的loglO,也被称为“稀释级(dilution step) ” (即稀释度对数间隔 之间的差)。η,=在每个稀释度使用的测试接种物的数量。Ri =阳性测试接种物的数量(缺乏Iii)。S(^ni) =S(P)=从给出100%阳性结果的最低稀释度开始的阳性测试比例的总 和。求和从Xtl稀释度开始。估算的标准偏差使用下列公式计算Log 标准偏差=d* V (E(p*(l-p)/(ni_l)))其中ρ = IVni=每个稀释度处阳性测试(即表现出反应的接种物的孔)的比例。本发明的方法能够在约41og、即10000体外感染单位的范围内对NCTA相关感染性
9进行定量。这能够例如使其可以满足用于证实获得消除了 NCTA的生物制品的方法的有效 性的标准。用于测定NCTA相关感染性的方法的应用本发明还涉及将本发明的滴定方法应用于体外评估和/或监测可能被NCTA污染 的生物制品的获得或处理方法的方法中。该评估和/或监测方法的特征在于,在所述过程 的上游和下游对生物制品使用上面描述的本发明的滴定方法,并将获得的两个滴定值进行 比较。通过两个测量值之间的比较,确定了 NCTA的消除程度或NCTA折减系数。具体来说,本发明的滴定方法具有使用例如色谱或纳滤、特别是在文献EP 0 359 593和WO 02/092632中描述的色谱或文献W02005/022148中描述的纳滤,容易地适用于任 何类型的用于获得或纯化生物制品、特别是血液制品例如血浆衍生物的方法的能力。因此,本发明方法的实施,通过使用促进NCTA复制的特定转基因细胞系与含有 NCTA的待测试感染性或潜在感染性材料进行接触的滴定方法,能够评估和/或监测任何可 能被NCTA污染的生物制品的获得或处理或甚至纯化方法消除该NCTA的有效性。在希望评 估对NCTA有效性的过程(或过程的一部分)的上游和下游测量NCTA的量。通过这两个测 量值的比较,确定了病原性因子的消除程度。因此,本发明方法的实施,可以在获得生物制 品的方法过程中或在获得生物制品后用于消除NCTA的处理的情况下执行。本发明还涉及将本发明的滴定方法应用于体外评估和/或监测用于去除材料污 染的步骤的方法中。在这种情况下,利用本发明的滴定方法测定含有NCTA的生物制品的 NCTA滴度。然后将该被感染的生物制品与去污染材料进行接触,然后对该材料进行去污染 步骤。最后,再次测定经历过去污染步骤的生物制品的滴度。将在去污染步骤上游和下游 进行的两个滴定测量值进行比较,以评估去污染步骤的有效性。材料可以是例如纯化材料 特别是色谱柱,或者也可以是使用氢氧化钠消毒色谱柱。本发明还涉及将本发明的滴定方法应用于调节(降低或增加)感染性物质滴度的 候选化合物的筛选步骤和/或评估其能力的方法中。在这种情况下,利用本发明的滴定方 法测定含有NCTA的生物制品的NCTA滴度。然后将该被感染的生物制品与测试化合物进行 接触,然后再次测定经历过筛选步骤和/或评估方法的生物制品的滴度。对在样品与测试 化合物进行接触的上游和下游进行的两个滴定测量值进行比较。本发明还涉及将本发明的滴定方法应用于能够抑制NCTA感染性的化合物的筛选 步骤和/或其评估方法中。在这种情况下,利用本发明的滴定方法,在存在以及然后在不存 在待评估化合物的情况下测定含有NCTA的生物制品的NCTA滴度。根据行动是阻止了感染 周期的起始还是阻断了已经起始的感染周期,对与化合物进行接触的方法进行测定。在任 何情况下,都测定用或不用测试产物处理的生物制品的滴度。将进行的两个滴度测量值进 行比较,以便评估化合物对NCTA感染性的抑制活性。本发明还涉及将本发明的滴定方法应用于能够调节标志物蛋白或NCTA从非病理 形式向病理形式的转化、例如PrP向PrPse的转化的化合物的鉴定方法中。在这种情况下, 利用本发明的滴定方法测定含有NCTA的生物制品的NCTA滴度。然后将该被感染的生物制 品与测试化合物进行接触,然后施用本发明的滴定方法以便再次测定生物制品的滴度。对 在与化合物进行接触的上游和下游进行的两个滴定测量值进行比较,以便评估测试化合物 的有效性。
在下面的附加描述的帮助下将会更清楚地理解本发明的方法,这些描述不对本发 明的范围构成限制。
实施例材料与方法选择了 MovS6细胞(Archer F.等,2004,同上)作为耐受NCTA复制的细胞,对 Tg301转基因小鼠适应的127-S瘙痒病毒株被用作天然感染性源(Vilette JL等,2001,同 上)。Tg301转基因小鼠携带有从羊人工染色体文库分离到的大DNA片段,羊PrP的表达水 平为羊脑中观察到的水平的约8倍高。初始感染性源由来自被感染小鼠的200mg/ml的脑 勻浆液(批号LN-3326)。该样品的滴度是5. 71og10uffB/ml和6. 35TCID50/ml。细胞培养和接种将MovS6细胞培养在添加有谷氨酰胺和胎牛血清(终浓度5 % )的 DMEM+Ham-F12 (4 1)培养基中,在5% CO2和37°C下温育。每周将10%细胞重新接种在 每个孔中。剩余90%的细胞或者用PBS清洗然后以干燥细胞沉淀的形式储存,或者除去。在接种前24小时准备滴定板。将细胞以每个孔100 000个细胞的比例接种在约 2cm2的孔中(24孔板格式),即约50000个细胞/cm2。接种物由稀释IO4倍的LN-3326样品或用作“阴性对照”的健康脑勻浆液样品(批 号LN-3777)组成。接种进行5个平行样。将细胞与150μ 1稀释接种物接触24小时,然后加入Iml新培养基。将细胞在培 养物中维持另外72小时,即直到第一次传代,在传代过程中,对于每个孔来说,将整个细胞 层转移到约9. 6cm2的孔中(6孔板格式)。然后将细胞培养物维持10周。每周,对于每个孔来说更换培养基并将10%细胞重 新接种。在用感染的接种物(LN-3326)接种的没有用于重新接种的细胞中,5个平行样品中 的两个在PBS中洗涤一次,然后以干燥沉淀的形式储存在-80°C (打算按照本发明的方法进 行扩增的样品),其余3个平行样品不事先洗涤就作为干燥沉淀保存(打算用于WB检测的 样品)。在用健康样品接种并且没有用于重新接种的细胞中,所有平行样品不事先洗涤就以 干燥沉淀的形式储存。获得的细胞沉淀能够用于执行下文中描述的分析。细胞中PrPsc的检测在每次传代中储存的细胞沉淀能够用于研究细胞所产生的PrPsc。产生的PrPsc 的检测,通过对未洗涤的细胞沉淀样品直接进行Western印迹,或利用本发明的方法对洗 涤过的细胞沉淀样品进行扩增后通过Western印迹来进行。-直接通过Western印迹的检测将未洗涤的细胞沉淀样品(5份平行样品中的三 份)融化并吸取到60 μ 1 PBS中。使用超声水浴(功率15W)通过15秒超声裂解细胞。取 出20μ 1超声过的细胞裂解液以便用蛋白酶K处理。将消化产物变性,然后在变性条件下 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。将在凝胶中迁移的蛋白通过电转印转移 到PVDF膜上。通过与6Η4抗体(Prionics)然后再与碱性磷酸酶标记的第二抗体(“抗小 鼠抗体”的山羊抗体)温育,来检测膜上存在的PrPsc。标记的膜通过化学放光进行显示。 如果在放射自显影照片上可以看到三种形式的糖基化PrPsc的电泳分布图,样品被认为是 阳性的。
-利用本发明方法的检测将每个洗涤过的细胞沉淀样品融化,然后吸取到90μ1 含有5%健康脑勻浆液的溶液中并放置在200μ 1微量离心管中。步骤(iii)到(ν)的循环 由在37°C的温度下30分钟的温育阶段,然后是20秒的超声阶段构成。使用自动化Misonix 超声仪3000 (功率水平设定在7)对样品进行一系列50个循环。使用18 μ 1扩增产物,用 蛋白酶K消化,然后通过Western印迹进行分析,以检测可能存在的PrPsc。结果在各种不同样品中检测PrPsc显示在图中并总结在表1中。表1 在MovS6细胞裂解液中检测PrPsc后的阳性孔数量
权利要求
一种体外方法,用于样品中非常规可传播因子(NCTA)或作为NCTA感染性标志物的病理构象蛋白的检测和/或滴定,所述方法包括下列步骤i)将所述样品与耐受NCTA复制或繁殖的细胞相接触,ii)培养所述细胞以便复制或繁殖所述样品中存在的NCTA,iii)将NCTA与用于病理构象蛋白和/或NCTA的底物源相接触并温育,通过其扩增了病理构象蛋白和/或NCTA的量,iv)将可能形成的聚集物解聚,v)确定样品中病理构象蛋白和/或NCTA的存在和/或量,步骤(iii)和(iv)构成了一个操作循环,在步骤(v)之前该循环被重复至少两次。
2.权利要求1的方法,其中作为NCTA标志物的病理构象蛋白是PrPse朊病毒蛋白。
3.权利要求2的方法,其中步骤(i)的细胞是其中已经整合有编码PrP朊病毒蛋白的 非病理性构象子的基因的细胞。
4.前述权利要求任一项的方法,其中步骤(ν)中病理构象蛋白的存在和/或量的确定 通过免疫化学或免疫细胞化学来进行。
5.权利要求1到4任一项的方法,其中细胞是兔上皮细胞、特别是Rov9系的细胞。
6.权利要求1到4任一项的方法,其中细胞是鼠类神经胶质细胞、特别是MovS2或 MovS6系的细胞。
7.前述权利要求任一项的方法,其中所述步骤(iii)和(iv)的循环在步骤(ν)之前被 重复5到60次。
8.前述权利要求任一项的方法,其中样品选自血液制品及其衍生物、食品和美容用品。
9.前述权利要求任一项的方法,其中用于蛋白的病理形式和/或用于NCTA的底物以健 康脑勻浆液的形式提供。
10.一种体外方法,所述方法对用于获得或处理可能被NCTA污染的生物制品或材料的 过程进行评估和/或监测,在所述方法中,在所述过程的(A)上游和(B)下游对所述生物制 品或材料施用了权利要求1到9任一项的滴定方法,并对获得的两个滴定值(A)和(B)进 行比较。
11.一种体外方法,所述方法对用于去除生物制品或材料的污染物的步骤进行评估和 /或监测,在所述方法中,在所述步骤的(A)上游和(B)下游对所述生物制品或材料施用了 权利要求1到9任一项的滴定方法,并对获得的两个滴定值㈧和⑶进行比较。
12.—种体外方法,所述方法用于对化合物调节感染性生物制品的感染性的能力进行 评估,在所述方法中,在存在(A)和不存在(B)待评估的所述化合物的情况下,对所述感染 性生物制品施用了权利要求1到9任一项的滴定方法,并对获得的两个滴定值(A)和(B) 进行比较。
13.—种体外方法,所述方法用于在人类或非人类动物个体中诊断可传播海绵状脑病, 所述方法包括在来自所述个体的生物学样品中,利用权利要求1到9任一项中定义的方法 检测非常规可传播因子(NCTA)或作为NCTA感染性标志物的病理构象蛋白的存在。
全文摘要
本发明涉及用于样品中非常规可传播因子(NCTA)或作为NCTA相关感染性标志物的病理构象蛋白的体外检测和/或滴定的体外方法,所述方法包括在培养的细胞中复制或繁殖样品中存在的NCTA,然后重复地与允许NCTA或病理构象蛋白,NCTA的非病理构象子(conformer)扩增的底物温育,然后确定样品中NCTA或病理构象蛋白的存在和/或量。
文档编号G01N33/68GK101981453SQ200980111119
公开日2011年2月23日 申请日期2009年3月25日 优先权日2008年3月27日
发明者伯努瓦·弗兰, 布鲁诺·尤 申请人:Lfb生物科技公司;法国农业科学研究院