专利名称：监测成纤维细胞生长因子受体的激酶活性的调节的方法及所述方法的应用的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及体外诊断方法，特别是选自成纤维细胞生长因子23 (FGF23)、 无机磷(P)、无机磷和总钙的乘积(PxtCa)、骨桥蛋白(OPN)和甲状旁腺激素(PTH) 的化合物作为生物标记物的应用。所述生物标记物可用来监测成纤维细胞生长因子受体 (FGFR)激酶活性的调节，特别是它的抑制，和/或FGFR抑制的继发效应的发生。
背景技术：
成纤维细胞生长因子(FGF)家族和它们的信号受体涉及多种生物活性(增殖、 存活、凋亡、分化、活动力)，这些活性控制着从蠕虫到人类的生物生长和维持的关键过 程(发育、血管发生、代谢)。已经鉴定出来22个不同的FGF，它们都含有保守的有 15-65%序列同一性的120个氨基酸核心区域。FGFs通过结合和激活下述家族来调节它 们的细胞反应，该家族由4个RTKs FGFRl到FGFR4组成，它们都有几个同种型(Lee PL 等人，Science 245: 57-60(1989) ； Givol D 等人，FASEB J.6 3362-9(1992) ； JayeM 等 人，EMBO J.7 963-9(1988) ； Ornitz DM & Itoh N，Genome Biol.2 (2001))。配体结合 引起受体二聚作用和激酶的激活，从而导致下游分子的磷酸化和/或募集以及细胞内信 号通路的激活。已经在小鼠模型上通过特殊发育系统分析、表达模式和基因打靶技术研究了 FGF/FGFR的生物作用。这些研究已经表明它们在包括血管发生和伤口愈合、发育及 代谢等许多生物功能中的作用。已经发现多种人类颅缝早闭综合征和骨骼发育不良与 导致头颅、手指、骨骼严重发育障碍的FGFR1、FGFR2和FGFR3特殊功能变异有关。 Webster MK & DonoghueDJ，Trends Genet. 1997 13 178-82 (1997) ； Wilkie AO，Hum. Mol.Genet.6 1647-56(1997)。流行病学研究报道了人类癌症中FGF/FGFR的遗传改变和/或异常表达导致 FGFRl激酶的构成型激活的FGFRl的易位和与其他基因的融合是导致Spll骨髓增生异 常的原因(MacDonald D & Cross NC, Pathobiology 74 81-8 (2007))。复发的 14q32 染 色体易位至免疫球蛋白重链转换区导致了在多种骨髓瘤中FGFR3过表达的失调(Chesi M 等人，Nature Genetics 16 260-264(1997) ； ChesiM 等人，Blood 97 729-736(2001))。 已报道了乳腺肿瘤中FGFR1，FGFR2和FGFR4的基因扩增和蛋白质过表达(Adnane J 等人，Oncogene 6: 659-63(1991) ； Jaakkola S 等人，Int.J.Cancer 54 378-82(1993)； Penault-Llorca F 等人，Int.J.Cancer 61 170-6 (1995) ； Reis-Filho JS 等人，Clin.Cancer Res. 12 6652-62(2006))。已知在胃癌(Jang JH等人，Cancer Res.61 3541-3(2001))和 子宫内膜癌(Pollock PM等人，Oncogene (May 21，2007))中体细胞的FGFR2活化突变， 而且已经在泌尿膀胱癌中鉴别出了导致不依赖于配体的受体组成型活化的FGFR3的特殊 结构域的体细胞突变(Cappellen D 等人，Nature Genetics 23 18-20(1999) ； Billerey C 等 人，Am.J.Pathol. 158 (6) 1955-9(2001))。此外，FGFR3 mRNA 和蛋白质的过表达已经发现于此类癌症中(Gomez-RomanJJ 等人，Clin.Cancer Res.ll (2 Pt 1) 459-65(2005))。所以，能够抑制FGFR的激酶活性的化合物是用于治疗具有失调的FGFR信号的 人类癌症的可能备选物。已经验证了 FGFR酪氨酸激酶的小分子量抑制剂的应用(参见Brown，A.P等 人(2005)，Toxicol.Pathol.33，第 449-455 页；Xin，X.等人(2006)，Clin.Cancer Res.， 12(16)卷，第 4908-4915 页；Trudel, S.等人(2005)，Blood, 105(7)卷，第 2941-2948 页)。但是，在动物模型中这样的抑制剂治疗有效性的确定相当麻烦，因为其涉及例 如肿瘤生长的测定、FGF受体的自磷酸化和/或信号级联的下游分子如Erkl/2磷酸化的 抑制。虽然这些方法适用于临床研究的临床前设定，但是理想的是以一种简单直接的方 式测定治疗有效性的非侵入性方法。并且，用FGFR酪氨酸激酶抑制剂PD176067在大鼠和狗非临床毒性研究中产生 了软组织的矿化。由于这种不需要的效果出现，因此进一步的研究是必要的，以确定该 制剂是否具有用于治疗癌症的潜力(参见Brown，A.P等人(2005)，Toxicol.Pathol.33, 第 449_455 页)。软组织和脉管系统中的异位矿化、钙磷酸盐的不适当沉淀，能够导致发病和死 亡(London GM 等人，Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.2005，14:525-531)。所以，本领域需要用于指示FGFR抑制剂治疗有效性的生物标记物、可靠方法 和相应的试剂盒。并且，预测FGFR抑制剂给药之后的不需要的继发效应的方法，特别 是预测异位矿化的方法，将是非常有用的。
发明内容
已令人惊讶地发现选自由成纤维细胞生长因子23 (FGF23)、无机磷(P)、无机磷 和总钙的乘积(PxtCa)、骨桥蛋白(OPN)和甲状旁腺激素(PTH)组成的组中的化合物是 有用的生物标记物，这些生物标记物可用来监测成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制 剂的活性，并可进一步用于预测FGFR抑制作用的继发效应的发生，特别是异位矿化的 发生。具体而言，本发明提供FGF23作为生物标记物的应用。在抑制FGFR的同时， 还发现了也可导致FGF23升高的抗肿瘤活性。FGF23升高的程度与使用抑制剂的剂量相 关。在某些剂量下检测到继发效应，特别是软组织和脉管的矿化。由于这种双重涵义， FGF23可被认为是FGFR抑制剂的药效学标记物。允许监测药物生物活性的药效学生物 标记物的鉴定和确认可用于剂量选择和治疗优化。并且，为预测和监测成纤维细胞生长因子受体调节之后的异位矿化而对潜在生 物标记物进行的整体分析表明，确认选自由FGF23、P、PxtCa、OPN和PTH构成的组 中的化合物是异位矿化的潜在标记物。所以，第一方面，本发明提供了选自FGF23、P、PxtCa、OPN和PTH构成的组
中的化合物作为生物标记物的应用，特别是FGFR激酶活性调节的生物标记物的应用。在一个实施方式中，该化合物用于监测成纤维细胞生长因子受体激酶活性的抑 制。优选该化合物是FGF23。
本发明进一步提供了选自成纤维细胞生长因子23 (FGF23)、无机磷(P)、无机磷 和总钙的乘积(PxtCa)、骨桥蛋白(OPN)和甲状旁腺激素(PTH)的组中的化合物作为安 全生物标记物以预防继发效应、特别是异位矿化的应用。优选该化合物是FGF23。在另一方面，本发明提供测定FGFR激酶活性调节的方法，特别是测定激酶活 性抑制的方法，包括下列步骤a)对受试者给予FGFR抑制剂；b)提供所述受试者的样品；c)测定所述样品的FGF23水平；和d)将所述样品的FGF23水平与参照水平比较，其中所述参照水平是在用FGFR 抑制剂治疗开始之前受试者的FGF23水平。此外，还提供了测定FGFR抑制剂治疗有效性的方法，包括上述方法的步骤a) 至d)，其中参照水平是用FGFR抑制剂治疗开始之前所述受试者的FGF23水平。此外，还提供了测定FGFR抑制剂的一种或多种继发效应的方法，该方法包括 上述方法的步骤a)至d)，其中参照水平是用FGFR抑制剂治疗开始之前所述受试者的 FGF23水平。可用任一种选自P、P χ tCa、OPN和PTH的化合物相似地实施此处公开的方法。本发明在临床设置中特别适用于剂量选择、疗程选择、患者选择和治疗优化。下文中将更加详细地描述本发明。可理解的是，可按照意愿组合多种实施方 式、优选方案和范围。并且，取决于具体的实施方式，可以不使用选择的定义、实施方 式或范围。
图1是表明用化合物A治疗具有NIH3T3/FGFR3S249G皮下肿瘤的雌性无胸腺裸 鼠过程中肿瘤体积(mm3)改变的图。白色圆圈化合物A，Omg/kg,每日一次(qd)， 口服(p.o.)；黑色圆圈化合物A，1 Omg/kg, qd, p.o.；灰色圆圈化合物A，30mg/ kg, qd, p.o.；黑色三角化合物 A，50mg/kg, qd, p.o·。图2是表明肿瘤离体(ex vivo)分析的照片。最后一次化合物给药后2小时将肿 瘤切下。裂解肿瘤组织，用特异性抗体免疫沉淀FGFR3。用SDS-PAGE分析免疫复合 物，印迹到PVDF膜上，用抗pTyr抗体探测，以监测FGFR3的酪氨酸磷酸化。剥离膜， 用抗FGFR3抗体再次探测以监测总FGFR3蛋白质水平。图3是表明用化合物A治疗具有RT112/荧光素(luciferasel)皮下异种移植物的雌 性无胸腺裸鼠过程中肿瘤体积(mm3)改变的图。白色圆圈载体，lOmg/kg，qd, p.o.； 白色方框化合物A，50mg/kg, qd, p.o.；黑色三角化合物A，75mg/kg, qd, p.o·。图4是表示具有RT112/荧光素皮下异种移植物的雌性无胸腺裸鼠血浆样本中的 FGF23水平的柱状图，该血浆收集自最后一次以指定剂量的化合物A或载体对照给予2小 时之后，疗程是14天(η = 6)。FGF23水平用FGF23ELISA试剂盒监测，以pg/mL为 单位表示。该试剂盒来自Kainos，货号是CY-4000。数据表示为平均值士SD。 图5是实施例2中所述的无机磷(P)水平[mg/dl]的散点图。
图6是总钙(tCa)血清水平[mg/dl]的散点图。图7是P χ tCa的乘积血清水平[mg2/dl2]的散点图。图8是FGF23血清水平[pg/ml]的散点图。图9是表示血浆样本中FGF23水平的柱状图，血浆样本分别来自治疗前或用 TKI258每天200、300、400或500mg、每天一次的连续剂量进行口服治疗，第一个周期 第15天和第一个周期第26天的黑素瘤患者。FGF23水平用FGF23 ELISA试剂盒监测， 以pg/mL为单位表示。该试剂盒来自Kainos，货号是CY-4000。数据表示为平均值 士 SD。图10示出了用400mgTKI258治疗的黑素瘤患者在第一个周期第15天肿瘤活组 织检查的照片，用识别磷酸化和活化的FGFR的抗体进行免疫组化分析。图11是表示在8个不同的肾细胞癌患者中，基线(ClDl)和用500mgTKI258治 疗第一个周期第15天(C1D15)和第一个周期第26天(C1D26)的FGF23水平的图，基线 表示为1，其余的基于基线归纳表示为倍数。图12是表明RT112肿瘤异种移植物离体(ex vivo)分析的照片。化合物给药后 3小时将肿瘤切下。裂解肿瘤组织，使用购自Cell Signaling的抗体(#3864)用蛋白质杂 交分析FRS2酪氨酸磷酸化水平，该抗体当FRS2在Tyrl96上磷酸化时与其识别。用检 测β-微管蛋白的Sigma抗体(#T4026)检测各成员(membrane)，作为上样对照。图13为表示大鼠血清样本中FGF23水平的柱状图，这些大鼠用所示口服剂量 的TKI258治疗，样本在用TKI258或载体对照治疗后24小时舌下取血得到。FGF23水 平用FGF23ELISA试剂盒监测，以pg/mL为单位表示。该试剂盒来自Kainos，货号是 CY-4000。数据表示为平均值士SD，η = 4。用单因素Anova post-hoc Dunnett，s分析 相对于载体进行数据比较。图14为表示大鼠血清样本中FGF23水平的柱状图，这些大鼠用所示口服剂 量的所示化合物治疗，样本在用化合物治疗后24小时舌下取血得到。FGF23水平 用FGF23ELISA试剂盒监测，以pg/mL为单位表示。该试剂盒来自Kainos，货号是 CY-4000。数据表示为平均值士SD，η = 6。
具体实施例方式第一方面，本发明提供了选自成纤维细胞生长因子23 (FGF23)、无机磷(P)、无 机磷和总钙的乘积(PxtCa)、骨桥蛋白(OPN)和甲状旁腺激素(PTH)的组中的化合物作 为生物标记物的应用，特别是作为成纤维细胞生长因子受体(FGFR)激酶活性调节、优 选抑制的生物标记物的应用。该化合物优选是FGF23。成纤维细胞生长因子23(FGF23)是已知的。考虑到具有广泛生物学活性的成纤 维细胞生长因子家族成员。蛋白质序列和/或蛋白质的编码序列可以从公众可获得的本 领域已知的数据库得到。人FGF23在本领域也称为ADHR; HYPF ； HPDR2 ； PHPTC。 测定方法为本领域已知，并具体描述于下文中。术语“无机磷”(P)为本领域已知，特别指无机磷的血液水平，例如可以通过紫 外线方法用试剂盒在血清中测量，例如购自RANDOXLaboratories LTD, UK的试剂盒， 也可用临床化学分析仪测量，例如HITACHI 717分析仪(Roche Diagnostics)。
术语“总钙”(tea)为本领域已知，特别指总钙的血液水平，例如可以通过紫外 线方法用试剂盒在血清中测量，例如购自RANDOX LaboratoriesLTD的试剂盒，也可用临 床化学分析仪测量，例如HITACHI 717分析仪。术语“无机磷与总钙的乘积”(PXtCa)为本领域已知，具体而言，通过将以 mg/dL表示的无机磷(P)水平的值与总钙(tCa)水平的值相乘得到。骨桥蛋白(OPN)是已知的，也称作分泌型磷蛋白1、骨涎蛋白I或早期T淋巴 细胞活化因子1。它被认为是细胞外结构蛋白。在本领域人骨桥蛋白已知为SPPl。骨 桥蛋白可以根据制造商建议用例如Assay Designs，Inc., USA的试剂盒骨桥蛋白(大鼠) EIA试剂盒测定。甲状旁腺激素是已知的。认为它是血液钙水平调节中涉及的激素。例如PTH可 以用例如可从美国Immutopics公司得到的固相放射免疫检测法测定。具体而言，FGFR的抑制可以通过测定样本中一种或多种上述化合物、优选是 FGF23的水平来评价。由此可以评估FGFR抑制剂的治疗有效性。本文中使用的术语“成纤维细胞生长因子受体抑制剂”或“FGFR抑制剂”是指 能够阻挡成纤维细胞生长因子受体的激酶活性的分子。它们可以是大分子，例如抗体， 或小分子量的化合物。在此处公开的应用和方法的优选实施方式中，FGFR抑制剂是小分子量的化合 物。小分子量FGFR抑制剂的例子包括但不限于，PD176067、PD173074、化合物A、 TKI258 或化合物 B。PD176067 参见 Brown，CL 等人，(2005)，Toxicol.Pathol，33 卷， 第 449-455 页。PD173074 是来自 ParkeDavis 的 FGFR 抑制剂(参见 Mohammadi 等人，
EMBO J.17 5896-5904)，其特异性和效能得到了确认。其具有如下通式
权利要求
1.选自成纤维细胞生长因子23(FGF23)、无机磷(P)、无机磷和总钙的乘积(Px tCa)、骨桥蛋白(OPN)和甲状旁腺激素(PTH)的组中的化合物作为生物标记物的应用。
2.如权利要求1所述的应用，所述应用用于成纤维细胞生长因子受体(FGFR)激酶活 性的调节，优选用于FGFR激酶活性的抑制。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中所述化合物为FGF23。
4.如权利要求3所述的FGF23的应用，所述应用用于测定FGFR抑制剂的治疗有效 性和/或一种或多种继发效应。
5.如权利要求4所述的应用，用于测定治疗有效性，其中优选所述治疗有效性选自增 生性疾病和/或非癌疾病的治疗、预防或病程延迟组成的组中。
6.如权利要求4所述的应用，用于测定FGFR抑制剂的一种或多种继发效应，其中优 选所述继发效应是异位矿化。
7.如权利要求4-6中任一项所述的应用，其中所述FGFR抑制剂为大分子或小分子量 化合物，特别地，FGFR抑制剂选自PD176067、PD173074、化合物A3_(2，3-二氯-3， 5- 二甲氧基-苯基)-l-{6-[4- (4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基h嘧啶-4-基}-1_甲 基脲、丁0258和化合物3([4，5，] 二嘧啶基_6，4，二胺的衍生物)构成的组。
8.—种测定成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的激酶活性的调节的方法，包括步骤a)对受试者给予FGFR抑制剂；b)提供所述受试者的样品；C)测定所述样品的FGF23水平；和d)将所述样品的FGF23水平与参照水平比较。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物、特别是啮齿动物如小鼠或 大鼠、狗、猪或人。
10.一种测定FGFR抑制剂的一种或多种继发效应的方法，包括权利要求8的步骤a) 至d)，进一步包括步骤e)将所述FGF23水平与一种或多种继发效应相关联；和f)测定所述FGF23的水平，高于该水平时发生与所使用的治疗相关联继发效应。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述FGFR抑制剂是大分子或小 分子量化合物，特别是3-(2，3-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1_丨6-[4-(4_乙基-哌 嗪-I-基)_苯基氨基]_嘧啶-4-基甲基脲或TKI258。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其中与所述参照水平相比，所述FGF23水 平得到了提高。
13.—种诊断试剂盒，包括a)识别FGF23或其部分的分子，该分子可以是标记形式或未标记形式；b)检测选自无机磷(P)、磷和总钙的乘积(PxtCa)、骨桥蛋白(OPN)和甲状旁腺激 素(PTH)的第二生物标记物的至少一种试剂；C)可选的使用指南；d)可选的检测手段；和e)可选的固相。
14.一种试剂盒的应用，所述试剂盒包括a)识别FGF23或其部分的分子，该分子可以是标记形式或未标记形式；b)可选的使用指南；c)可选的检测手段；和d)可选的固相，所述应用用于在受试者的样品中测定FGFR抑制剂的有效性和/或FGFR抑制剂的继发效应。
15.一种测定FGFR激酶活性的调节的离体方法，所述方法包括步骤a)在开始FGFR抑制剂治疗之前测定患者的样品中FGF23水平(个体参照水平)；b)在所述FGFR抑制剂治疗之后测定同一患者的样品中的FGF23水平，其中，步骤b)中FGF23水平相比于个体参照水平的提高指示发生了 FGFR激酶活性 的调节，优选抑制。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述FGFR抑制剂选自PD176067、PD173074、化合物A 3-(2，3-二氯-3，5-二甲氧基-苯基)-1-{6-[4-(4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基 氨基]_嘧啶-4-基}-1_甲基脲、TKI258和化合物B ([4，5，] 二嘧啶基_6，4，二胺的 衍生物)。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述FGFR抑制剂为化合物A。
18.FGFR抑制剂在制备治疗患者的增生性疾病的药物中的应用，其中优选所述增生 性疾病为癌症，其中所述患者在使用该FGFR受体抑制剂之后具有FGF23水平的升高。
19.一种治疗患者的增生性疾病的方法，其中优选所述增生性疾病为癌症，包括对 所述患者给予FGFR抑制剂的步骤，其中所述患者在使用该FGFR受体抑制剂之后具有 FGF23水平的升高。
20.如权利要求18所述的应用或如权利要求19所述的方法，其中所述FGFR抑 制剂选自PD176067、PD173074、化合物A 3-(2，3- 二氯-3，5- 二甲氧基-苯 基)-l-{6-[4- (4-乙基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]_嘧啶-4-基}-1_甲基脲、TKI258和 化合物B([4，5’ ] 二嘧啶基_6，4’ 二胺的衍生物)。
21.如权利要求18所述的应用或权利要求19所述的方法，其中所述FGFR抑制剂为 化合物A。
22.—种诊断试剂盒，包括a)识别FGF23或其部分的分子，该分子可以是标记形式或未标记形式；b)能够检测选自无机磷(P)、磷和总钙的乘积(PxtCa)、骨桥蛋白(OPN)和甲状旁 腺激素(PTH)的组中的第二生物标记物的至少一种试剂；c)可选的使用指南；d)可选的检测手段；和e)可选的固相。
23.—种筛选患者以确定其是否从FGFR抑制剂治疗中受益的方法，该方法包括步骤(a)对患者进行一段时间FGFR抑制剂治疗；(b)在所述治疗后测量所述患者的样品中的FGF23水平；(C)将步骤(b)得到的FGF23值与个体参照水平(该患者在开始所述FGFR抑制剂治 疗之前的FGF23水平)比较，确定该患者是否应该继续所述FGFR抑制剂治疗。
全文摘要
本发明主要涉及体外诊断的方法，特别是选自成纤维细胞生长因子23(FGF23)、无机磷(P)、无机磷和总钙的乘积(P x tCa)、骨桥蛋白(OPN)和甲状旁腺激素(PTH)的组中的化合物作为生物标记物的应用。该生物标记物可用于监测成纤维细胞生长因子受体(FGFR)激酶活性的调节，特别是其抑制，和/或FGFR抑制的继发效应的发生。本发明进一步提供了涉及这些应用的方法和试剂盒。
文档编号G01N33/68GK102016592SQ200980115353
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月28日 优先权日2008年4月29日
发明者波塔 D·格劳斯, E·马雷尔, P·韦尔代什, V·瓜尼亚诺 申请人:诺瓦提斯公司