专利名称：发现用于前列腺癌诊断和治疗之生物标志物和药物靶标的方法及其确立的生物标志物测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于确立诊断癌症(特别是前列腺癌，无论是局限性或非局限性前 列腺癌)及其治疗和/或预后之生物标志物测定和/或药物靶标的方法的领域。本发明 的另一目的是提出针对这些诊断目的和/或患者分级的特异性生物标志物测定，以及使 用这些特异性生物标志物测定进行诊断的方法。
背景技术：
尽管经过十年的研究努力，但前列腺癌的诊断和治疗仍是临床中的主要挑战。 由于前列腺癌的完全消退与治愈仅在其早期阶段才可能发生，因此令人遗憾地该疾病的 发展是“静默(silent)”的，所以对较快发展和潜在危险病变的早期检测对于患者健康来 说至关重要。可用于前列腺癌的最佳的非侵入性诊断测试是检测血液中的前列腺特异性抗原 (Prostate Specific Antigen, PSA)连同直肠指检(digital rectalexamination, DRE)。 PSA
是前列腺上皮细胞产生的蛋白质。PSA也称为激肽释放酶IlKkallikreinlll)、精液素 (seminin)、semenogelase、Y -精浆蛋白以及P_30抗原，其为34kD糖蛋白，在正常男性
血清中少量存在，在前列腺癌和其它前列腺疾病中常有所升高。测量PSA的血液测试连 同DRE是前列腺癌早期检测的现有最有效的测试。高于正常水平的PSA与局限性(Ioc) 和转移性(met)前列腺癌(CaP)均有关。单独使用PSA的诊断准确性仅约为60%，并且该方法在特异性方面有明显缺 点(太多的假阳性病例接受不必要的前列腺活检或手术)。事实上，前列腺感染、刺激 (irritation),良性前列腺肥大(增大)或增生(BPH)以及最近射精也可导致PSA水平升 高，产生假阳性结果。因此，即使出现基于同时对多种参数(例如游离的和总的PSA)进行测量的新方 法作为增加总体诊断准确性的工具，但是仍缺乏可靠的、非侵入性的诊断/预后方法。 血液中的大多数PSA与血清蛋白结合。少量未与蛋白质结合，称为游离的PSA。在患 前列腺癌的男性中，游离(非结合)PSA与总PSA的比值降低。如果游离PSA与总PSA 的比值低于25%，则癌症风险增加。比值越低，则发生前列腺癌的可能性越高。但是， 在射精后，总PSA和游离PSA均立刻增加，在24小时内缓慢恢复到基线水平，并且与 CaP无关的其它机制也能够影响游离PSA与总PSA的比值。与诊断类似地，由于前列腺癌的异质性，对该疾病的治疗和/或预后仍是巨大 的挑战。尽管已提出前列腺癌症的多种机制，但是缺少合适的能够对患者分级的特征标 记(signature)，并且用于治疗性干预治疗的关键靶标蛋白仍未有找到。
发明内容
因此，本发明的目的是提供确立用于对癌症(特别是前列腺癌，无论是局限性或非局限性的前列腺癌)进行诊断、预后、治疗以及监测治疗和/或用于患者分级的生物 标志物测定和/或药物靶标的经改进方法。应当指出，从原理的角度来看，本发明所提 出的方法不限于癌症，而是可以应用到任何类型的人或动物疾病或功能失调。从实践的 角度来看，仅有的限制有时在于，应当存在可用于下述转换方法(tnmslational approach) 的模型系统。应当指出，不仅来自小鼠(或一般的动物，例如非人模型)的候选物是本发 明的一部分。潜在的候选标志物可从多种来源确定，还包括人组织、近端液(proximal fluid)、动物模式细胞系、数据挖掘等。然而，在系统生物学方法更加一般化的背景下，动物模型对于发现生物标志物 具有非常独特的优势。假定在不同癌症(其影响不同的组织)中细胞网络被干扰。进一 步假定，不同表现的癌症可具有相同或重叠的干扰(perturbation)，动物(如小鼠)模型允 许特异性地应用一个孤立的干扰或限定的干扰组合来确定靶组织对该干扰如何响应。如 果进一步假定，构成该响应(干扰的直接作用，例如，如果激酶缺失或发生突变，则磷 酸肽缺失)的某些蛋白质或补偿性作用在靶组织中留下特异性指纹，则使用我们本文所 述的方法可在血清中检测这些指纹中的一些。遗传限定小鼠模型的明显特点在于允许限 定与特定基因突变(在本申请中，如PTEN)有关的变化，所述突变是我们已知的在人类 癌症中也存在的突变，并因而直接提示应当关注和治疗的患者亚类(个体化医疗)。在规 划临床试验时，对于患病人群中分子标志物种类的普遍程度和频率具有扎实的了解常常 是重要的。可选择那些很可能良好响应的患者用于所谓“患者分级”方法中。基于此 信息，可以针对给定的严格的标志物谱来估计可用人群的规模。对经保存组织进行的回 顾性研究例如允许在临床阶段设计必须确定之前快速并较早地测定那些参数。本发明的另一目的是提出用于这些诊断/治疗/监测/预后/患者分级目的的特 异性生物标志物测定，以及使用这些特异性生物标志物测定进行诊断/治疗/监测/预后 /患者分级的方法。因此，根据第一方面，本发明涉及用于确立对癌症(或一般而言的疾病/功能失 调)进行诊断/治疗/监测/预后/患者分级之生物标志物测定的方法，其包括下列步 骤 (a)基于对来自健康非人哺乳动物个体以及来自患癌非人哺乳动物个体的组织样 品蛋白质组以及血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身之样品蛋白质组中蛋白质/ 肽成分浓度(丰度)的测量，并定性地选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示明显差异行 为的那些作为潜在的候选蛋白质/肽生物标志物，从而鉴定出潜在的候选蛋白质/肽生物 标志物。如上指出地，在此步骤中，使用非人样品不是必需的，此步骤也可以使用人来 源的样品，如人组织、近端液等。任选地，此步骤之后可以进行步骤(b)通过对来自健康非人哺乳动物个体以 及来自患癌非人哺乳动物个体的血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身之样品蛋 白质组中潜在的候选蛋白质生物标志物进行定量质谱测量，并选择在健康和癌症样品蛋 白质组间显示出质谱可测得的定量差异行为的那些作为候选蛋白质/肽生物标志物，从 而对步骤(a)中鉴定出的潜在的候选蛋白质/肽生物标志物进行验证。当然，在此验证 步骤中，质谱仅是一种测量方式并且也是优选的测量方式。也可以使用与最终用于诊断/预后/治疗之方法类似或相同的不同方法(例如使用亲和试剂)。然后进行步骤(C)通过对来自健康人个体以及来自患癌人个体的血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身之样品蛋白质组中的候选蛋白质生物标志物进行质谱测 量和/或基于抗体的测定，并选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示出质谱可测得的和/ 或基于亲和试剂之测定(优选基于抗体之测定)可测得的差异行为的那些作为蛋白质/肽 生物标志物，从而对步骤(a)中鉴定出或者任选地步骤(b)中经验证的候选蛋白质/肽生 物标志物进行确认；(d)应用统计学方法找出经步骤(C)确认的单个或成组蛋白质/肽生物标志物作 为用于检测癌症患者之特征标记。优选地，基于亲和试剂的测定是如上所述的基于抗体的测定方法/方式，并且 例如选用酶联免疫吸附测定(ELISA)或多重微珠阵列测定(Multiplex BeadArrayAssay)或
其它用于测量特定蛋白质浓度的方法。如上所述，所述方法不仅可用于测定癌症生物标志物系统，还可用于测定针对 生物体之其它疾病或功能失调类型的生物标志物系统。在上述方法(以及下文讨论中)的 这些情形中，表述“癌症”(例如，针对样品来说)实质上可以被表述“患病”或“功 能失调”所替代。因此，本发明的一个主旨是提高针对检测(前列腺)癌症之非侵入性诊断方法的 准确性，另一方面是鉴定出用于临床实践的新的治疗性/成像用靶标。我们已建立了针 对(前列腺)癌症生物标志物和/或药物靶标鉴定的方案，其总结在图1中，在下文中将 进行详细论述。该方法基于三个主要方面⑴基于使用遗传限定小鼠模型在体内最初鉴定出候选生物标志物和/或药物靶 标、而后在人临床样品中进行验证的转换方法。(II)我们实验室建立的用于分离、鉴定和定量N-连接糖蛋白的领先的基于质谱 之方法和生物信息学方法，以及(III)找出用于检测前列腺癌症患者的特定特征标记的多变量统计学方法。根据所提出方法的第一优选实施方案，其应用于前列腺癌的诊断。为此目的， 所述癌症样品蛋白质组选用患前列腺癌个体的样品蛋白质组。此外，组织样品为前列腺 组织样品，其中这些可以是局限性或非局限性前列腺癌的样品。相应地，选择衍生的蛋 白质/肽生物标志物用于诊断前列腺癌，可用于治疗前列腺癌或监测前列腺癌之治疗。根据所提出方法的另一实施方案，在步骤(a)中，来自样品蛋白质组的蛋白质均 选用糖蛋白(优选N-连接糖蛋白)，因为这些蛋白质构成了与癌症药物靶标和生物标志 物发现高度相关的蛋白质组亚类。优选地，在所述步骤(a)的第一步中，对相应样品的蛋白质组进行消化(优选通 过使用胰蛋白酶和/或LysC(然而，其它消化系统也是可使用的)来实现)，随后使用固 相提取进行提取(优选使用SPEG法，其在下文中将更详细地论述)。相应地，所测定的 生物标志物优选为N-连接糖蛋白和/或其肽片段。理论上，至少对于步骤(a)以及特别地针对其组织样品时可使用细胞培养系统。 但是，为了更真实地模拟人疾病或功能失调的复杂性，优选地选择来自体内来源的样 品，并且最优选地，所述非人哺乳动物个体选用小鼠，优选地，在分析和/或进一步处理蛋白质组之前，对步骤(a)中样品的鼠前列腺组织进行灌流以完全去除前列腺组织中的 血液(在其它疾病或功能失调的情形中，可以对相应的组织或器官作类似处理)。如上 文已指出地，由于几个原因，因此动物模型是优选的。该优选方式的三个 主要原因如下所述-样品是同质的，即样品来源的个体在遗传上相同并具有相同的病变-病变对应于在人癌症中观察到的病变，因此准确地模拟肿瘤发展_重现性可以一再制备非常类似的样品，而这对于人来说是不可能的-限定的干扰在人中，我们无法控制导致癌症的干扰。在动物模型中，可以 组织特异性和时间特异性的方式施加单个或组合的干扰。在步骤(a)中仅鉴定出蛋白质/其片段之后，优选地，仅选择在健康和癌症样品 来源之间显示非常明显之差异行为的蛋白质/其片段。为此目的，观察所测量信号的差 异行为(丰度差异)，仅选择那些显示足够差异行为的信号(对应于特定蛋白质/其片段) 用于下一步的进一步评估。差异行为可以是这样的情形，即当比较健康与癌症样品信号时，特定信号充分 地增加/降低；然而，也可以是另一种情形，即在癌症或健康样品信号中没有信号，但 分别在健康或癌症样品信号中有清晰可测的信号。因此，根据一个优选的实施方案，确 定步骤(a)中存在充分之差异行为的选择标准选自以下的组在前列腺组织和血清中受调节的生物标志物；在前列腺组织中受调节并在血清 中检出的潜在生物标志物；在前列腺组织中受调节并分泌的潜在生物标志物；仅在癌症 小鼠之前列腺组织和血清中检出的潜在生物标志物；前列腺特异性的并在癌组织或血清 中受调节的潜在生物标志物；前列腺特异性的并且分泌的潜在生物标志物；在前列腺组 织或血清中高度受调节的潜在生物标志物，优选地差异倍数大于4;基于现有知识选择 的潜在生物标志物，优选地特征在于已知其在癌症发展中的生物学功能；或者其组合， 优选地使用这些标准中至少五个或最优选地使用所有的组合。在这些优选的具体标准 中，以下标准的组合能得到可最终用于人诊断/治疗的生物标志物系统在前列腺组织 和血清中受调节的生物标志物；在前列腺组织中受调节并在血清中检出的潜在生物标志 物；在前列腺组织中受调节并分泌的潜在生物标志物；在前列腺组织或血清中高度受调 节的潜在生物标志物，优选地差异倍数大于4;基于现有知识选择的潜在生物标志物， 优选地特征在于已知其在癌症发展中的生物学功能。优选地，如果健康样品信号与癌症样品信号之间的差异倍数大于1.5或小于 0.75，则进行选择(选择意味着相应的蛋白质/其片段(意指蛋白质或该蛋白质的片段) 将进入下一步骤)。这特别适用于上述选择标准中的前三项。典型地，在步骤(a)中，第一步通过使用(鸟枪法)质谱技术来鉴定样品中蛋白 质/经消化蛋白质的肽，第二步使用液相色谱/质谱联用技术(优选无标记的定量技术) 用于鉴定健康和癌症样品之间的性质差异(通常为丰度差异)。优选地，在步骤(a)中， 通过使用将质谱信号对应于特定蛋白质/蛋白质片段的数据库信息，将质谱测得的蛋白 质/蛋白质片段信号归于相应的蛋白质。根据另一优选的实施方案，在步骤(b)中，通过使用定量内部标准(优选为专门 合成的内部标准)进行绝对定量。
还优选在步骤(b)和/或步骤(C)中使用串联质谱技术，优选为选择反应监 测(selected reaction monitoring，SRM)，优选与液相色谱联用，作为质谱方法。关于 使本说明书内容在合理范围内的这些技术及其定义和参数，参考出版物RDomon和 R.Aebersold, Mass Spectrometry andProtein Analysis (Science 312，121 (2006))以及其中弓 I
用的相应参考文献。关于用于分析蛋白质组的这些分析工具，这些文献的公开内容明确包括在本说明书内。本发明还涉及可使用上述方法确立的或使用此类方法特别确立的癌症诊断生物 标志物测定和/或治疗性靶标。特别地，这样的生物标志物测定和/或治疗靶标可以 在对相应方法之说明的背景下由下文进一步列举的集合组成，所以例如针对局限性前列 腺癌的癌症诊断/治疗生物标志物测定(用于监测局限性前列腺癌，特别是用于与良性 前列腺增生相区分)可以基于对人血清、血浆或血液衍生物或血液本身中选自从以下衍 生的蛋白质和/或蛋白质片段中至少两种、优选至少三种之浓度的联合测量ASPN、 VTN、AOC3、LOX、PGCP> PSAP> THBSl、CFH> CLU、KIT、TFRC> LGALS3BP、 GOLPH2、HYOUl、CTSD、OLFM4、AKAP13、CP、CPE、CPM> ICAMl、MSMB> TM9SF3、GALNTL4。整个说明书中一般使用的基因名称(此处给出的)、条目名称、 蛋白质名称(缩写)和登录号根据UniProt Consortium(www.uniprot.org)定义，其包括欧 洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)、瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics, SIB)和蛋白质序列数据库资源(Protein Information Institute, PIR)。优选地，使用串联质谱技术进行测量，优选地使用选择反应监测(SRM)，更优选 与液相色谱和/或酶联免疫吸附测定(ELISA)联用，以检测这些蛋白质/其片段。本发明还涉及使用上述方法可确立的或使用此类方法特别确立的癌症诊断生物 标志物测定和/或治疗性靶标。特别地，这样的生物标志物测定和/或治疗靶标可以 在相应方法之说明的背景下由下文进一步列举的集合组成，所以例如对局限性前列腺 癌的癌症诊断/治疗生物标志物测定可以基于ASPN和任选地VTN与以下之一种的组 合AOC3、LOX、PGCP> PSAP> THBSU CFH> CLU、KIT、TFRC> LGALS3BP、 GOLPH2、HYOUU CTSD、OLFM4衍生的蛋白质/其片段。此外，本发明涉及用于诊断、治疗和/或治疗性监测(人体)疾病或功能失调 (优选癌症，最优选前列腺癌(局限性的或非局限性的))的癌症诊断/治疗生物标志物测 定，其包括对人血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身中至少两种、优选至少三 种或至少5种蛋白质/肽生物标志物(例如根据上述方法进行测定)。所述测定可以例如 是基于抗体的测定，如酶联免疫吸附测定，但也可以是LC-SRM测定。为了提高这种癌症诊断生物标志物测定的可靠性，可以将其与基于亲和试剂的 测定(例如用于检测另外系统(如前列腺特异性抗原(PSA)的基于抗体的测定(如酶联 免疫吸附分析(ELISA))联用)。另外，此时也可使用例如利用微珠技术的针对一系列抗 体的多重测定技术。本发明还涉及通过测量(优选联合测量)人血清、血浆或任何其它血液衍生物 或血液本身中的ASPN衍生之蛋白质/其片段以及VTN衍生之蛋白质/其片段的浓度来 诊断局限性前列腺癌的方法。为了提高准确性，优选进行另一种(或甚至几种)测量， 即测量选自从以下衍生的蛋白质/其片段AOC3、LOX、PGCP> PSAP, THBS1。如果与PSA测量联用，则另外的蛋白质/其片段可额外选自CFH、CLU、KIT、TFRC、 LGALS3BP、G0LPH2。优选地，在这样的方法中，所述测量使用通常与在前的液相色谱技术联用的串 联质谱技术(优选地使用选择反应监测(SRM))来进行。作为替代或另外地，可以使用 基于抗体的测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))来检测这些蛋白质/其片段。可以 使用组合的方法，因此例如一个系统(或一组系统)可以使用SRM (如果例如ELISA不 可用时)来测定，而其余的系统可以使用基于抗体的技术(例如ELISA技术)来测定。在这样的方法中，通常对于局限性前列腺癌的阳性诊断来说，ASPN衍生之蛋白 质/其片段的浓度须高于55ng/ml，优选地高于60ng/ml，任选地，与此同时，VTN衍生 之蛋白质/其片段的浓度须低于3500ng/ml，优选地低于3300ng/ml。如果(根据优选地)测量另一种上述额外系统，
则AOC3衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于250ng/ml，优选地低于220ng/ ml,和/或LOX衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于580ng/ml，优选地低于550ng/ ml,和/或PGCP衍生之蛋白质/片段的浓度须高于550ng/ml，优选地高于570ng/ ml,和/或PSAP衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于33000ng/ml，优选地低于 32500ng/ml,更优选地低于 32250ng/ml，和/或THBSl衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于12500ng/ml，优选地高于 13000ng/ml,更优选地高于 13500ng/ml，和/或LGALS3BP衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于390ng/ml，优选地高于 400ng/ml,和/或GOLPH2衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于80ng/ml，优选地高于 90ng/ml,和/或HYOUl衍生之蛋白质/其片段的浓度必须高于35ng/ml，优选地高于 40ng/ml,和/或CTSD衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于32ng/ml，优选地低于25ng/ ml,和/或OLFM4衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于20ng/ml，优选地低于15ng/ ml,优选地，在这样的方法中，使用联合测量人血清、血浆或血液衍生物或血液本 身中选自从以下衍生的至少3种蛋白质和/或蛋白质片段的浓度ASPN、HYOUU CTSD, OLFM4来进行测量，用于诊断和/或用于治疗和/或用于监测局限性前列腺癌以 与良性前列腺增生相区别。对于诊断/监测来说，优选地使用基于亲和试剂的测定(优 选基于抗体的测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA))额外地对人血清、血浆或血液衍生 物或血液本身中的前列腺特异性抗原(PSA)的浓度进行测量。对于阳性诊断来说更优选 地，前列腺特异性抗原(PSA)的浓度须高于2ng/ml，优选地高于4ng/ml。在此背景下，对于局限性前列腺癌的阳性诊断或监测来说优选地，ASPN衍生之蛋白质/其片段的浓度因而须高于55ng/ml，优选地高于60ng/ml ；和/或HYOUI衍生 之蛋白质/其片段的浓度须高于35ng/ml，优选地高于40ng/ml ；和/或CTSD衍生之蛋 白质/其片段的浓度须低于32ng/ml，优选地低于25ng/ml ；和/或0LFM4衍生之蛋白 质/其片段的浓度须低于20ng/ml，优选地低于15ng/ml。应指出，针对上文给出的阈值浓度以及下文的详述，这些可取决于特定的测量 技术，例如本文所用的方法(即SRM)将测量所有种类(如游离的和结合的种类)，而例 如基于抗体的测定(如ELISA)则可能能够区分这两种形式，导致如果使用后一种方法的 话则出现不同的阈值浓度。因而本文给出的数值特别地涉及使用SRM方法的测量值，如 果使用不同的方法，则可能需要类推转换。但这种转换是在本领域技术人员技能范畴之 内的。本发明还涉及通过测量(优选联合测量)人血清、血浆或任何其它血液衍生物或 血液本身中的ASPN和CTSD和THBSl和GALNTL4以及VTN衍生之蛋白质/其片段的 浓度并优选地与测量选自从PSAP、GSPTl、CEACAMU HYOUl、EFNA5、KIT衍生
之另一种蛋白质/其片段联用的极高准确性方法，用于诊断转移性前列腺癌。优选地，如上述用于诊断局限性前列腺癌的方法所述，使用串联质谱技术(优 选地使用选择反应监测(SRM))进行测量，更优选地与液相色谱和/或基于抗体的方法 (如酶联免疫吸附测定(ELISA))联用以用于检测这些蛋白质/其片段。对于非局限性(转移性)前列腺癌的阳性诊断来说，ASPN衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于60ng/ml，优选地高于65ng/ml，最 优选地高于68ng/ml，并且同时CTSD衍生之蛋白质/片段的浓度须高于120ng/ml，优选地高于130ng/ml，最 优选地高于133ng/ml，并且同时THBSl衍生之蛋白质/片段的浓度须低于12000ng/ml，优选地低于11500ng/ ml,最优选地低于10750ng/ml，并且同时GALNTL4衍生之蛋白质/片段的浓度须高于1400ng/ml，优选地高于1600ng/ ml,最优选地高于1650ng/ml，并且同时VTN衍生之蛋白质/片段的浓度须高于3000ng/ml，优选地高于3150ng/ml，最 优选地高于3300ng/ml。如果(根据优选地)测量另一种上述额外系统， 则PSAP衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于33000ng/ml，优选地高于34000ng/ ml,和/或GSPT1衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于450ng/ml，优选地高于 500ng/ml,更优选地高于510ng/ml，和/或CEACAM1衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于35ng/ml，优选地高于 38ng/ml (此阈值是唯一根据ELISA测定计算出的值)， 和/或HYOUl衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于80ng/ml，优选地高于89ng/ ml, 和/或EFNA5衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于60ng/ml，优选地高于65ng/ ml,
和/或KIT衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于90ng/ml，优选地高于95ng/ ml ο如上所述，无论对于局限性或非局限性前列腺癌症诊断来说，将对上述系统的 测量与对血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身中另一些参数(其并非上述生物 标志物测定方法的结果)的测量联用可以是有利的。例如，对于诊断来说，可以使用基 于抗体的测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))来额外地测量人血清、血浆或任何其它 血液衍生物或血液本身中的前列腺特异性抗原(PSA)，其中对于阳性诊断来说，前列腺 特异性抗原(PSA)的浓度通常须高于2ng/ml，优选地高于4ng/ml。本发明另外的实施方案列在后附的权利要求中。
在附图中显示了本发明的一些优选实施方案图1是用于发现、验证和确认生物标志物之综合蛋白质组方法的总览。该图分 为两个主要部分第一部分是使用动物模型的发现和验证阶段，第二部分是使用人患者 样品的确认阶段；斜体数字表示经鉴定并考虑用于下一步的糖蛋白数；其中a)从来自 健康和癌症小鼠的组织和血清中选择性地富集N-糖肽，使用来自CaP小鼠模型的前列腺 组织来体内发现CaP特异性的特征标记；这产生了一组785种糖蛋白作为后一步骤的来 源；对于同样的鼠组织和血清样品进行基于质谱的无标记的定量；这得到352种糖蛋白 在癌症和良性样品间比较的相对定量；然后选出164种符合标准的糖蛋白用于进一步的 研究；其中b)这些候选生物标志物中的41种可以在小鼠血清中得以确认，并且其中 C)通过基于质谱的选择反应监测(SRM)和ELISA在人患者中确认了 43种候选物；通 常，人与动物步骤间的界限是灵活的；例如，也可以在人样品中进行验证步骤，如果这 样的收集确实有用的话；图2显示了小鼠糖蛋白质组目录(Mouse Glycoproteome Catalog)的总览，其中在
小鼠前列腺组织和血清中鉴定出的蛋白质数目用文氏图(Venn diagram)显示；下方显示 了可进行定量的蛋白质数；以及图3显示所选候选物在多参数方法中的区分准确度；遵循通过统计学软件得 到的规律对患者进行分类；正确预测的百分数定义为该模型的准确度；如上所示，基 因名称根据UniProt Consortium (www.uniprot.org)来定义，其包括欧洲生物信息研究所 (EBI)、瑞士生物信息研究所(SIB)和蛋白质序列数据库资源(PIR)；第一行中阴影表示 的条目指示可在一个测定内互换的系统。对优选实施方案的详细描述参考附图(其目的在于示意本发明的一些优选实施方案，而非限制本发明)，图 1显示用于发现、验证和确认生物标志物之综合蛋白质组方法的总览。该图分为两个主要 部分第一部分是使用动物模型(小鼠)进行的发现和验证阶段(a)和(b)，第二部分是 在人患者样品中的确认阶段(C)。在以下实施例中，所述方法用于确定针对前列腺癌的生物标志物。如上所述， 这不应理解为本发明的实际要旨，因为本方法可以等同地应用于其它类型的癌症(例如 乳腺癌、肺癌、卵巢癌等)，并且它还可以等同地一般性应用于其它类型的疾病或功能失调(例如多尿症(diabetes)(糖尿病(mellitus)或其它类型)；神经退行性疾病，例如阿尔 茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏病、克雅氏症；自身免疫病，例如多发性硬化症、类风 湿性关节炎；感染性疾病，如疟疾、HIV;心血管疾病，例如高血压、动脉粥样硬化。 如上所述，使用动物模型的主要优势在于可以施加特定的、限定的干扰，并测量这些干 扰的结果。同样的干扰还可能与其它类型的癌症相关，这意味着可以将标志物视为所引 发之干扰的合理结果，而不是像“疾病相关的”这样的一般性表述可表示的。在最初的发现阶段，使用健康小鼠和前列腺癌小鼠的前列腺组织样品、血清样品或者两者，因此有四个不同系列的实验。对于差异行为的确定，仅对健康/癌症小鼠 的组织样品进行比较，另一方面对健康/癌症小鼠的血清样品进行比较。在第一步骤(a)中，使用胰蛋白酶对组织(如下详述进行制备)和血清样品进行 消化，从相应蛋白质组的消化产物中选出N-连接的糖基化蛋白质，并使用SPEG技术进 行提取(下文有详细描述)。然后使用质谱(特别地“鸟枪法”)进行随后的糖蛋白鉴定，在该阶段无需确 定差异行为。这样在前列腺组织中总共检测到532种糖蛋白，在血清中检测到253种糖 蛋白。总共检测到785种糖蛋白，这是因为有110种蛋白质同时在组织和血清中检测到 (如图2所示)。下一步使用无标记的定量测定，其目的在于检测蛋白质片段信号的差异行为。 该实验是液相色谱/质谱联用的实验，其中质谱测量根据色谱的洗脱谱来进行。使用此 实验，可以追踪健康/癌症样品间的差异行为。该无标记定量步骤中未显示差异行为的 那些信号/蛋白质片段从上述785种糖蛋白中排除，得到352种经定量的蛋白质，其中 279种来自组织样品，160种来自血清样品(如图2所示)。对这352种经定量的蛋白质进行进一步地选择，仅保留那些显示明显差异行为 并符合下表1中所列及讨论的8项依据中至少一项的蛋白质。使用这些依据进行筛选后， 得到164种潜在的候选生物标志物系统，其通过使用电子注解(electronic annotation)将信 号对应于特定的糖蛋白。在第二步骤(b)(其为任选的步骤)中，使用非人系统进行验证或进一步定性， 其中使用最终生物标志物测定方法将要使用的最终分析工具。在此步骤(b)中，相应地 仅对健康/癌症小鼠的血清进行分析，再次对其进行消化并按照步骤(a)中所述提取糖蛋 白，但是随后使用选择反应监测(SRM)(即液相色谱/串联质谱方法)对系统进行绝对定 量，其使用专门提供(合成)的内部标准进行绝对定量。主要由于操作的原因，在进入步骤(b)的164个系统中仅有41个可被绝对定 量。相应的41个系统列在表2中，并在下文有更详细的论述。因此，对于下一步来说，使用来自步骤(a)的所有164个系统进行最终的确认步 骤(c)。步骤(b)的结果通过使用RT-PCR、免疫组化、Western印迹进行验证。在步骤(c)中进行与步骤(b)中几乎相同的步骤，但此时使用人来源的健康/癌 症个体的血清样品。根据SRM测定，得到37个候选物。可能时，使用现有的ELISA 测定对进入步骤(C)的164个候选物进行进一步地验证，得到另外11个可能的候选物。由于某些系统来自SRM验证以及来自ELISA确认，因此最终得到43个候选生 物标志物系统。它们列在表3中。
理论上，可以将这些中任何一个以及可能地与一个或几个联用以用于检测前列腺癌。由于 通过同时保持尽可能高的准确性来减少必需的测量数，因此对全部43个系 统应用统计学方法(更详细的讨论见下文)，这与患者的数据收集相关联，得到图3中给 出的最终测定。图3A)中给出了 5个准确度特别高的测定，并注意到，在所有测定中都存在 ASPN和VTN。因此，相应地，这些基因衍生的糖蛋白或这些糖蛋白的片段高度指示 出良性前列腺增生(BPH)和局限性前列腺癌(locPCa)之间的差别。相应的准确度高于 80%,因此约比现有技术中PSA方法的准确度高出20%。额外引入使用ELISA的PSA测量，利用统计学还发现了区分BPH与IocPCa的
9个生物标志物测定，如图3B)所示。再次地，在所有这些系统中均存在ASPN和VTN 衍生的糖蛋白。这些联合测量的准确度比未采用PSA测量的方法又高出10%，最终得到 针对前列腺癌检测的迄今尚未到达过的极高准确度。额外引入使用ELISA的PSA测量和更多数据，利用统计学还发现了区分BPH 和IocPCa的5个生物标志物测定，如图3C)所示。在这些系统的每一个中，ASPN、 OLFM4、HYOUU CTSD衍生的糖蛋白中有三个存在于系统中。相应的准确度仍高于 80%,因此约比现有技术中PSA方法的准确度高出20%。最后，图3D)中给出了区分IocPCa与metCPa的生物标志物测定的统计学结果。 在每个测定中使用六个系统的联合测量，可达到100%的准确度。上文表明，本发明所提出的方法不仅为靶向开发高准确度的生物标志物测定提 供了强大的工具。此外，其还表明，针对前列腺癌的具体情形，本发明确立的生物标志 物测定显示出预料不到的高准确度，其超出了迄今文献中所报道的任何准确度。实验细节⑴转换方法该转换方法基于在前列腺癌小鼠模型中对感兴趣的候选生物标志 物进行最初鉴定，并将这些候选物在人临床样品中进行确认。为了鉴定将要用于临床中 的候选生物标志物(称为“诊断或治疗靶标”)，我们开始分析来自患前列腺癌的遗传限 定小鼠(Pten条件性敲除(cKO)，例如见US 2006/0064768)以及具有完好的Pten等位基 因并且未患这种肿瘤的对照小鼠的前列腺组织和血液。使用小鼠模型的依据我们决定使用遗传限定的Pten条件性敲除模型是因为这 些小鼠在肿瘤抑制基因Pten缺失后发生早期上皮前列腺癌。其表型与人局限性前列腺癌 非常相关，因此成为鉴定能够区分人局限性前列腺癌和良性增生病变(良性前列腺增生 或BPH)的新型生物标志物的理想起点。并且，使用Pten cKO小鼠模型允许鉴定将要特 异性用于对具有PTEN突变或任何源自PTEN信号途径中突变之失衡的患者进行分级的治 疗性/成像靶标和生物标志物。使用小鼠模型有利于对候选生物标志物进行最初鉴定， 因为前列腺组织非常同质性，并且主要变量(如环境条件和时间进程)可以被控制，其与 高度异质性的人组织不同。令人感兴趣的是，与人相比，小鼠中前列腺癌组织体积与血 液总体积的比值要高出40 40000倍。这当然是内在的优势，因为预期该模型中血液蛋 白质组中的变化比人患者样品中更容易发现。最后，只有鼠组织可以为了消除血液污染 物而有效地进行灌注(见下文)。组织中的血液蛋白质污染物常常掩盖浓度特别低的蛋白质的鉴定。并且，灌注后的组织中没有血液使得可以进行没有任何潜在偏向性的比较蛋 白质组学(血液-组织)(见表1，依据1、2、4、7)。
权利要求
1.确立癌症诊断/预后生物标志物测定的方法，其包括以下步骤(a)基于对来自健康非人哺乳动物个体以及来自患癌非人哺乳动物个体的组织样品蛋 白质组以及血清、血浆或血液衍生物或血液本身之样品蛋白质组中蛋白质/肽成分浓度 的测量，并定性地选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示明显差异行为的那些作为潜在 的候选蛋白质/肽生物标志物，从而鉴定出潜在的候选蛋白质/肽生物标志物和药物靶 标；(b)任选地，通过对来自健康非人哺乳动物个体以及来自患癌非人哺乳动物个体的血 清、血浆或血液衍生物或血液本身之样品蛋白质组中潜在的候选蛋白质生物标志物进行 定量质谱测量，并选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示出质谱可测得的定量差异行为 的那些作为候选蛋白质/肽生物标志物，从而对步骤(a)中鉴定出的潜在的候选蛋白质/ 肽生物标志物进行验证；(c)通过对来自健康人个体以及来自患癌人个体的血清、血浆或血液衍生物或血液 本身之样品蛋白质组中的候选蛋白质生物标志物进行质谱测量和/或基于亲和试剂的测 定，并选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示出质谱可测得的和/或基于亲和试剂之测 定可测得的差异行为的那些作为蛋白质/肽生物标志物，从而对步骤(a)中鉴定出或者任 选地步骤(b)中经验证的候选蛋白质/肽生物标志物进行确认；(d)应用统计学方法找出经步骤(c)确认的单个或成组蛋白质/肽生物标志物作为用 于检测癌症患者和/或用于癌症预后和/或患者分级的特征标记。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症样品蛋白质组是患前列腺癌个体的样品 蛋白质组，其中所述组织样品是前列腺组织样品，其中优选地使用局限性或非局限性前 列腺癌的样品，并且其中选择所述蛋白质/肽生物标志物用于前列腺癌的诊断，和/或，其中在步骤(a)中，来自样品蛋白质组的蛋白质全部选用糖蛋白，优选 N-连接的糖蛋白，并且其中优选地在第一步中，消化样品之蛋白质组，优选使用胰蛋 白酶和/或Lys C进行消化，随后使用固相提取进行提取，并且其中所述生物标志物是 N-连接的糖蛋白和/或其肽片段，和/或其中所述非人哺乳动物个体是小鼠，并且其中优选地在分析和/或进一步处理 蛋白质组之前，对步骤(a)中样品之小鼠前列腺组织进行灌注以完全去除前列腺组织中的 血液。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)的选择标准选自在前列腺组织和血清中受调节的潜在生物标志物；在前列腺组织中受调节并在血清中检出的潜在生物标志物；在前列腺组织中受调节并分泌的潜在生物标志物；仅在癌症 小鼠之前列腺组织和血清中检出的潜在生物标志物；前列腺特异性的并在癌症组织或血 清中受调节的潜在生物标志物；前列腺特异性的并且分泌的潜在生物标志物；在前列 腺组织或血清中高度受调节的潜在生物标志物，优选地差异倍数大于4;基于现有知识 选择的潜在生物标志物，优选地特征在于已知其在癌症发展中的生物学功能；或者其组 合，优选地使用这些标准中至少五种或最优选地使用所有这些标准的组合，并且其中优选地如果健康样品信号与癌症样品信号之间的差异倍数大于1.5或小于 0.75、更优选地大于1.75和小于0.5，则进行选择。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中，第一步中通过使用鸟枪法质谱技术来鉴定样品中的蛋白质/经消化的肽，第二步中使用液相色谱/质谱联用技 术、优选无标记的定量技术来鉴定健康和癌症样品之间差异性质，和/或，其中在步骤(b)中，通过使用定量内部标准、优选专门合成的内部标准进行 绝对定量，和/或，其中在步骤(b)中和/或在步骤(C)中，使用串联质谱技术、优选地使用选 择反应监测(SRM)、优选与液相色谱联用来作为质谱方法，和/或，其中在步骤(a)中，通过使用数据库信息将质谱检测出的蛋白质/蛋白质片 段信号对应于相应的蛋白质。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中所述基于亲和试剂的方 法/测定是基于抗体的方法/测定，优选地选用酶联免疫吸附测定(ELISA)或多重微珠 阵列测定。
6.使用前述权利要求中任一项所述的方法能够确立和/或确立的癌症诊断和/或治疗 和/或预后和/或患者分级用生物标志物测定。
7.用于诊断和/或治疗前列腺癌的癌症诊断和/或治疗和/或预后和/或患者分级用 生物标志物测定，其包括在人血清、血浆或血液衍生物或血液本身中测量根据权利要求 1-5之一项方法确定的至少两种、优选至少三种蛋白质/肽生物标志物，并优选地与用于 检测前列腺特异性抗原(PSA)的基于亲和试剂的测定、优选基于抗体的测定例如酶联免 疫吸附测定(ELISA)联用。
8.用于诊断和/或用于治疗和/或用于监测局限性前列腺癌、特别是用于与良性前列 腺增生相区别的方法，其使用联合测量人血清、血浆或血液衍生物或血液本身中选自从 以下衍生之蛋白质和/或蛋白质片段中至少2种、优选至少3种的浓度ASPN、VTN、 AOC3、LOX > PGCP > PSAP > THBSl、CFH > CLU、KIT、TFRC > LGALS3BP、 GOLPH2、HYOUl、CTSD、OLFM4、AKAP13、CP、CPE、CPM> ICAMl、MSMB> TM9SF3、GALNTL4。其中优选地，使用串联质谱技术、优选地使用选择反应监测(SRM)、更优选与液相 色谱和/或酶联免疫吸附测定(ELISA)联用来检测这些蛋白质/其片段。
9.根据权利要求8所述的用于诊断和/或用于治疗和/或用于监测局限性前列腺癌的 方法，其使用联合测量人血清、血浆或血液衍生物或血液本身中的ASPN衍生之蛋白质 /其片段的浓度，任选地与VTN衍生之蛋白质/其片段的测量联合，优选地与选自从以 下衍生的另一种蛋白质/其片段的测量联合AOC3、LOX、PGCP、PSAP, THBSU CFH> CLU、KIT、TFRC> LGALS3BP、GOLPH2、HYOUl、CTSD、OLFM4,其中优选地对于局限性前列腺癌的阳性诊断或监测来说，ASPN衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于55ng/ml，优选地高于60ng/ml，并且同时，其中，如果根据优选地进行额外测量的话，则VTN衍生之蛋白质/片段的浓度须低于3500ng/ml，优选地低于3300ng/ml，AOC3衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于250ng/ml，优选地低于220ng/ml，和/或LOX衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于580ng/ml，优选地低于550ng/ml，和/或PGCP衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于550ng/ml，优选地高于570ng/ml，和/或PSAP衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于33000ng/ml，优选地低于32500ng/ ml,最优选地低于32250ng/ml，和/或THBSl衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于12500ng/ml，优选地高于 13000ng/ml,最优选地高于 13500ng/ml，和/或LGALS3BP衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于390ng/ml，优选地高于 400ng/ml,和/或GOLPH2衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于80ng/ml，优选地高于90ng/ml,和/或HYOUl衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于35ng/ml，优选地高于40ng/ml， 和/或CTSD衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于32ng/ml，优选地低于25ng/ml， 和/或OLFM4衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于20ng/ml，优选地低于15ng/ml。
10.用于诊断和/或用于治疗和/或用于监测局限性前列腺癌以用于与良性前列腺 增生相区别的方法，其使用联合测量人血清、血浆或血液衍生物或血液本身中选自从 ASPN、HYOUU CTSD、OLFM4衍生的至少3种蛋白质和/或蛋白质片段的浓度，并 且其中为了诊断/监测，使用基于亲和试剂的测定、优选基于抗体的测定例如酶联免疫 吸附测定(ELISA)额外地测量人血清、血浆或血液衍生物或血液本身中前列腺特异性抗 原(PSA)的浓度，并且其中优选地对于阳性诊断来说，前列腺特异性抗原的浓度须高于 2ng/ml、优选地高于4ng/ml。
11.根据权利要求10所述的用于诊断和/或用于治疗和/或用于监测局限性前列腺癌 的方法，其中对于局限性前列腺癌的阳性诊断或监测来说ASPN衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于55ng/ml，优选地高于60ng/ml， 和/或HYOUl衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于35ng/ml，优选地高于40ng/ml， 和/或CTSD衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于32ng/ml，优选地低于25ng/ml， 和/或OLFM4衍生之蛋白质/其片段的浓度须低于20ng/ml，优选地低于15ng/ml。
12.用于诊断和/或用于治疗和/或用于监测非局限性前列腺癌、特别是用于与局限 性前列腺癌相区别的方法，其通过使用优选地联合测量人血清、血浆或血液衍生物或血 液本身中ASPN和CTSD和THBSl和GALNTL4以及VTN衍生之蛋白质/其片段的浓 度，其中优选地使用串联质谱技术、优选地使用选择反应监测(SRM)、更优选地与液相 色谱和/或酶联免疫吸附测定(ELISA)联用来检测这些蛋白质/其片段。
13.根据权利要求12所述的用于诊断和/或用于治疗和/或用于监测非局限性前列腺 癌症的方法，用于与局限性前列腺癌相区别，其使用联合测量人血清、血浆或血液衍生 物或血液本身中ASPN和CTSD和THBSl和GALNTL4以及VTN衍生之蛋白质/其片段 的浓度，优选地与测量选自从PSAP、GSPTl、CEACAMU HYOUl、EFNA5、KIT衍 生的另一种蛋白质/其片段联用。
14.根据权利要求12或13所述的用于诊断和/或用于治疗和/或用于监测非局限性 前列腺癌的方法，其中对于转移性前列腺癌的阳性诊断来说ASPN衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于60ng/ml，优选地高于65ng/ml，最优选 地高于68ng/ml，并且同时CTSD衍生之蛋白质/片段的浓度须高于120ng/ml，优选地高于130ng/ml，最优选 地高于133ng/ml，并且同时THBSl衍生之蛋白质/片段的浓度须低于12000ng/ml，优选地低于11500ng/ml，最 优选地低于10750ng/ml，并且同时GALNTL4衍生之蛋白质/片段的浓度须高于1400ng/ml，优选地高于1600ng/ml， 最优选地高于1650ng/ml，并且同时VTN衍生之蛋白质/片段的浓度须高于3000ng/ml，优选地高于3150ng/ml，最优选 地高于 3300ng/ml。其中如果根据优选地进行额外测量的话，则PSAP衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于33000ng/ml，优选地高于34000ng/ml,和/或GSPTl衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于450ng/ml，优选地高于500ng/ ml,更优选地高于510ng/ml，和/或CEACAM1衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于35ng/ml，优选地高于38ng/ ml (此阈值是唯一根据ELISA测定计算出的值)，和/或HYOUl衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于80ng/ml，优选地高于89ng/ml， 和/或EFNA5衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于60ng/ml，优选地高于65ng/ml， 和/或KIT衍生之蛋白质/其片段的浓度须高于90ng/ml，优选地高于95ng/ml。
15.根据权利要求8-14中任一项所述的方法，其中对于诊断/监测来说，使用基于 亲和试剂的测定、优选基于抗体的测定例如酶联免疫吸附测定(ELISA)额外地测量人血 清、血浆或血液衍生物或血液本身中前列腺特异性抗原(PSA)的浓度，并且其中对于阳 性诊断来说，所述前列腺特异性抗原的浓度须高于2ng/ml，优选地高于4ng/ml，并且其 中特别地针对诊断/监测局限性前列腺癌来说，所述前列腺特异性抗原的浓度优选地须 高于2ng/ml，优选地高于5ng/ml，最优选地高于8ng/ml，并且其中对于非局限性前列腺 癌的阳性诊断来说，所述前列腺特异性抗原的浓度优选地须高于lOOng/ml，优选地高于 150ng/ml,更优选地高于175ng/ml。
16.权利要求8-15中任一项之方法用于分期和/或诊断目的的用途，特别地用于局限 性前列腺癌的早期检测和诊断，和/或用于治疗选择和/或用于治疗监测。
全文摘要
本发明涉及用于确立癌症诊断/治疗用生物标志物测定和药物靶标的方法，其包括下列步骤(a)基于对来自健康非人哺乳动物个体以及来自患癌非人哺乳动物个体的组织样品蛋白质组以及血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身样品蛋白质组中的蛋白质/肽成分浓度的测量，并定性地选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示明显差异行为的那些作为潜在的候选蛋白质/肽生物标志物，从而鉴定潜在的候选蛋白质/肽生物标志物和药物靶标；(b)任选地，通过对来自健康非人哺乳动物个体以及来自患癌非人哺乳动物个体的血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身样品蛋白质组中潜在的候选蛋白质生物标志物进行定量质谱测量，并选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示出质谱可测得的定量差异行为的那些作为候选蛋白质/肽生物标志物，从而对步骤(a)中鉴定出的潜在候选蛋白质/肽生物标志物进行验证；(c)通过对来自健康人个体以及来自患癌人个体的血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身样品蛋白质组中的候选蛋白质生物标志物进行质谱测量和/或基于抗体的测定(如酶联免疫吸附测定(ELISA))，并选择在健康和癌症样品蛋白质组间显示出质谱可测得的和/或基于抗体之测定可测得的差异行为的那些作为蛋白质/肽生物标志物，从而对步骤(a)中鉴定出或者任选地步骤(b)中验证的候选蛋白质/肽生物标志物进行确认；(d)应用统计学方法找出经步骤(c)确认的单个或成组蛋白质/肽生物标志物作为用于检测癌症患者之特征标记。本发明还涉及使用人血清、血浆或任何其它血液衍生物或血液本身对癌症(特别是局限性或非局限性前列腺癌)进行高度可靠之诊断的特异性生物标志物测定。
文档编号G01N33/68GK102027373SQ200980117399
公开日2011年4月20日 申请日期2009年5月12日 优先权日2008年5月14日
发明者伊戈尔·西马, 威廉·克雷克, 托马斯·塞尔尼, 拉尔夫·席斯, 西尔克·吉勒森, 鲁道夫·埃伯索尔德 申请人:圣加伦州立医院, 埃斯苏黎世公司