基于肿瘤抑制因子的过度增生细胞对溶瘤病毒疗法的敏感性的制作方法

专利名称：基于肿瘤抑制因子的过度增生细胞对溶瘤病毒疗法的敏感性的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及病毒学，分子生物学和医学领域。更特别地，它涉及测定过度增生 紊乱包括癌症对于溶瘤病毒疗法的敏感性。
背景技术：
呼肠孤病毒(呼吸道肠道孤儿病毒)是一种普遍存在的无包膜病毒，包含作为其 基因组的10条双链RNA片段，它对人类的感染通常是温和的，局限于上呼吸道和胃肠道并 且通常在有免疫功能的宿主中是无症状的(Tyler，2001)。关于逆转改造呼肠孤病毒的尝试 大部分是失败的，这归因于多个因素，包括呼肠孤病毒的双链RNA基因组。已知缺失σ 1的 呼肠孤病毒颗粒是无传染性的(Larson et al，1994)。重要的是，很多年来呼肠孤病毒被公认为当它感染特定类型的转化细胞时可呈现 显著的杀细胞能力(Duncan et al,1978 ；Hashiro et al，1977)。有复制能力的溶瘤病毒 提供了引人注目的抗癌疗法。这些溶瘤病毒有两个主要优点。第一，与传统的化学疗法和 放射疗法不同，由于它们在正常细胞中的复制能力有限所以它们能特异性锚定癌细胞。第 二，与无复制能力的载体相比，它们能从最初感染的癌细胞蔓延到周围的癌细胞，从而达到 大量分布以及有效地抗癌的效果。虽然暴露于野生型的呼肠孤病毒对于健康的个体而言通常是无症状的，但是对于 免疫缺损的个体而言仍会存在很大潜在的非常严重的风险，这就限制了呼肠孤病毒疗法对 病人的临床应用潜能，如对于可能从这一疗法中获益的癌症病人。直至在体外和体内发 现包含致癌的Ras信号通路的转化细胞对感染呼肠孤病毒(3型Dearing株)尤其敏感 (Coffey et al, 1998 ；Strong et al, 1998 ；Norman et al，2004)之前,呼肠孤病毒溶瘤能 力的基本原理仍然是未知的。由于在各种人类癌症中通常能观察到Ras基因突变(Duursma et al，2003)，这些发现导致当前呼肠孤病毒疗法在临床试验中的使用(Norman et al, 2005)。然而，Ras基因突变的存在可能只是癌细胞对呼肠孤病毒疗法敏感性的部分原因。 最近研究显示Ras通路并不是决定允许呼肠孤病毒的唯一因素(Song et al，2009)，并且 还显示从转化Ras的细胞可以建立抗呼肠孤病毒的细胞(Kim et al,2007)而仍保留活化 的Ras突变。因此，需要有改进的方法来鉴别和筛选合适的癌细胞子群体用于呼肠孤病毒 疗法和其他溶瘤病毒试剂。

发明内容
发明概述当含有特定缺损的或失活的肿瘤抑制基因如p53、Rb、ATM、BRCAU BRCA2、MutS, MutL, MutH, APC和ATBFl的过度增生或转化的癌细胞在体外或体内暴露于呼肠孤病毒时， 该病毒不论是以野生型(3型Dearing)还是改良型形式(例如ο 1蛋白合成缺损的不完 全减弱病毒)存在，对杀伤这些癌细胞均有效。因此，呼肠孤病毒的应用范围可以扩展至与 ras原癌基因信号通路异常或活性过剩相关的案例。先前被认为主要应答ras、干扰素或其 他细胞免疫信号通路状态的其他病毒对肿瘤抑制因子功能的缺失也是敏感的，它们的应用 范围也同样可以扩展。因此，依据本发明，提供了一种确定过度增生紊乱对呼肠孤病毒或粘液瘤病毒的 溶瘤作用是否敏感的方法，包括(a)提供一种过度增生细胞；(b)测定由过度增生细胞获得 的 p53、Rb、ATM、BRCAl、BRCA2、MutS、MutL、MutH、APC 和 / 或 ATBFl 基因或基因产物的结构、 功能或表达；以及(c)比较过度增生细胞的与野生型的p53、Rb, ATM, BRCAU BRCA2、MutS、 MutL, MutH, APC和/或ATBFl基因或基因产物的结构、功能或表达，其中过度增生细胞的 p53、Rb、ATM、BRCAl、BRCA2、MutS、MutL、MutH、APC 和 / 或 ATBFl 在结构、功能或表达上的缺 陷表明过度增生紊乱对呼肠孤病毒或粘液瘤病毒的溶瘤作用是敏感的。本方法可以进一步包括例如通过呼肠孤病毒和/或粘液瘤病毒疗法来治疗病人， 该病人是过度增生细胞的来源。呼肠孤病毒疗法可以是野生型呼肠孤病毒疗法或减毒型 呼肠孤病毒疗法，如使用σ 1衣壳蛋白表达缺损，σ 1衣壳蛋白检测不到或无O 1衣壳蛋白 的呼肠孤病毒。该疗法可以包括用呼肠孤病毒和/或粘液瘤病毒疗法来对病人的骨髓细胞 进行间接体内治疗，或者可以包括对病人给予呼肠孤病毒和/或粘液瘤病毒疗法。在间接 体内疗法的情况下，该方法可以进一步包括对骨髓细胞给予第二次抗过度增生疗法，或者 在对患者给予病毒疗法的情况下，该方法可以进一步包括对患者给予第二次抗过度增生疗 法。第二次抗过度增生疗法可以是化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法或免疫疗法。该 方法也可以进一步包括用 ρ53、Rb、ATM、BRCAl、BRCA2、MutS、MutL、MutH, APC 或 ATBFl 的功 能或表达抑制剂进行治疗，该抑制剂如蛋白或多肽、抗体、siRNA、反义分子、核酶或小分子。 治疗也可以包括非病毒性抗过度增生疗法，如用化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法 或免疫疗法。过度增生细胞可以是恶性细胞或良性细胞。该方法可以进一步包括，在步骤 (a)之前，从病人身上获取过度增生细胞。表达的测定可以包括Northern印迹、Western印 迹、免疫组织化学、RT-PCR、微阵列分析、转录组分析、蛋白质组分析或代谢组分析。选择性 地，结构的测定可以包括测序、原位杂交、免疫组织化学或结构蛋白质组学。另外，功能的测 定可以包括评定 p53、Rb、ATM、BRCAl、BRCA2、MutS、MutL、MutH, APC 或 ATBFl 的下游靶标的 表达或活性。在另一个实施例中，提供了一种治疗病人过度增生紊乱的方法，包括(a)对过度 增生细胞给予 P53、Rb、ATM、BRCAl、BRCA2、MutS、MutL、MutH, APC 或 ATBFl 的功能或表达抑 制剂；以及(b)对过度增生细胞给予呼肠孤病毒和/或粘液瘤病毒疗法。呼肠孤病毒疗法 可以是野生型呼肠孤病毒疗法或减毒型呼肠孤病毒疗法，如σ 1衣壳蛋白表达缺损，σ 1衣 壳蛋白检测不到或无ο 1衣壳蛋白的呼肠孤病毒。治疗可以包括对病人的骨髓细胞进行间 接体内治疗，或对病人进行体内治疗。该方法可以进一步包括给予骨髓细胞第二次抗过度增生疗法，如第二次抗过度增生疗法，如化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法或免疫疗 法。过度增生细胞可以是恶性细胞或良性细胞。单词〃 a〃或〃 an"与本权利要求书和/或本说明书中的术语“包括”联合使用时， 可能指“一个”，但是也与“一个或多个”，“至少一个”，和“一个或多于一个”的意思相一致。在整个申请中，术语“about”被用于指一个数值，该数值包含用于测定数值的设 备、方法的误差而引起的固有偏差，或存在于研究对象之间的偏差。对于术语"or"，虽然公开文本支持只指二选一和“和/或”的定义，但是权利 要求书中的术语"or"的使用被用于指“和/或”，除非明确表明是只指二选一或供选择 的对象是互相排除的。在本说明书和权利要求书中使用的单词"comprising"(以及 comprising 的任何形式，如〃 comprise"禾口〃 comprises" )，“ having"(以及 having 的任何形式，如"have〃和〃 has" )，‘‘ including"(以及including的任何形式， 如〃 includes〃和"include")或"containing"(以及 containing 的任何形式， 如〃 contains"和"contain")指包括的或无限制的并且不排除额外的未列举的成分或 方法步骤。本发明的其他目的、特征和优势将通过以下详细描述来呈现。然而，需要理解的 是，在指出本发明的特定实施例时，详述和特例只作为举例说明，因为对于本领域技术人员 而言根据该详细描述对本发明的精神和领域进行各种改变和修饰是显而易见的。例证性实施例的描述癌症的发生是一个多步骤的过程，包括通过突变事件来影响正常的原癌基因和肿 瘤抑制基因从而导致致癌基因激活作用和肿瘤抑制基因失活作用的联合累积。有趣的是， 溶瘤病毒利用不同的致癌基因驱动的细胞信号通路来选择性复制和杀伤它们所感染的细 胞。除了致癌基因依赖的溶瘤作用，发明人推测一些肿瘤抑制基因在促进病毒溶瘤作用上 可能也发挥着重要作用。因此，他们测试了各种鼠和人的癌细胞系，调节其肿瘤抑制基因来 检验肿瘤抑制基因功能障碍是否会影响呼肠孤病毒和粘液瘤病毒的溶瘤作用。呼肠孤病毒 溶瘤作用的分子机理是因致力于研究呼肠孤病毒细胞受体的特征而意外得到推进的。在 1993年，有一个研究组报道不表达表皮生长因子受体(EGFRs)的两种鼠细胞系对呼肠孤病 毒感染有相应的抵抗力，然而转染了编码EGFR的基因的同样的细胞系呈现明显更高的敏 感性(Strong et al，1993)。这一结果提示呼肠孤病毒利用激活的细胞信号转导通路，该通 路是由于宿主细胞上存在有功能的EGFR而赋予的。之后，这同一批研究人员论证了对呼肠 孤病毒感染有抵抗力的NIH3T3细胞在用激活的EGFR下游因子Sos、Ras或verbB转化后会 变得敏感(Strong etal,1996 ；Strong et al，1998)。因此认为致癌基因Ras信号通路的 利用是呼肠孤病毒溶瘤作用中的关键步骤。很多人类的癌症显示出具有增强的Ras通路激活作用，这强调了该信号网络在肿 瘤发生中的有力作用，并且暗示呼肠孤病毒在多种肿瘤类型中可能发挥着广泛的溶瘤潜 能。最初的实验发现源于多种肿瘤类型的超过80%的细胞系对呼肠孤病毒介导的杀伤作用 是敏感的(Coffey et al，1998)。更有趣的是，另一种致癌基因，Myc，也有助于呼肠孤病毒 的溶瘤作用。Myc的过表达会使对呼肠孤病毒有抵抗力的细胞变得对呼肠孤病毒的侵入敏 感(Egan et al，2003)。粘液瘤病毒是一种兔特异性痘病毒，被认为是有前景的溶瘤病毒平台(参见综述Stanford and McFadden，2007)。它的宿主趋向高度受限于欧洲兔，并且它对所测试的所有 其他脊椎动物种属包括人类而言是无致病性的(McFadden，2005)。虽然其特异性有限，但是 粘液瘤病毒能感染并杀伤各种各样的人类肿瘤细胞系(Sypula et al，2004)。在很大程度 上，粘液瘤病毒在细胞水平上的趋向性是由病毒粘附和入侵的下游的细胞内事件调控的， 而不是发生在特异性宿主受体的层次上(McFadden，2005)。粘液瘤病毒溶瘤作用的分子机理的推进得益于对控制病毒入侵人类癌细胞的病 毒宿主范围因素的研究。有报道显示病毒M-T5宿主范围蛋白与细胞的Akt相互作用，这一 相互作用增强了粘液瘤病毒对人类癌细胞的溶瘤潜能(Wang et al，2006)。然而M-I^KO (敲 除)的粘液瘤病毒在一类人类癌细胞(称为II型癌细胞)中发挥出减弱的病毒溶瘤潜能， 组成型Akt激活的癌细胞仍可被M-T5K0粘液瘤病毒入侵，暗示Akt的上调对决定粘液瘤病 毒溶瘤潜能发挥着重要作用，该Akt的上调在许多癌细胞中经常发现(Wang et al，2006)。病毒溶瘤作用和肿瘤抑制基因的联系最初是通过腺病毒的研究而推进的。人类 腺病毒EIB基因编码一个55kD的蛋白，它可结合细胞肿瘤抑制蛋白p53并使其失活。有 报道显示不表达这种病毒蛋白的突变的腺病毒能在P53功能障碍的人类肿瘤细胞中复制 并将其杀伤，但不能在有P53功能的细胞中复制并将其杀伤(Bischoff et al，1996)。突 变的腺病毒溶瘤作用的根本机理在于由于P53的缺失或突变，腺病毒EIA诱导的p53依赖 的细胞凋亡在P53功能障碍的癌细胞中是受损的(Bischoffet al，1966)。然而，之后的研 究显示P53依赖的腺病毒溶瘤作用更为复杂，并且能对多种模型中的另外的通路作出应答 (0' Shea et al,2004 ；Abou et al,2004 ；Royds et al，2006)。事实上，这就指引发明人 推测P53功能障碍的癌细胞可能由于基因组不稳定性从而遭受了细胞抗病毒机制的破坏 (Carroll et al. ，1999)。由于p53对维持基因组的重要性，所以P53基因被认为是细胞基因组的守护者 (Gomez-Lazaro et al,2004 ；Vogelstein et al，2000)。由于 p53 介导的基因组维持，正 常的细胞可以保持完整的抗病毒机制。然而，P53的功能障碍会最终导致由整个基因组不 稳定性引起的病毒敏感性(通过抗病毒机制的缺失)。最近研究显示P53通过增强IFN依 赖的抗病毒活性可有助于固有的免疫性而不依赖于其预细胞凋亡和肿瘤抑制基因的功能 (Takaoka et al，2003 ；Munoz-Fontela et al，2008)。p53 的转录作用对在病毒感染时 IFN 通路的激活是重要的。在病毒攻击时，P53可以激活IFN调控因子9的转录(Munoz-Fontela et al，2008)。此外，当p53的表达在癌细胞中减少时可观察到病毒复制水平的极大提高 (Dharel et al，2008)。这些发现证明了 p53的重要的抗病毒活性。这在其他对DNA复制 和基因组稳定性重要的肿瘤抑制基因的案例中也是可能存在的。发明人在此说明，除了由 特定的致癌基因信号通路激活引起的可能增强的敏感性外，p53、ATM或Rb功能障碍的癌细 胞对呼肠孤病毒和粘液瘤病毒的攻击均变得更加敏感，这可能有助于描述不同的溶瘤病毒 如何区分正常细胞和癌细胞。这些遗传失常和溶瘤病毒敏感性之间联系的鉴定大大增强了 溶瘤病毒疗法的应用潜能。I.溶瘤病毒A.呼肠孤病毒呼肠孤病毒(Reoviridae)包含天然存在的无包膜病毒家族，其含有双链 RNA(dsRNA)基因组，该基因组被分成10条片段并且被两个同心二十面体蛋白衣壳包围。这些病毒会影响胃肠系统和呼吸道。呼肠孤病毒的名称来源于“呼吸道肠道孤儿病毒”。术语 “孤儿”病毒指与任何已知疾病均无联系的病毒。尽管呼肠孤病毒家族已于最近被鉴定出与 多种疾病有关，但是这一原始名称仍被使用。呼肠孤病毒的感染在人类身上经常发生，但是大部分的病例是温和的或临床症状 不明显。该病毒可以很容易在粪便中被检测出来，并且也可以从咽或鼻分泌物、尿液、脑脊 髓液和血液获取。尽管在临床样本中很容易发现呼肠孤病毒，但是它们在人类疾病或治疗 方面的作用仍是不确定的。呼肠孤病毒无包膜并且有一个由外层和内层蛋白层组成的二十 面体衣壳(T-U)。呼肠孤病毒科的病毒基因组包含10-12条片段，根据它们的大小将这些 片段分为三类L(大)，M(中)和S (小)。片段范围约为3. 9-lkB,每条片段编码1-3个蛋 白。根据其翻译源自的片段，呼肠孤病毒蛋白用其相应的希腊字符来表示(L片段编码λ 蛋白，M片段编码μ蛋白以及S片段编码σ蛋白)。由于这些病毒拥有dsRNA基因组，因此复制仅发生于细胞质，并且该病毒编码对 dsRNA基因组复制与转化成(+)_RNA所必需的多个蛋白。病毒可以通过细胞表面受体进入 宿主细胞。受体是未知的但是被认为包含唾液酸和连接黏附分子(JAMs)。病毒在内吞溶 酶体中会被蛋白酶部分解除包被，于此处衣壳被部分消化从而可以进一步进入细胞。然后 核心颗粒通过目前未知的过程进入细胞质，在该过程中基因组被保守转录从而产生过量的 (+)义链，该(+)义链被用作mRNA模板来合成(-)义链。病毒颗粒在感染6-7个小时后开 始在细胞质中组装。有传染性的哺乳动物呼肠孤病毒颗粒以直径大约为85nm的颗粒存在。病毒 颗粒的外层衣壳包含几种不同的蛋白，其中sigma-1 ( ο l，50kD)通过分散的糖类结合 (Chappell et al, 1997 ；Chappell et al,2000 ；Connolly et al，2001)和病毒颗粒锚定 (Mah et al, 1990 ；Fernandes et al, 1994 ；Lee et al, 1994)结构域介导病毒粘附到宿 主细胞表面(Lee et al, 1981 ；Duncan et al, 1991 ；Nagata et al, 1987 ；Turner et al, 1992)。σ 1是双顺反子呼肠孤病毒Sl基因的产物，该基因也通过应用截然不同的但是重叠 的阅读框编码非结构蛋白(Ernst et al, 1985 Jacobs et al, 1985 ；Sarkar et al, 1985) 据报道缺失σ 1的呼肠孤病毒颗粒是无传染性的(Larson et al，1994)。呼肠孤病毒Sl 基因被认为在决定呼肠孤病毒致病性上发挥着重要作用(Haller et al,1995 ；Wilson et al, 1994 ；Kaye et al,1986 ；Werner et al.，1980)。i.野生型呼肠孤病毒在癌症治疗中的应用关于野生型呼肠孤病毒在癌症治疗中的生产和应用的一些方法已经有所描述 (例如，美国专禾U 7，300，650，7，163，678，7，049，127，7，014，847，6，994，858，6，811，775， 6，703，232,6，576，234,6，565，831,6，528，305,6，455，038,6，344，195,6，261，555, 6，136,307，和 6，110,461，以及美国专利公开文本 2006/0165724，2006/0073166， 2005/0123513,2004/0265271,2004/0126869,2004/0109878,2002/0037543, 2006/0029598, 2005/0026289, 2002/0006398 与 2001/0048919，每项专利都无放弃权利地 全部引入作为参考)。ii.减毒型呼肠孤病毒在癌症治疗中的应用然而，在免疫缺损宿主如新生的和SCID (重症联合免疫缺陷)动物中，野生型呼肠 孤病毒尤其在神经组织和心肌组织中发挥着重要的病毒致病功能(Sabin，1959 ；Weiner etal,1977 ；Baty et al,1993 ；Loken et al，2004)。在一些案例中，甚至在免疫活性宿主，包 括人类中，野生型呼肠孤病毒与病毒致病性相关(Terheggen et al, 2003,Hirasawa et al, 2003)。因此，尤其在免疫受损或非常年幼的宿主中，野生型呼肠孤病毒并不总是以良性的 方式起作用。例如，在免疫受损的宿主如非常年幼的或免疫缺陷的成年的动物中，该病毒也 呈现可感染一些健康组织如心脏、肝脏、胰腺和神经结构。这一重要的内容可以进一步适用 于进行大量放射线/化学疗法的癌症病人，因为这些癌症病人会遭受免疫抑制。因此，明确 需要开发毒性更弱的呼肠孤病毒用于病毒溶瘤疗法。此外，在众多场合中野生型呼肠孤病毒拥有不合需求的毒性和传染性，这会限制 它们在体外的潜在应用。特别地，将细胞培养物(例如，源自癌症病人的骨髓移植物)暴露 于野生型呼肠孤病毒中会导致不合需求的杀伤细胞如干细胞的副作用，干细胞对于某一用 途是必需的，如恢复癌症病人的免疫系统。因此，野生型呼肠孤病毒的增强的毒性极大地限 制了其体外应用的临床潜力，该体外应用涉及将细胞暴露于呼肠孤病毒中。这里所描述的减毒型呼肠孤病毒缺少可检测到的全长σ 1衣壳蛋白，然而意外地 具有传染性。在病毒复制性感染的最初步骤中，呼肠孤病毒通过细胞表面唾液酸残基结合 并粘附于细胞上的过程涉及到 σ (Lee et a/. , 1981 ；Duncan et a/. , 1991 ；Nagata et al,1987 ；Turner etal,1992 ；Chappell et al, 1997 ；Chappell et al,2000 ；Connolly et al，2001)。尽管缺少全长ο 1，这里所描述的减毒型呼肠孤病毒可以进入宿主细胞并进行溶 细胞的病毒复制。此外，相比于天然存在的非减毒型呼肠孤病毒对非恶性细胞所呈现的致 细胞病变效应的水平而言，减毒型呼肠孤病毒呈现意外的特性，它可引起对非恶性细胞一 种或多种致细胞病变效应水平的降低(亦即，统计学意义上的降低)。据此以及以下所描述 的更多细节，这里所提供的减毒型呼肠孤病毒改进了现有技术的呼肠孤病毒，包括适宜用 作不带有不符合需求的副作用的溶瘤试剂，例如对正常(例如，非恶性)细胞的向性和溶解 的副作用。特别地，该减毒型呼肠孤病毒可被用于体外选择性杀伤癌或瘤细胞。在特定的实施例中，如于2006年8月5日提交的美国申请60/704，604和于2006 年7月31日提交的国际专利申请号PCT/US2006/(^9881中所描述的减毒型呼肠孤病毒可 用于本发明，这些专利申请在此无放弃权利地全部弓丨入作为参考。在特定的实施例中，减毒 型呼肠孤病毒可能缺少野生型呼肠孤病毒Sl基因。减毒型呼肠孤病毒可能含有Sl基因， 该Sl基因产生减少的和/或不可检测到的Sl基因产物(ol)量或截短的、突变的和/或 功能障碍的σ 1。减毒型呼肠孤病毒可能含有Sl基因，与野生型Sl基因相比，该Sl基因包 含一个或多个突变，其中的突变是核苷酸置换、核苷酸缺失或核苷酸插入。这里所描述的“减毒型”呼肠孤病毒包括对宿主细胞或在宿主细胞中其传染、复制 和/或细胞溶解特性呈现改变的(亦即，统计学意义方式上的增强或降低)的呼肠孤病毒， 这是相对于已知的天然存在的或野生型的呼肠孤病毒的一个或多个这类特性而言的。在特 定的实施例中，相对于野生型呼肠孤病毒而言，减毒型呼肠孤病毒将呈现降低的传染性、复 制能力和/或溶解细胞的潜能。这类改变的特性的例子包括病毒致细胞病变效应的多种表 现形式，例如，对特定宿主细胞8产生感染所需要的感染复数(Μ0Ι，感染每个细胞的病毒颗 粒的平均数)，病毒感染引起的宿主细胞溶解的程度(进一步包括凋亡和/或坏死)，在溶 解细胞的病毒复制之后从有效感染的宿主细胞释放病毒的滴度，以及熟悉本领域的技术人 员可以用于决定病毒对宿主细胞的活性的其他参数。上述这类改变的特性可用于鉴别目前公开的减弱型呼肠孤病毒。致细胞病变效应的其他标记包括宿主细胞形态学的改变，宿主 细胞介导的免疫系统引发攻击的能力的改变，细胞粘附(粘附于底物如细胞外基质蛋白或 半固体培养基，或粘附于其他细胞)的改变，一个或多个细胞基因表达水平的改变，宿主细 胞复制能力的改变，和/或细胞代谢活性的其他改变。考虑到呼肠孤病毒的Sl基因片段是与呼肠孤病毒的毒性密切相关的(Weiner et al，1977 ；Weiner et al，1980 ；Mann et al，2002)，发明人令人惊讶地从持续感染呼肠孤病 毒的培养的细胞中分离出Sl减毒型呼肠孤病毒(“AV呼肠孤病毒")(Kim et al，2007)。 减毒型呼肠孤病毒毒株在免疫缺陷的动物模型中呈现出极大减弱的病毒致病性而不损害 它在体内的病毒溶瘤作用。由于已知野生型呼肠孤病毒是通过延迟发育和抑制囊胚泡的形 成来对大鼠和鼠类的胚胎发育(Priscott,1983 ；Heggie et al，1979)产生负面影响的，因 此发明人进一步评估了 AV呼肠孤病毒对干细胞的致病性。这样，发明人比较了野生型和AV 呼肠孤病毒对胚胎干细胞(ESCs)的致病性。如以下所述的实施例所示，野生型呼肠孤病毒 可在体外轻易地感染ESCs并且在畸胎瘤模型中极大地抑制了干细胞的发育，然而AV呼肠 孤病毒在体外极微弱地感染ESCs并且在畸胎瘤模型中不影响干细胞的发育。在不同的实施例中，减毒型呼肠孤病毒可能包含一个或多个其他的突变。例如，在 特定的另一个实施例中，减毒型呼肠孤病毒可能缺少野生型的呼肠孤病毒S4基因。呼肠孤 病毒野生型S4基因编码呼肠孤病毒衣壳σ 3多肽，该多肽在呼肠孤病毒复制感染宿主细胞 时与病毒颗粒的加工有关(例如，Ahmed et al,1982 ；Giantini et al，1984)。减毒型呼肠孤病毒可能包含有复制能力的呼肠孤病毒颗粒。此外，减毒型呼肠孤 病毒可能含有Sl基因和/或S4基因的可遗传性突变(例如，置换、插入、缺失)。野生型呼 肠孤病毒的Sl基因对本领域的技术人员来说是熟知的。例如，野生型呼肠孤病毒的Sl基 因序列包括主要以由感染患者的呼吸或肠组织中分离出来的天然存在的呼肠孤病毒形式 鉴定出来的Si基因序列，或源自此类序列的保守序列。已经鉴定出一些呼肠孤病毒的Sl 基因序列，包括人类呼肠孤病毒的Sl基因序列(例如，人类呼肠孤病毒Sl基因序列的基因 库编号人类3型呼肠孤病毒Sl =XOl 161 ；人类2型呼肠孤病毒Sl :M35964 ；人类1型呼 肠孤病毒Sl :M35963)，该Sl基因序列包括编码σ 1蛋白的多核苷酸序列以及编码σ 1蛋 白自身的氨基酸序列(例如，主要的人类呼肠孤病毒血清型Sl基因序列的基因库编号人 类1型呼肠孤病毒毒株Lang(TlL)编号Μ35963 ；人类2型呼肠孤病毒毒株Jones (T2J)编 号M35964 ；人类3型呼肠孤病毒毒株Dearing (T3D)编号161 ’人类3型呼肠孤病毒毒 株 Abney (T3A)编号 L37677)。依照特定的实施例，提供了一种减毒型呼肠孤病毒，其包含的呼肠孤病毒基因组 缺少野生型呼肠孤病毒Sl基因，或含有突变的不能编码完整的呼肠孤病毒σ 1衣壳蛋白的 呼肠孤病毒Sl基因(人类呼肠孤病毒Sl基因序列的基因库编号人类3型呼肠孤病毒Sl XOl 161 ；人类2型呼肠孤病毒Sl :Μ35964 ；人类1型呼肠孤病毒Sl :Μ35963)。根据本公开 以及如本领域所知，按照例如Ausubel et al. (1989) ；Ausubel et al (1993) ；Sambrook et al(1989) ；Maniatis et al. (1982) ；Glover (1985) ；Hames and Higgins (1985)以及其他 地方中所描述的技术，通过测定呼肠孤病毒Sl基因的序列来鉴定变异的Sl基因是否存在 的方法学是显而易见的。因此突变的Sl基因指含有一种多核苷酸序列的Sl基因，该多核 苷酸序列通过一个或多个核苷酸置换、核苷酸插入和核苷酸缺失改变相应的S 1野生型核苷酸序列或保守序列的一个或多个核苷酸序列位点，这是可以被轻易地鉴定出来的。Hoyt etal. (2005)公开了编码ο 1蛋白的鼠类呼肠孤病毒Sl基因序列的多个突变，根据这里本 发明所描述的特定实施例，明确不包括Hoyt et al.的突变。如这里所描述的和本领域已知的，呼肠孤病毒的外层衣壳σ 1蛋白可以根据它的 生物化学和/或免疫化学特性而被容易地检测出来(例如，Mah et al,1990 ；Leone et al, 1991 ；Chappell et al，1997)，一般是通过应用一种或多种技术，包括免疫检测(例如，σ 1 特异性免疫沉淀反应、western免疫印迹分析、免疫亲和层析、免疫荧光染色、免疫细胞荧光 定量、放射性同位素标记的呼肠孤病毒多肽的电泳，等等)，血凝反应，和/或相关方法学来 进行检测。根据已建立起的这些和其它检测呼肠孤病毒Ol蛋白的方法，并且鉴于这里的 讨论，熟悉本领域的技术人员将领会到什么是检测ο 1蛋白的本领域公认的标准和现有技 术水平的灵敏度，这样，缺少“可检测到的”呼肠孤病毒ο 1衣壳蛋白的有复制能力的呼肠 孤病毒颗粒将被认为包含此类呼肠孤病毒，当应用目前传统的技术来检测假定存在的ο 1 蛋白时该呼肠孤病毒完整的σ 1蛋白不能被检测出来。在此引入描述这类减毒型呼肠孤病毒的US 11/997，537作为参考。iii.呼肠孤病毒感染的控制在特定的实施例中，可将肽基氟代甲基酮(PFMKs)应用于细胞组合物中，用于抑 制或去除组合物中的呼肠孤病毒。在审的美国临时申请序号60/906，706，在此将其全部内 容引入作为参考，描述了肽基氟代甲基酮(PFMKs)用于抑制病毒复制，在此无放弃权利地 全部引入作为参考。iv.呼肠孤病毒的生产根据这里公开的特定的实施例，呼肠孤病毒可以是任何来源的呼肠孤病毒，它属 于呼肠孤病毒科家族的一个成员，并且包括含有各种趋向性的呼肠孤病毒以及可由各种来 源获得的呼肠孤病毒(Tyler andFields, 1996) 0在特定的实施例中，展望了哺乳动物呼肠 孤病毒和人类呼肠孤病毒，虽然本发明并不意味受到如此的限制，并且基于本公开文本，技 术人员可以辨别任何一种特定的呼肠孤病毒可适用于该目的的情况。在特定的实施例中， 呼肠孤病毒可以是人类3型(Dearing)U型(Lang)、2型(Jones)或3型(Abney)呼肠孤 病毒，而在其他特定的实施例中，呼肠孤病毒可以源自一个或多个对其他哺乳动物种属细 胞呈现趋向性的呼肠孤病毒，包括对非人类的灵长类动物(例如，黑猩猩、大猩猩、短尾猿、 猴子等等)，啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠、兔子、豚鼠等等)，狗，猫，常见家畜 (例如，牛、马、猪、羊等等)，或者，可以使用含有特异性趋向的呼肠孤病毒(例如，鸟类呼肠 孤病毒)。如这里所描述的，特定的实施例涉及施行体外持续感染法后可恢复的减毒型呼肠 孤病毒，但是也可考虑根据其他方法学获得的减毒型呼肠孤病毒，包括体内持续感染法，根 据分子生物学方法产生和鉴定σ 1缺陷和/或ο 1缺损的突变体(在特定的实施例中，另 外或选择性地，也包括σ 3缺陷和/或σ 3缺损的突变体的产生和鉴定)，以及还包括分离 天然存在的σ 1缺陷和/或σ 1缺损的突变体和/或ο 3突变体，和/或通过化学、物理学 和/或遗传学技术(例如，在有效感染的宿主细胞中配对重组呼肠孤病毒基因)人工诱导 此类ο 1(和/或0 3)突变体。此外，发明人期望导致所需的减毒表现型的突变可以在其他基因中发现，这些基因影响病毒的传染性、复制或包装能力，包括在病毒上编码的任一基因或其组合，如呼肠孤 病毒的10条基因片段。例如，与呼肠孤病毒野生型基因相比，呼肠孤病毒Sl或S4基因的 突变可以与呼肠孤病毒10条基因片段上的1，2，3，4，5或更多个突变联合。可以使用多种 方法来产生减毒型呼肠孤病毒，包括例如美国申请60/704，604中所描述的方法。B.粘液瘤病毒粘液瘤病毒是一种痘病毒并且含有大的双链DNA基因组，该基因组允许有可能插 入大的(251Λ)与治疗相关的真核基因。粘液瘤病毒是兔特异性病毒并且会导致欧洲兔 (Oryctalagus cuniculus)的致命性疾病，称为粘液瘤病。它的种属选择性非常有限以致于 它在1950年代被用于控制澳大利亚灾难性的野兔种群。重要的是，它对测试的其他脊椎动 物种属，包括人类而言是非致病性的，虽然它能在体外有效感染特定的非兔子细胞，包括体 外的永恒的幼猴肾成纤维细胞(BGMK)、IFN应答遗传性缺陷的原代鼠细胞和一些不同的人 类肿瘤细胞。众所周知癌细胞在它们的IFN应答中是有缺陷的。最近，有报道显示粘液瘤 病毒是一种在体外和体内抗实验性神经胶质瘤，以及在间接体内抗人类恶性神经胶质瘤外 科样本的溶瘤试剂(Lun et al，2005 ；2007 ；Stanford et al，2008)。它可以感染并杀伤人 类神经胶质瘤细胞，经大脑注射是安全的，并且经大脑注射在同位的人类恶性神经胶质瘤 模型中可“治愈”小鼠。此外，它可感染并杀伤直接源自神经胶质瘤外科样本的所测试的所 有原发性神经胶质瘤细胞，并且它的溶瘤作用可通过雷帕霉素增强。粘液瘤病毒，如同用其他溶瘤病毒如呼肠孤病毒一样，需要跨过存在于正常健康 细胞中的抗病毒防御系统来使其能在细胞中复制。粘液瘤病毒和其他溶瘤病毒诱导干扰素 的产生，并且对IFN通路的抗病毒作用通常是敏感的。由IFN抗病毒应答产生并主要影响 病毒繁殖的相关蛋白包括H(R、OAS合成酶和核糖核酸酶L核酸酶。PKR激活eIF2 α，导致 翻译的抑制和诱导细胞凋亡。在正常细胞中，粘液瘤病毒直接受PKR和eIF2 α的影响。抗病毒应答通路通常在癌细胞中被破坏。例如，IFN应答减弱或缺损是遗传性 缺损，其在转化和肿瘤发展的过程中经常发生。超过80%的肿瘤细胞系对干扰素不应答 或呈现削弱的应答(Stojdl et al，2003 and references cited therein ；Wong et al, 1997 ；Sun et al, 1998 ；Matin et al,2001 ；Balachandran et al，2004)。美国专利申请 2006/(^63333(引入作为参考)描述了粘液瘤病毒感染并杀伤癌细胞，包括人类肿瘤细胞 的用途，在此将其全部内容引入作为参考。II.肿瘤抑制因子肿瘤抑制基因是保护细胞不向癌症发展的基因。当该基因受损时，细胞会向癌症 发展，通常是在它遭受其他因素的影响之后。与致癌基因不同的是，肿瘤抑制基因通常遵循 “二次突变假设”，暗示着在作用显现之前，编码特定基因的等位基因必须均受影响。这是由 于如果该基因只有一个等位基因受损，那么第二个仍可以产生正确的蛋白。换一种说法，与 致癌基因通常是必要但不充分的相反，肿瘤抑制因子通常是必要且充分的。当然，也有需要 注意的例外，例如P53基因产物，相对于正常p53蛋白而言，它可以以显性失活的突变形式 存在，因此其在这样的案例中也是必要但不充分的。肿瘤抑制基因，或更精确地说是它们所编码的蛋白，对细胞周期的调控或促进细 胞凋亡，有时对两者均有阻止或抑制作用。肿瘤抑制因子蛋白的功能分为多种，包括如下所 述的(a)抑制维持细胞周期所必需的基因(如果这些基因不表达，细胞周期将不能继续，从而有效抑制细胞分裂)；(b)将细胞周期与DNA受损联系起来。只要受损DNA存在于细胞 中，细胞就不应该分裂(如果受损可以被修复，细胞周期就可以继续)；(c)诱导细胞凋亡， 或程序性细胞死亡，如果上述受损不能被修复，那么为了使生物体更好就消除它所产生的 威胁；以及(d)与细胞粘附有关的一些蛋白防止肿瘤细胞扩散，阻止接触抑制的损失，以及 抑制转移(被称为转移抑制因子的蛋白)。相反地，致癌基因是引起癌症的基因。许多细胞是正常地死亡的。在癌症中，由于 存在突变的致癌基因DNA序列，那些细胞可存活并增殖。大部分的致癌基因需要另一个步 骤来诱发癌症，如另一个基因的突变，或环境因素如病毒感染。自从1980年代以来，在人类 癌症中鉴定出很多的致癌基因。原癌基因是正常的基因，由于突变或表达量增加，它会变成 致癌基因。原癌基因编码的蛋白帮助调控细胞生长和分化。原癌基因一般通过它们的蛋白 产物而通常与信号传导和有丝分裂信号的执行有关。当激活后，原癌基因(或其产物)变 成肿瘤诱发因子即致癌基因。原癌基因的例子包括RAS、WNT、MYC、ERK和TRK。Α. p53p53(编号匪000M6)是一个转录因子，它调控细胞周期并起着肿瘤抑制因子的 作用。它在多细胞生物体内是重要的，因为它在某种程度上通过调节细胞对DNA损伤应答 的功能来帮助抑制癌症。论及P53通过防止基因组突变来保持稳定性的功能，它曾被描述 为“基因组的守护者”，“守护天使基因”，或“守卫大师”。p53的名称与它在SDS-PAGE上的表观分子量有关，但是事实上它实际只有 43. 7kD。这一不同是由于p53蛋白中的大量的氨基酸脯氨酸残基会使p53在SDS-PAGE上的 迁移变慢，因此使它看起来更大。这一结果可以在各种种属的P53中观察到，包括人类、啮 齿类动物、青蛙和鱼。该基因位于人染色体17(17pl3. 1)上，并且编码393位氨基酸蛋白， 包含5个区域(a) N末端转录激活区(TAD)，可以激活转录因子(1_42位残基)；(b)对p53 的凋亡活动起重要作用的富含脯氨酸区(80-94位残基)；中心的DNA结合核心区(DBD)， 包含一个锌原子和多个精氨酸氨基酸(100-300位残基)；同寡聚化区(OD) (307-355位残 基)；以及与中心区的DNA结合能力的下调有关的C末端(356-393位残基)。在癌症中使p53失活的突变通常发生在DBD区。大多数这些突变破坏了蛋白结合 其目标DNA序列的能力，并且因此妨碍了这些基因的转录活性。就此而论，DBD区的突变是 退行性的功能缺失的突变。在OD区突变的p53分子与野生型的p53 二聚化，并且阻止它们 激活转录。因此OD区的突变对p53的功能具有显著的负效应。p53有很多抗癌机制。例如，当DNA持续受损时它能激活DNA修复蛋白。在识别 DNA损伤时它也能使细胞周期保持在G1/S调控点(如果它将细胞保持在此处足够长的时 间，DNA修复蛋白就能有时间修复损伤并且允许该细胞继续进行细胞周期)。如果DNA损伤 证明是不可修复时，它也能诱发细胞凋亡，即程序性细胞死亡。p53在对各种类型应激的应答中被激活，这些应激包括但不限于DNA损伤(由UV， 顶或化学试剂如过氧化氢引发的)、氧化应激、渗压休克、核糖核苷酸损耗和失控的致癌基 因表达。这一激活由两个主要事件表明。第一，P53蛋白的半衰期急剧提高，导致在受应激 的细胞中P53的快速积累。第二，构象的变化促使p53在这些细胞中行使作为转录调节因 子的活性作用。导致P53激活的关键事件是它的N末端区域的磷酸化。N末端转录激活区 包含大量的磷酸化位点并且可被认为是蛋白激酶传导应激信号的主要靶标。
已知的锚定p53转录激活区的蛋白激酶可以大致分为两种。第一种蛋白激酶属于 MAPK家族(JNK1-3，ERK1-2，p38MAPK)，已知其可应答多种应激，如膜损伤、氧化应激、渗压 休克、热休克等等。第二种蛋白激酶(ATR，ATM, Chkl, Chk2，DNA-PK, CAK)包含于基因组完 整性检查点中，即一种分子级联系统，该系统可检测和应答由遗传毒性应激引起的多种类 型的DNA损伤。在无应激的细胞中，通过p53的持续降解使p53保持低水平。称为Mdm2的蛋白结 合于P53并且将其从细胞核转运到细胞质从而使其被蛋白酶体降解。由上述提及的蛋白激 酶引起的P53的N末端的磷酸化破坏了 Mdm2的结合。然后其他蛋白如Pinl被募集到p53 上并且引起P53构象变化，这就更加阻止了 Mdm2的结合。转录共激活因子如p300或PCAF 然后使P53的羧基末端乙酰化，从而暴露出p53的DNA结合区，使其激活或抑制特定基因。B. Rb视网膜神经胶质瘤蛋白(Rb ；NM_00321)是一种肿瘤抑制因子蛋白，其被发现在多 种癌症中是功能障碍的。PRb如此命名是因为当编码该蛋白的RBl基因的两个等位基因均 突变从而使该蛋白失活时会引发视网膜神经胶质瘤。Rb通常作为磷酸蛋白存在于细胞中并 且它是如下所描述的多种激酶的磷酸化靶标。Rb的一种被深入研究的功能是阻止细胞分裂 或推进细胞周期。因此，当Rb的该功能失效时，突变的细胞就会继续分裂并且可能发展为 癌症。Rb是“ 口袋蛋白家族”的一员，因为它含有一个蛋白可结合的口袋。例如那些被高 风险型人类乳头状瘤病毒感染的细胞所产生的致癌基因蛋白可以结合Rb并使其失活，从 而可以引发癌症。Rb通过阻止推进细胞周期进入到S期，或合成期，或推进Gl或第一间隙 期从而阻止细胞复制受损DNA。Rb结合并抑制E2F家族转录因子。E2F转录因子是一个E2F 蛋白和一个DP蛋白的双体。转录激活复合物E2启动子结合蛋白二聚化分子伴侣(E2F-DP) 可以推进细胞进入S期。一旦E2F-DP失活，细胞就会保持停留在Gl期。当Rb结合于E2F， 该复合物就会作为生长抑制因子而起作用并且阻止推进细胞周期。Rb-E2F/DP复合物也能 吸引组蛋白脱乙酰酶(HDAC)蛋白到染色质上，从而进一步抑制DNA合成。在亚磷酸化状态时，Rb是激活的并且作为肿瘤抑制因子通过抑制细胞周期进程而 发挥作用。磷酸化会使Rb失活。当磷酸酶将Rb的一个残基去磷酸化时，Rb会在接近Gl末 期时被激活，从而可以结合E2F。当细胞到了要进入S期时，周期蛋白依赖性激酶(CDK)和周 期蛋白的复合物会将PRb磷酸化，从而抑制它的活性。最初的磷酸化是由Cyclin D/CDK4， 6执行，之后由Cyclin E/⑶K2进一步磷酸化。pRb保持磷酸化状态贯穿S、G2和M期。pRb 的磷酸化使E2F-DP从pRb上解离下来并且变得有活性。当E2F被释放时，它会激活例如周 期蛋白等因子(例如，Cyclin E和A)，从而通过激活周期蛋白依赖性激酶和一种称为增殖 性细胞核抗原或PCNA的分子推进细胞通过细胞周期，PCNA分子可通过帮助聚合酶结合于 DNA从而加速DNA复制和修复。C. ATM共济失调毛细血管扩张(AT ；NM_00051)是由位于染色体llq22_23上的ATM基因 突变引起的常染色体退行性紊乱。它是在1995年6月鉴定的，并且由分布于1501Λ基因 组DNA上的66个外显子组成。它编码131Λ的有9168个核苷酸开放阅读框的成熟转录物。 ATM蛋白约为370kDa，是遍在表达的并且位于细胞核。ATM蛋白是一种大的丝氨酸-苏氨酸激酶，其被认为在调控细胞周期检查点、双链DNA修复和减数分裂上发挥作用(与BRCA基 因相似)。同样已知ATM在调控p53、BRCAl和CHEK2上发挥作用。已知ATM在DNA修复上 的一部分作用是端粒修复，因为在受AT侵害的病人中端粒降解会更迅速。ATM基因的突变被认为可分为两种(a)无义突变，其可引起蛋白功能完全丧失并 且由此以退行性方式遗传以及诱发AT ；以及(b) ‘错义’突变，其可产生功能减弱的稳定的 全长的蛋白，例如，置换、阅读框内短的插入以及缺失，等等。这些突变会显著干扰蛋白的正 常拷贝。大部分AT受害者，65-70%，带有截短突变，其外显子跳跃突变尤其普遍。这就导 致ATM蛋白水平非常低或不可检测到。错义突变是在乳腺癌携带者中发现的最常见的突变 类型。带两个错义突变的个体被认为含轻微状态的AT，这是会引发减毒型AT的案例。D.其他肿瘤抑制因子多种其他肿瘤抑制因子例如p53，ATM和Rb可以用于本发明。例如BRCAl和BRCA2 在乳腺癌的发生中发挥着关键作用。BRCAl是维持基因组完整性从而阻止增殖失控的人类 基因。多因子的BRCAl蛋白产物参与DNA损伤修复、遍在蛋白化、转录调控以及其他功能。 该基因的变异涉及多种遗传性癌症，即乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。BRCAl基因位于染色体 17的长(q)臂21位上，从38，449，843位碱基对到38，530，933碱基对(图谱)。BRCAl蛋 白直接参与受损DNA的修复。虽然它的准确功能并不清楚，但是BRCAl蛋白被认为在DNA 双链断裂修复时与RAD51相互作用。这类断裂可以由自然射线或其他照射引起，但是在进 行特殊类型的细胞分裂产生精子和卵子(减数分裂)的期间，当染色体交换遗传物质时，这 类断裂也可以发生。通过影响DNA损伤修复，该蛋白在维持人类基因组稳定上发挥作用。BRCA2是参与染色体损伤修复的第二种人类基因。虽然BRCAl和BRCA2基因的结 构是非常不同的，但是它们的功能看来是相似的。两种基因产生的蛋白对修复受损的DNA 是必需的。BRCA2蛋白结合并调节RAD51基因产生的蛋白从而修复DNA的断裂。这类断裂 可以由自然和医疗射线或其他环境照射引起，但是在进行特殊类型的细胞分裂产生精子和 卵子(减数分裂)的期间，当染色体交换遗传物质时，这类断裂也可以发生。BRCAl蛋白也 与RAD51蛋白相互作用。通过修复DNA，这三种蛋白在维持人类基因组稳定上发挥作用。与 BRCAl 一样，BRCA2可能调节其他基因的活性并且在胚胎发育中发挥关键作用。BRCA2基因 位于染色体13的长(q)臂12. 3位(13ql2. 3)上，从31，787，616位碱基对到31，871，804 碱基对。MutS是帮助修复双链DNA中的错配的家族或蛋白的先导成员。这一过程的第一步 是识别错配的DNA。在大肠杆菌中，MutS结合于双链DNA的错配位点，与MutL和MutH蛋白 配合，在该位点锚定DNA链中一条链的某片段以将其切除。其他蛋白完成修复进程锚定的 DNA片段被切除和降解，使用互补链作为模板合成补片，并且将补片连接入位产生不带错配 的修复的双链DNA片段。很多的兴趣集中于人源的MutS同源物，因为一些这样的缺陷是形 成某些形式的遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)和其他可能的结直肠癌的原因。腺瘤性结肠息肉病(APC)是另一种涉及结直肠癌的肿瘤抑制因子。它帮助控制细 胞分裂的频率、在组织内如何粘附于其他细胞或细胞是否迁入或离开组织，并且它也帮助 确定在细胞分裂过程中产生的细胞内的染色体数是否正确。APC蛋白主要通过与其他蛋白 的结合来完成这些任务，尤其是那些涉及细胞粘附和发出信号的蛋白。一种蛋白的活性，尤 其是β连环蛋白的活性是由APC蛋白控制的，其是Wnt信号通路的一部分。β连环蛋白的调控阻止刺激细胞分裂的基因被过度频繁开启并且阻止细胞过度生长。APC位于染色体5 的长(q)臂21位和22位之间，从112，118，468位碱基对到112，209，532碱基对。AT结合转录因子1或ATBFl是一种肿瘤抑制因子，它的缺失涉及胃癌的发生。它 位于16q22.3_q23. 1。其DNA全长是32kB。根据选择性启动子的使用和选择的剪接， 有两种同源异构体，ATBFl-A和ATBF1-B。该蛋白有3703个氨基酸，大小为404kDa。它包 含4个发育同源结构域以及包括一个拟锌指基序在内的23个锌指结构，一个DEAD和一个 DEAH盒，一个RNA和一个ATP结合位点，两个大RS结构域和多个磷酸化位点。该蛋白位于 细胞核并且作为转录因子而起作用，它结合于AFP基因的增强子元件的AT富集的核心序列 上并且下调AFP基因的表达，可能涉及神经元分化。在早期神经嵴源细胞系SJNB-12中以 染色体外双微体形式与myc非同线共扩增。在α胎蛋白表达的胃癌细胞系中可以观察到 ATBFl缺乏表达。ATBFl表达的缺乏不是由于突变、删除或易位，而是由于转录水平的强烈 抑制。III.测定肿瘤抑制因子的结构、表达或功能Α.基于核酸的诊断本发明的一个实施例包括检测肿瘤抑制因子表达异常的方法。这可以包括测定肿 瘤抑制因子的水平或测定表达产物的特殊变化。所用的核酸是根据常规方法学由癌细胞中 分离得到的(Sambrook et al，1989)。核酸可以是基因组DNA或片段化的或全细胞RNA。一 旦使用RNA，就可能需要将RNA转换成互补的DNA。在一个实施例中，RNA是全细胞RNA ；在 另一个实施例中，它是poly-A (聚腺嘌呤)RNA。通常，核酸是被扩增的核酸。根据程式，应用扩增或扩增后用第二种已知的核酸直接鉴定样本中待测的特定核 酸。然后，检测所鉴定的产物。在特定的申请中，可以通过可视的方法进行检测(例如，溴 化乙锭染色的凝胶)。选择性地，该检测可以包含通过化学发光、放射性同位素标记的放 射性闪烁扫描法或荧光标记，或甚至通过使用电或热刺激信号系统进行间接的产物鉴定 (Affymax Technology ；Bellus，1994)。在一个实施例中，肿瘤抑制因子表达量是通过测定mRNA的量来测量的。然而通过 检测多种类型的结构缺损，也可以鉴定出活性的改变。这些缺损包括删除、插入、点突变和 重叠。点突变会导致终止密码子、移码突变或氨基酸置换。体细胞突变是那些发生于非生 殖细胞系组织的突变并且是不可遗传的，然而生殖细胞系组织突变是可遗传的。在编码区 内或外的突变也可以通过改变该基因的转录作用，或者改变转录物(mRNA)或蛋白的加工 来影响肿瘤抑制因子产生的量。当肿瘤抑制因子的一个等位基因由于生殖细胞系的遗传或体细胞突变的产生而 失活时，细胞将执行遗传进程向致癌性转变。基因的另一个等位基因的失活通常包括导致 杂合缺失(LOH)的体细胞微突变或染色体等位基因删除。选择性地，肿瘤抑制基因的两个 拷贝均会通过纯合缺失而丧失。基于这点，考虑进行多种不同的测定，包括但不限于，荧光原位杂交(FISH)、直接 DNA测序、PFGE分析、Southern或Northern印迹、单链构象分析(SSCA)、核糖核酸酶保护分 析、等位基因特异性寡核苷酸分析(ASO)、斑点印迹分析、变性梯度凝胶电泳，RFLP和PCR SSCP。i.引物和探针
这里定义的术语引物，指包括能通过模板依赖性进程引导合成新生核酸的任何核 酸。典型地，引物是长度为10-20个碱基对的寡核苷酸，但是可以使用更长的序列。引物可 以是以双链或单链形式提供，虽然优选单链的形式。探针的定义与引物不同，虽然它们也可 以作为引物。尽管探针也许可以有引导的作用，但探针被设计成用来结合目标DNA或RNA 并且不需要被用于扩增过程。在特定的实施例中，用带荧光团(丹若明，荧光素)或化学发 光(荧光酶素)的放射性元素(32p、14C、35S、3H或其他标记)标记探针或引物。ii.模板依赖性扩增方法多种模板依赖性程序可用于扩增存在于特定的模板样本中的标记的序列。一种 最著名的扩增方法是聚合酶链反应(称为PCR )，在美国专利4，683，195,4, 683，202和 4，800，159以及hnis et al，1990中有详细描述，在此将其全部内容引入作为参考。简要地说，在PCR 中，准备两条与标记序列的相反方向互补链上的区域互补的引 物序列。加入过量的脱氧核苷三磷酸和一种DNA聚合酶，例如Taq聚合酶到反应混合物中。 如果标记序列存在于样本中，引物就会结合于标记物，然后聚合酶将通过添加核苷酸促使 引物沿着标记序列延伸。通过提高和降低反应混合物的温度，延伸的引物会从标记物上解 离下来形成反应产物，过量的引物会结合于标记物和反应产物并且重复上述程序。 为确定扩增的mRNA的量，可以进行反转录酶PCR 扩增程序。将RNA反转录为cDNA 的方法是众所周知的并且在Sambrook et al，1989中有所描述。可选择的反转录的方法使 用耐热的RNA依赖性DNA聚合酶。这些方法在1990年12月21日提交的WO 90/07641中 有所描述。聚合酶链反应方法学在本技术领域是众所周知的。用于扩增的另一种方法是连接酶链反应(“LCR")，在EPO号320308中公开，在 此将其全部内容引入作为参考。在LCR中，准备两对互补的探针对，当目标序列存在时，每 对探针会结合于其所接触的靶标的相反方向的互补链上而相互邻接。当存在连接酶时，两 对探针对会连接形成单个单位。通过如PCR 中的温度循环，结合的连接单位就从靶标上 解离下来，然后作为“目标序列”用于剩余的探针对的连接。美国专利4，883，750描述了与 LCR相似的方法用于将探针对结合于目标序列上。 01申请号？07旧87/00880中所描述的0 0复制酶在本发明中也可以用作另一种 扩增方法。在该方法中，含与靶标互补的区域的RNA复制型序列在RNA聚合酶的存在下被 加入到样品中。聚合酶会拷贝复制型序列，该序列可以随后被检测到。一种等温扩增方法在本发明中也可以被用于扩增核酸，在该方法中，限制性核酸 内切酶和连接酶被用于完成目标分子的扩增，该目标分子在限制性位点的一条链上包含核 苷酸 5' -α 硫代-三磷酸，Walker etal，(1992)。链置换扩增(SDA)是进行核苷酸等温扩增的另一种方法，其包含多轮链置换和合 成，亦即，缺口平移。一种类似的方法，称为修复链反应(RCR)，包括使多个探针贯穿扩增目 标区退火，之后进行修复反应，在该反应中只存在四种碱基中的两种。为了容易检测，另外 两种碱基可以作为生物素化衍生物进行添加。一种相似的方法应用于SDA中。也可以通过 循环探针反应(CPR)来检测目标特定序列。在CPR中，含非特异DNA的3 ‘和5 ‘序列以及 特异RNA的中间序列的探针杂交于存在于样品中的DNA上。杂交后，用核糖核酸酶H来处 理反应，探针产物被鉴定为特殊的产物，该产物在消化后被释放出来。原始模板被退火到另 一个循环探针上并且重复上述反应。
还有另一种扩增方法可以为本发明所用，其在GB申请号22023 和PCT申请号 PCT/US89/01025中有所描述，在此将其全部内容引入作为参考。在之前的申请中，“修饰的” 引物被用于类似PCR 的模板和酶依赖性的合成。该引物可以通过用捕捉组分(例如，生物 素)和/或检测组分(例如，酶)标记而被修饰。在之后的申请中，过量的标记探针被添加 到样品中。当目标序列存在时，探针结合并且被催化切割。在切割之后，目标序列被完整释 放而被过量的探针结合。标记探针的切割是目标序列存在的信号。其他的核酸扩增程序包括基于转录的扩增系统(TAS)，该系统包括基于核酸序列 的扩增(NASBA)和 3SR(Kwoh et al.，1989 ；Gingeraset al，PCT 申请 WO 88/10315，在此将 其全部内容引入作为参考)。在NASBA中，可以通过常规的酚/氯仿萃取，临床样本的热变 性，用裂解缓冲液和分离DNA和RNA的小离心柱处理或者RNA的盐酸胍萃取来准备核酸用 于扩增。这些扩增技术包括使含目标特异序列的引物退火。聚合之后，DNA/RNA杂交体被 核糖核酸酶消化而双链DNA分子被再一次热变性。在每种情况下，通过添加第二条目标特 异引物使单链DNA变为完整的双链，之后进行聚合。然后双链DNA分子通过RNA聚合酶如 T7或SP6成倍转录。在等温循环反应中，RNA被反转录为单链DNA，随后单链DNA转化成双 链DNA，然后通过RNA聚合酶如T7或SP6再一次转录。产生的产物，不论是截短的还是完整 的，均指目标特异序列。Davey et al.，EPO号329 822 (在此将其全部内容引入作为参考)公开了一种包 括循环合成单链RNA (“ ssRNA“ )，ssDNA和双链DNA (dsDNA)的核酸扩增方法，该方法可以 为本发明所用。ssRNA是第一条引物寡核苷酸的模板，通过反转录酶延伸(RNA依赖性DNA 聚合酶)。随后通过核糖核酸酶H(核糖核酸酶H，特异性作用于与DNA或RNA形成双体的 RNA的一种核糖核酸酶)的作用将RNA从产生的DNA:RNA双体上去除。产生的ssDNA是第 二条引物寡核苷酸的模板，它也包括位于模板同源物5’端的RNA聚合酶启动子(如T7RNA 聚合酶)序列。随后通过DNA聚合酶(如大肠杆菌DNA聚合酶I的大"Klenow"片段)使 引物延伸，产生双链DNA(" dsDNA")分子，其含有一段与引物之间的原始的RNA相同的序 列并且在一端含有另外的启动子序列。该启动子序列可以被适当的RNA聚合酶所用产生该 DNA的众多RNA拷贝。随后这些拷贝可以重新进入循环从而导致非常迅速的扩增。通过酶 的正确选择，该扩增可等温进行而不需在每个循环都添加酶。由于该方法的循环特性，可以 选择DNA或RNA形式的起始序列。Miller et al，PCT申请WO 89/06700 (在此将其全部内容引入作为参考)公开了 一种核酸序列扩增方法，该方法基于将启动子/引物序列杂交于目标单链DNA(" ssDNA") 上，之后转录该序列的众多RNA拷贝。该方法不是循环的，例如，新的模板不是由产生的RNA 转录物合成的。其他的扩增方法包括〃 RACE"和〃单边PCR 〃 (Frohman, 1990 ；Ohara et al, 1989 ；在此将其全部内容引入作为参考)。在含产生的“双寡核苷酸”序列的核酸存在下，两条(或更多)寡核苷酸连接，由 此扩增双寡核苷酸，基于以上的方法也可以用于本发明的扩增步骤。mi et al, (1989)，在 此将其全部内容引入作为参考。iii. Southern/Northern印迹技术为本领域技术人员所熟知。Southern印迹包括使用DNA作为靶标，而 Northern印迹包括使用RNA作为靶标。每种提供不同类型的信息，虽然cDNA印迹在很多方面与RNA种类的印迹是相似的。简要地说，探针用于锚定各种被固定于适当的基质上的DNA或RNA，该基质通常是 硝化纤维素滤膜。应该将不同的种类进行空间分离以便有助于分析。该分离通常是通过各 种核酸的凝胶电泳之后“印迹”到膜上而完成的。随后，在促进变性和再次杂交的条件下用探针(通常是标记的)温育印迹的靶标。 由于探针是设计成与靶标形成碱基对的，因此探针将在变性的条件下结合于目标序列的一 部分。随后未结合的探针被去除，并且按如上所述完成检测。iv.分离方法为了确定特异性扩增是否发生，通常需要在一个或另一个阶段将扩增产物从模板 和过量引物中分离出来。在一个实施例中，使用常规方法通过琼脂糖、琼脂糖-丙烯酰胺或 聚丙烯酰胺凝胶电泳将扩增产物分离出来。参见Sambrook et al. (1989)。选择性地，可以使用层析技术来达到分离目的。有多种可用于本发明的层析方法 吸附、分配、离子交换和分子筛，使用这些方法的多种专门技术包括柱子、纸、薄层和气相层 析法(Freifelder, 1982)。v.检测方法为了确定标记序列的扩增，产物需要被可视化。一种典型的可视化方法包括用溴 化乙锭将凝胶染色并且在紫外线下目测。选择性地，如果扩增产物整体地被标记了放射性 或荧光光度标记的核苷酸，在分离后，扩增产物可以随后曝光于X射线胶片上或在适当的 激发光谱下显现。在一个实施例中，可间接达到可视化。在分离扩增产物之后，用带标记的核酸探针 与扩增的标记序列接触。探针优选与发色团偶联，但可以是放射性同位素标记的。在另一 个实施例中，探针与结合伴侣偶联，如抗体或生物素，结合成对的另一个成员携带可检测的 组分。在一个实施例中，由标记的探针进行检测。涉及的技术是本领域技术人员所熟知 的并且在很多关于分子方法的常规书中可以找到。参见Sambrook et al. (1989)。例如，在 扩增之中或之后，发色团或放射性同位素标记的探针或引物鉴别靶标。上述的一个实施例在美国专利5，279，721中有所描述，在此将其引入作为参考， 该专利公开了用于自动电泳和核酸迁移的仪器和方法。该仪器允许不需额外的凝胶操作而进行电泳和印 迹，而且理想地适合应用于本发明。此外，可以使用常规序列分析方法将上述的扩增产物通过序列分析来鉴定特定的 变异类型。在特定的方法中，使用设计用于最佳测序的引物组通过序列分析对基因进行详 尽的分析(Pignon et al，1994)。本发明提供了可以使用任一或所有这些类型的分析的方 法。通过使用这里所公开的序列，可以设计寡核苷酸引物来进行序列扩增，随后可以通过直 接测序来分析扩增序列。vi.试剂盒成分用于检测和测定目的基因的序列所需要的所有的基本原料和试剂可以一起组装 在一个试剂盒中。通常该试剂盒会包含预先选择的引物和探针。也会包含适用于扩增核酸 的酶，包括多种聚合酶(RT、Taq、测序酶 等等)，脱氧核苷酸和缓冲液，用于提供扩增所必需的反应混合物。在适当的方法中，这类试剂盒通常也会包括以合适的方式装载每种试剂 和酶以及每种引物或探针的特殊的容器。Vii.对相对定量的RT-PCR 的设计和理论考虑将RNA反转录为cDNA之后进行相对定量的PCRtm(RT-PCRtm)可以用于测定从病人 身上分离出来的各种特定mRNA的相对浓度。通过测定各种特定mRNA浓度的变化，可显示 编码特定mRNA种类的基因的差异表达。在PCR 中，反应的每个循环使扩增的目标DNA的分子的数量增加至接近2倍，直 至一些试剂变得有限。其后，扩增速度变得越来越慢直至在循环之间扩增的靶标并不增加。 如果绘制图表，X轴为循环数，Y轴为扩增的目标DNA的浓度对数，通过将绘制的点连接起来 就会形成特有形状的曲线。从第一个循环开始，线的倾斜度是正数并且是恒定的。这被称 为曲线的线性部分。在试剂变得有限时，线的倾斜度开始下降并且最终变为0。这时扩增的 目标DNA的浓度渐渐变为某个固定值。这称为曲线的稳定部分。在PCR 扩增的线性部分中，目标DNA的浓度是直接与反应开始前的靶标的起始 浓度成比例的。通过测定各个完成了相同循环次数并处于其线性范围的PCR 反应中目标 DNA扩增产物的浓度，就有可能测定在原始DNA混合物中特定靶标序列的相对浓度。如果 DNA混合物是由不同组织或细胞分离所得的RNA合成的cDNA，，那么就可以测定相应的组织 和细胞的特定mRNA的相对丰度，其中的mRNA是靶标序列的来源。PCR 产物的浓度和相对 mRNA的丰度之间的直接比例性只适用于在PCR 反应的线性范围内。在曲线的平稳部分的目标DNA的最终浓度是由反应混合物中的试剂的可用性决 定的，并不依赖于目标DNA的原始浓度。因此，通过RT-PCR 对采集的RNA抽样总体进行 各种mRNA的相对丰度测定必须满足的首要条件是，扩增的PCR 产物的浓度的样品必须在 PCR 反应处于它们曲线的线性部分时进行采集。通过RT-PCR 实验来成功测定各种特定mRNA的相对丰度的第二个必须满足的条 件是可扩增的cDNA的相对浓度必须标准化为某个独立的标准。RT-PCR 实验的目的是测 定相对于样本中所有各种mRNA的平均丰度而言的各种特定mRNA的丰度。竞争性PCR 的大部分方法使用内在PCR 标准样本，该标准样本大约与目标样本 一样丰富。如果在PCR 反应的线性期对PCR 扩增产物进行采样，那么这些方法是有效的。 如果产物是在反应接近平稳期进行采样，那么较低丰度的产物的丰度会显得相对过高。比 较很多测定的不同RNA样本的相对丰度，如在检测RNA样本的差异表达的案例中，在某一方 面会变得失真，使RNA相对丰度的差异比它们实际的看起来要少。如果内在标准样本比目 标样本要丰富得多，那么这就不是一个重要问题。如果内在标准样本比目标样本丰富，那么 可以在RNA样本之间进行直接的线性比较。以上的讨论描述了对检测临床材料的RT-PCR 的理论考虑。在临床样本中的固有 问题在于它们的量变(产生标准化问题)，以及它们的质变(需要有可信的内在对照样本的 共扩增，优选比目标样本片段更大的内在对照样本)。如果RT-PCR 作为带有内在标准样本 的相对定量RT-PCR 进行测定，则上述量变和质变的问题即可迎刃而解，其中所说的内在 标准样本是比目标cDNA片段大的可扩增的cDNA片段，并且其中编码内在标准样本的mRNA 的丰度大约比编码目标样本的mRNA高5-100倍。这一分析是测定各种mRNA的相对丰度而 不是绝对丰度。
可以使用更常规的带有外在标准样本方案的相对定量RT-PCR 分析来进行其他 研究。这些分析在PCR 产物的扩增曲线的线性部分对PCR 产物进行采样。必须根据经验 确定每个目标cDNA片段的最佳采样的PCR 循环数。此外，对于由不同组织样本分离而来 的每个RNA抽样总体的反转录产物，必须仔细将其标准化为同等浓度的可扩增的cDNA。由 于该分析是测定mRNA的绝对丰度，因此这一考虑是非常重要的。mRNA绝对丰度只能用于测 定标准化的样本中的基因差异表达。虽然根据经验确定扩增曲线的线性范围以及cDNA制 品的标准化是冗长的和费时的过程，但是由此产生的RT-PCR 分析可以胜过带内在标准样 本的相对定量RT-PCR 分析。这一优点的一个原因在于如果没有内在标准样本/竞争者，所有的试剂可以被转 换成在扩增曲线的线性范围内的单一PCR 产物，从而提高分析的灵敏度。另一个原因在于 如果只有一种PCR 产物，在电泳凝胶上或另一种显示方法中，产物的显示就变得不那么复 杂，背景变弱并且更易于解释。viii.芯片技术本发明人所特别考虑的是基于芯片的DNA技术，如Hacia et al. (1996)和 Shoemaker et al. (1996)所描述的那些。简要地说，这些技术包括快速及准确地定量分析 大量基因的方法。通过用寡核苷酸标记基因或使用固定的探针阵列，可以应用芯片技术分 离高密度阵列的目标分子并且通过杂交筛选这些分子。也参见Pease et al. (1994) ；Fodor etal. (1991)。B.免疫诊断学可以通过诸如ELISA和Western印迹的技术将本发明的抗体用于表征健康和患病 组织的肿瘤抑制因子含量。这可以提供一种甄别恶性肿瘤的存在或不存在的方法，或者作 为未来癌症的预测者，或者在本发明中作为预测对暴露于溶瘤病毒的可能应答的方法。考虑将本发明的抗体应用于ELISA实验中。例如，抗肿瘤抑制因子的抗体被固定 于所选的表面上，优选呈现蛋白亲和力的表面，如聚苯乙烯微量滴定板的孔。在洗脱不完全 吸附的物质后，需要用非特异性蛋白结合或涂布测定板的孔，已知该非特异性蛋白对测试 的抗血清是抗原中性的，如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液，这就可以阻断固定表 面的非特异性吸附位点，从而降低由抗原非特异性结合于表面所产生的背景。将抗体结合于孔、用无反应性的物质涂布从而降低背景并且洗脱未结合物质之 后，用一种有助于免疫复合物(抗原/抗体)形成的方法使固定化的表面与待测样品接触。在待测样品和结合的抗体之间形成特异性免疫复合物以及随后的洗脱之后，可以 通过加入二抗来测定特异性免疫复合物形成的发生和均量，二抗对与一抗不同的肿瘤抑制 因子有特异性。合适的条件优选包括用稀释液如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸盐缓冲液 (PBS)/吐温 稀释样品。这些添加的试剂也有助于帮助减少非特异性背景。随后将成层的 抗血清在约25°C 27°C的适宜的温度下温育约2 4小时。温育之后，冲洗接触抗血清的 表面从而去除非免疫复合物物质。优选的洗脱程序包括用诸如PBS/吐温 或硼酸盐缓冲 液的溶液进行洗脱。为了提供一种检测方法，优选二抗含有结合的酶，在用合适的发色底物温育后，该 酶将产生颜色显影。因此，例如，希望在促进产生特异性免疫复合物形成的条件下，用结合 脲酶或过氧化酶的抗人IgG与结合二抗的表面接触和温育一段时间(例如，在室温下在含PBS的溶液如PBS/吐温 中温育2小时)。在用酶标记的二抗温育并随后洗脱未结合的物质后，在过氧化物酶作为酶标的情 况下，标记物的量通过用发色底物温育来定量，发色底物如脲和溴甲酚紫或2，2'-偶氮 基-二 -(3-乙基-苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTQ和H202。随后通过测定颜色产生的程度 来完成定量，例如，使用可见光谱分光光度计测定。上述的形式可以改为先将样品结合于测定板上，然后，将一抗与测定板温育，之后 使用对一抗有特异性的标记的二抗来检测结合的一抗。本发明的抗体组合物在免疫印迹或Western印迹分析中广泛使用。抗体可以用作 高亲和力的主要试剂用于识别固定在固体支持基质上的蛋白，固体支持基质例如是硝酸纤 维素、聚酰胺纤维或其组合物。结合免疫沉淀反应，随后进行凝胶电泳，这些抗体可以被用 作单一步骤试剂用于检测抗原，用于检测抗原的第二种试剂引起对抗原不利的背景。基于 这点，考虑特定使用与Western印迹结合使用的基于免疫学的检测方法，包括酶、放射性标 记或荧光标记的抗肿瘤抑制因子二抗。IV.抗过度增生疗法过度增生紊乱是一种疾病家族，特征为异常的或不受控制的细胞增生。这些疾病 通常分为两类较典型的癌症或“恶性”紊乱，以及较不普遍的良性过度增生疾病，如良性的 前列腺肥大，良性的乳腺上皮细胞增生，子宫内膜增生，甲状腺肥大以及表皮或真皮上皮细 胞增生。虽然之后讨论的很多方面是集中在癌症上，但是需要理解的是当合适时相同的方 法也适用于良性疾病。与典型地只在细胞数量上异常的良性疾病不同，癌症指在患者身上存在发育异常 的、形成肿瘤的或不适当增生的、癌的和/或转化的细胞，包括例如发育异常的、肿瘤的、非 接触抑制的或致瘤性转化的细胞等等(例如，黑素瘤，癌如腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、燕 麦细胞癌等等，肉瘤如纤维肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤等等，肝细胞瘤，成神经细胞瘤，黑素瘤， 造血系统恶性肿瘤如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤等等)，这些是为本领域所熟知的，并且为其建 立了诊断和分类的标准。不受任何理论的限制，呼肠孤病毒的溶瘤特性可能源自对与敏感 的细胞内环境有关的恶性转化细胞的病毒趋向，例如，如本领域所描述的Ras激活细胞中 削弱的PKR磷酸化，或如这里所定义的含有缺损的肿瘤抑制因子功能。A.溶瘤病毒疗法在癌症治疗中关于野生型呼肠孤病毒的产生和使用的特定方法已有描述(例 如，美国专利 7，300，650，7，163，678，7，049，127，7，014，847，6，994，858，6，811，775， 6，703，232,6，576，234,6，565，831,6，528，305,6，455，038,6，344，195,6，261，555, 6，136,307 和 6，110,461，以及美国专利公开文本 2006/0165724, 2006/0073166, 2005/0123513,2004/0265271,2004/0126869,2004/0109878,2002/0037543, 2006/0029598, 2005/0026289, 2002/0006398 和 2001/0048919，在此无放弃权利地将其全 部内容引入作为参考)。粘液瘤病毒疗法在美国专利公开文本2006/(^63333中有所描述， 也引入作为参考。B.净化疗法本发明在特定实施例中提供了净化癌细胞的细胞种群的方法。例如，用清髓性疗 法治疗的带造血系统或实体癌的个体随后可以通过使用净化的骨髓组织接受造血干细胞救治，净化的骨髓组织是由在化学疗法前的个体中获得的。在这些实施例中，可以用溶瘤病 毒处理骨髓从而去除或杀伤肿瘤细胞以减少或去除对造血干细胞的损伤。使用病人自己的成熟干细胞用于细胞疗法可以避免宿主免疫、移植物抗宿主疾病 和伦理议题等问题。因此人的成熟干细胞在各种组织再生疗法中有广泛价值。然而，据报 道，在成熟干细胞的体外培养扩增中会发生自发转化(Tolar et al. ,2007 ；Romano, 2005) 0 因此，为了在移植和组织再生中更安全使用，需要适当的净化策略来去除存在于培养扩增 的成熟干细胞中的自发转化的细胞。报道显示野生型呼肠孤病毒在体外可有效去除存在于 自身造血干细胞群体中的癌细胞(Thirukkumaran et al. ,2003 ；Thirukkumaran et al.， 2005)。减毒型呼肠孤病毒和粘液瘤病毒可以以相似方式应用。发明人期望本发明可以在 实际上与目前已知的或之后发现的任何成熟的或胚胎干细胞系一起使用。在特定实施例中，可能需要从细胞组合物中去除呼肠孤病毒，例如，在经过一段足 够的时间来杀伤肿瘤细胞(如果存在)后。例如，骨髓可以由个体中获得并且用呼肠孤病 毒来处理从而破坏肿瘤细胞；然而，在将骨髓重新植入到个体中之前(例如，免疫缺损的癌 症病人)，可能需要破坏、消除和/或去除组合物中的病毒。在这些实施例中，可以添加抗 病毒试剂到细胞组合物中。这些试剂包括抗呼肠孤病毒的抗体和补体，必要的病毒酶的抑 制剂如RNA指导的RNA聚合酶抑制剂，或干扰病毒成功包装、组装或从感染细胞中释放的试 剂。其他的纯化步骤，包括洗脱和/或离心分离细胞，可以被用于进一步从细胞组合 物中去除病毒和/或死亡细胞。这些方法为本领域所熟知并且包括富集所需类型的细胞的 方法，包括基于荧光激活细胞或基于粘附的方法，该方法能赋予目标细胞如干细胞群体的 阳性筛选。C.联合疗法为了提高通过溶瘤病毒选择性杀伤癌细胞的效力，在特定实施例中可能需要用另 外的抗癌试剂来接触细胞，如化学治疗剂、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、用另 一种天然或工程病毒进行的疗法或基因疗法。化学治疗剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、博来霉素、白消安、喜树碱、卡波钼、苯丁 酸氮芥、顺氯氨钼(CDDP)、环磷酰胺、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、雌激素受体结合试剂、鬼 臼乙叉苷(VP16)、，法尼基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、二氯甲二乙胺、美法 仑、丝裂霉素、新霉酰胺、亚硝基脲、普卡霉素、甲基苄胼、雷洛昔芬、三苯氧胺、紫杉酚、替莫 唑胺(液态DTIC)、顺钼、长春碱和甲氨蝶呤、长春新碱或上述的任意类似物或衍生物变异 体。根据它们在细胞内的活性方式将这些试剂或药物分类，例如，它们是否以及在哪一个阶 段影响细胞周期。或者，可以基于它的直接与DNA交联、插入DNA或通过影响核酸合成来引 发染色体和有丝分裂异常的能力来表示试剂的特征。大部分化学治疗剂可以分为以下种 类烷基化试剂、代谢拮抗剂、抗肿瘤抗生素、皮质留类激素、有丝分裂抑制剂和亚硝基脲、 激素试剂、混合试剂及其任意类似物或衍生物变异体。溶瘤疗法可以在将其他试剂施用于癌细胞的同时，之后或之前进行，时间间隔为 数分钟至数周。例如，在这类实施例中，如同减弱型呼肠孤病毒，可涉及到以多种模式基本 上同时地(例如，在约少于1分钟之内)接触癌细胞、组织、器官或生物体。在其他方面，可 以在给予减毒型或野生型呼肠孤病毒之前和/或之后约1分钟，约5分钟，约10分钟，约20分钟，约30分钟，约45分钟，约60分钟，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小 时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约13小时，约14小 时，约15小时，约16小时，约17小时，约18小时，约19小时，约20小时，约21小时，约22 小时，约22小时，约23小时，约24小时，约25小时，约26小时，约27小时，约28小时，约 29小时，约30小时，约31小时，约32小时，约33小时，约34小时，约35小时，约36小时， 约37小时，约38小时，约39小时，约40小时，约41小时，约42小时，约43小时，约44小 时，约45小时，约46小时，约47小时，约48小时，约1天，约2天，约3天，约4天，约5天， 约6天，约7天，约8天，约9天，约10天，约11天，约12天，约13天，约14天，约15天，约 16天，约17天，约18天，约19天，约20天，约21天，约1周，约2周，约3周，约4周，约5 周，约6周，约7周或约8周或更多，以及任何由其推导出来的时间范围内，或同时地给予一 种或多种试剂。 可以将减毒型呼肠孤病毒或野生型呼肠孤病毒和一种或多种试剂组合起来使用。 以下显示这类组合的非限制性实施例，其中溶瘤病毒是“A”而抗癌试剂是“B”A/WA B/A/BΒ/Β/Α Α/Α/Β A/B/BB/'k/kA/7B//BB/A//BB/WB/A B/B/- /Β Α/Α/Β/Β A/B/7A//BA/%'KB/%%'KB//A/B/A B/A/- /Β Α/Α/Α/Β B/A/7A/'KA/'KA/7A/'Ki.化学疗法各种各样的化学治疗剂可以为本发明所用。术语“化学疗法”指使用药物来治疗癌 症。“化学治疗剂”用于指在治疗癌症中给予的一种化合物或组合物。根据它们在细胞内的 活性方式将这些试剂或药物分类，例如，它们是否以及在哪一个阶段影响细胞周期。或者， 可以基于它的直接与DNA交联、插入DNA、或通过影响核酸合成来引发染色体和有丝分裂异 常的能力来表示试剂的特征。大部分化学治疗剂可以分为以下种类烷基化试剂、代谢拮抗 剂、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂和亚硝基脲。烷基化试剂。烷基化试剂是直接与基因组DNA相互作用而阻止癌细胞增生的药 物。这类化学治疗剂代表影响细胞周期所有阶段的试剂，也就是说它们不是阶段特异性的。 烷基化试剂可以被用于治疗慢性白血病，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金氏症，多发性骨髓瘤，以 及乳腺、肺和卵巢的特定癌症。它们包括白消安，苯丁酸氮芥，顺氯氨钼，环磷酰胺(癌得 星)，氮烯唑胺，异环磷酰胺，二氯甲基二乙胺(氮芥)和美法仑。Troglitazaone可以与这 些烷基化试剂中的任意一种或更多种联合用于治疗癌症，其中一些在下面讨论。白消安(也称为马勒兰)是一种双功能烷基化试剂。白消安在化学上被称为1， 4-二甲磺酰丁烷。白消安不是氮芥的结构类似物。白消安以药片形式用于口服给药。每个刻痕片包 含ang白消安以及非活性成分硬脂酸镁和氯化钠。白消安被用于慢性骨髓性(骨髓的、髓细胞的、粒细胞的)白血病的缓和治疗。虽 然不是治愈性的，但是白消安降低了粒细胞的总数，减轻了疾病的症状，并且改善了病人的 临床症状。大约90%先前未治疗慢性骨髓性白血病的成人在使用白消安之后，会得到器官 巨大症消退或稳定的血液学缓解。就存活期和色素水平稳定而言，它的疗效要优于照射脾 脏，并且在控制脾脏肿大方面与用射线照射的疗效相等。苯丁酸氮芥(也称为瘤可宁)是一种双功能的氮芥型的烷基化试剂，被发现在抗选择性人类肿瘤疾病上有活性。苯丁酸氮芥的化学名称为4-[双(2-氯乙基)氨基]苯基 丁酸。苯丁酸氮芥以药片形式用于口服给药。它可以通过胃肠道被快速完全地吸 收。在给予单个口服剂量0. 6-1. 2mg/kg之后，血液苯丁酸氮芥水平可在1小时内到达 高峰，最终原始药物的半衰期估计为1. 5个小时。0. 1-0. 2mg/kg/day或3-6mg/m2/day 或选择性地Ο.-g/kg可以用于抗肿瘤治疗。治疗方法为本领域技术人员所熟知并且可 以在"Physicians Desk Reference，，禾口这里所弓| 用的"Remington ‘ sPharmaceutical Sciences"中找到。苯丁酸氮芥被用于治疗慢性淋巴性(淋巴细胞的)白血病、恶性淋巴瘤包括淋巴 肉瘤、巨滤泡性淋巴瘤和霍奇金氏症。它对这些病症中的任一种都不是治愈性的，但是在临 床上可以产生有效的缓和。因此，它可以与曲格列酮在癌症治疗中联合使用。顺氯氨钼被广泛用于治疗癌症如转移性睾丸或卵巢癌、晚期膀胱癌、头部或颈部 癌、子宫颈癌、肺癌或其他肿瘤。顺氯氨钼可以单独使用或与其他试剂联合使用，它在临床 应用上的有效剂量为15-20mg/m2，每三个星期给药5天，总共三个疗程。示范性的剂量可 以是 0· 50mg/m2，1. Omg/m2，1. 50mg/m2，1. 75mg/m2，2· Omg/m2, 3. Omg/m2,4. Omg/m2, 5. Omg/m2， 10mg//m2。当然，所有的这些剂量都是示范性的，并且也预计到这些点之间的任何剂量可以 用于本发明。顺氯氨钼不能被口服吸收，因此必须通过静脉、皮下、瘤内或腹膜内注射。环磷酰胺是2H-1，3，2-氧氮磷-2-胺，N，N-双(2_氯乙基)四氢，2_氧，一水合物； 称为癌得星的，可从Mead Johnson公司获得；称为Neosar的，可从Adria公司获得。在三乙 胺的催化作用下将3-氨基1-丙醇和N，N-双(2-氯乙基)磷酰二氯[(C1CH2CH2)2N--P0C12] 在二氧杂环乙烷溶液中缩合制备环磷酰胺。缩合反应是双倍的，涉及羟基和氨基基团，从而 实现环化。与其他β -氯乙烷氨基烷化剂不同，它在被肝酶激活之前并不轻易环化成有活性 的环乙亚胺形式。因此，该物质在胃肠道中是稳定的，通过口服和亲本途径给药是耐受良好 的和有效的，并且不引起局部起疱、坏疽、静脉炎甚至疼痛。用于成人的合适的剂量包括，口服，l-5mg/kg/day (通常联合给药)，取决于胃肠 耐受力；或1-ang/kg/day ；静脉注射，最初在2-5天的时间内分剂量注射40-50mg/kg或每7 到10天注射10-15mg/kg或每周注射两次3-5mg/kg或1. 5_;3mg/kg/day。可以给予250mg/ kg/day的剂量用作抗肿瘤。由于对胃肠的不利作用，静脉注射的途径是优选使用的。在稳 定期，通常需要3000-4000/mm3的白细胞量。有时也通过浸润或进入体腔进行肌肉注射给 药。注射100，200和500mg以及药片25和50mg是可行的剂量形式，关于给药剂量的细节 的专业技术参考〃 Remington' s Pharmaceutical Sciences"第15版，61章，在此作为参 考文献引入。美法仑，也称为左旋溶肉瘤素、L-苯丙氨酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、L-PAM或L-溶肉 瘤素，是氮芥的苯丙氨酸衍生物。美法仑是一种双功能烷基化试剂，它在抗选择性人类肿瘤 疾病上有活性。它的化学名称为4-[双(2-氯乙烷)氨基]-L-苯丙氨酸。美法仑是该化合物有活性的L型异构体并且最初是在1953年由Bergel和Stock 合成的；D型异构体，称为右旋丙氨酸氮芥，在特定的动物肿瘤上的活性较低，并且在染色体上产生效力所需的剂量比L型异构体所需的要大。外消旋的(DL-)的形式被称为苯丙氨 酸氮芥或溶肉瘤素。美法仑在水中是不溶的，其Pfe1值为 2.1。美法仑可以药片形式口 服用药并用于治疗多发性骨髓瘤。可用的证据显示大约三分之一至二分之一的多发性骨髓瘤病人对口服该药物呈 现有利的反应。美法仑被用于治疗卵巢上皮细胞癌。一种通常使用的用于治疗卵巢癌的方法是以 每天0. 2mg/kg美法仑的剂量给药，给药5天作为一个疗程。根据血液耐受力，每四-五周 重复疗程(Smith and Rutledge，1975 ；Young et al，1978)。或者美法仑的使用剂量可以低 至0. 05mg/kg/day或高至!Mg/kg/day，或这些剂量之间的或高于这些剂量的任意剂量。根 据待治疗的患者的情况，剂量上必须要有一些变化。在任何情况下，对个体患者的适当剂量 应由人体对给药的反应决定。代谢拮抗剂。代谢拮抗剂破坏DNA和RNA的合成。与烷基化试剂不同，它们在S 期特异性影响细胞周期。除了乳腺、卵巢和胃肠道肿瘤外，它们还被用于对抗慢性白血病。 代谢拮抗剂包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、氟达拉滨、吉西他滨和氨甲喋呤。5-氟尿嘧啶(5-FU)的化学名称为5-氟-2，4 (1H，3H)_嘧啶二酮。它的作用机制 被认为是通过阻断脱氧尿苷酸变成胸苷酸的甲基化反应而进行。因此，5-FU干扰脱氧核糖 核酸(DNA)的合成并且在较低程度上抑制核糖核酸(RNA)的形成。由于DNA和RNA对于细 胞分裂和增殖是必需的，因此5-FU的作用被认为是产生胸苷缺陷从而导致细胞死亡。因 此，5-FU可应用于迅速分裂的具有转移性癌症特征的细胞中。抗肿瘤抗生素。抗肿瘤抗生素含抗菌性和细胞毒性两种活性。这些药物也通过在 化学上抑制酶和有丝分裂或改变细胞膜来干扰DNA。这些试剂不是阶段特异性的，所以它们 在细胞周期的所有阶段都起作用。因此，它们被广泛应用于各种癌症。抗肿瘤抗生素包括博 来霉素、更生霉素、柔红霉素、阿霉素(亚德里亚霉素)和黄胆素，其中一些会在下面更详细 地讨论。这些化合物广泛应用于临床环境用于治疗肿瘤，剂量范围从以21天间隔通过静脉
快速浓注给药，给予阿霉素的25-75mg/m2，到静脉注射或口服给予鬼臼乙叉苷的35_100mg/m2。盐酸阿霉素，5，12-萘二酮，(8s-顺)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-a-L-来 苏-己吡喃糖)氧]_7，8，9，10-四氢化-6，8，11-三羟基-8-(羟乙酰基)甲氧基-氢 氯化物(羟基柔红霉素盐酸盐，亚德里亚霉素)被用作广谱抗肿瘤药物。它结合于DNA并 抑制核酸合成，抑制有丝分裂以及促使染色体畸变。单独给药时，它是用于治疗甲状腺瘤和早期肝细胞癌的首选药物。它是31种首选 组合中的一种成分，用于治疗卵巢、子宫内膜和乳腺瘤、支气管原燕麦细胞癌、非笑细胞肺 癌、胃腺癌、成视网膜细胞瘤、成神经细胞瘤、蕈样霉菌病、胰腺癌、前列腺鳞癌、膀胱癌、骨 髓瘤、弥温性组织细胞淋巴瘤、维尔姆斯氏瘤、霍奇金氏症、肾上腺瘤、骨源性肉瘤、软组织 肉瘤、尤因氏肉瘤、横纹肌肉瘤和急性淋巴细胞性白血病。它是一种用于治疗胰岛细胞癌、 子宫颈癌、睾丸和肾上腺皮质癌的替代性药物。它也是一种免疫抑制剂。阿霉素吸收不良，必须静脉注射给药。药物代谢动力学是多室的。分配阶段的半 衰期是12分钟和3. 3小时。排除的半衰期约为30小时。40-50%被分泌到胆汁中。大部 分的残留物在肝脏中代谢，部分代谢成为有活性的代谢物(阿霉素醇)，但是有一些百分比分泌到尿中。当存在肝脏损伤时，剂量需减少。成人的静脉注射的适当剂量是以21天间隔给予60-75mg/m2，或以3或4周间隔 每连续2或3天重复给予25-30mg/m2，或每周给予20mg/m2。当存在由早期化学疗法或肿 瘤骨髓入侵引起的早期骨髓抑制时，或者当该药物与其他髓细胞生成抑制性药物联合使 用时，应该对老龄患者使用最低剂量。如果血清胆红素在1.2-;3mg/dL，那么剂量应该降低 50%，如果高于;3mg/dL，那么应该降低75%。对有正常心脏功能的病人使用期间的总剂量 不应超过550mg/m2，而对接受了纵隔放疗的病人不应超过400mg/m2。或者，每连续3天给予 30mg/m2，每四周重复一次。示范性剂量可以是 10mg/m2，20mg/m2，30mg/m2，50mg/m2，IOOmg/ m2，150mg/m2，175mg/m2，200mg/m2，225mg/m2，250mg/m2，275mg/m2，300mg/m2，350mg/m2，400mg/ m2，425mg/m2,450mg/m2,475mg/m2, 500mg/m2。当然，所有的这些剂量都是示范性的，并且也预 计到这些点之间的任何剂量可以用于本发明。盐酸柔红霉素，5，12-萘二酮，(8s-顺)-10-[ (3-乙酰基-2,3,6-三脱氧-a-L-来 苏Iyxo-己吡喃糖)氧]-7，8，9，10-四氢化_6，8，11-三羟基-10-甲氧基-氢氯化物；也 称为柔红霉素，可从Wyeth公司获得。柔红霉素插入DNA，阻断DNA指导的RNA聚合酶并抑 制DNA合成。它可以以不干扰核酸合成的剂量阻止有丝分裂。与其他药物联合，它可以用于作为首选的化学疗法中治疗成人的急性髓细胞性白 血病(用于促进减缓)、急性淋巴细胞性白血病和慢性粒细胞性白血病的急性期。柔红霉 素口服吸收不良，它必须静脉注射给药。分配半衰期是45分钟而排除半衰期约为19小时。 它的活性代谢物道诺红菌素醇的半衰期约为27小时。柔红霉素大部分在肝脏中代谢并且 也分泌到胆汁中(ca 40%)。在肝脏或肾脏功能不全的个体中剂量必须减少。成人静脉注射的适当的剂量(基数等效)为60岁以下的病人每3或4周注射 45mg/m2/day(60岁以上的病人为30mg/m2) 1、2或3天，或者每3或4周注射0. 8mg/kg/day 3-6天；除了如果进行了胸部照射只能是450mg/m2之外，在使用期间给药不应超过550mg/ m2 ；对于儿童而言，除非年龄小于2岁或身体面积少于0. 5m2，为每周一次25mg/m2，在这种 情况下要使用基于体重的成人表。可注射剂量形式(基数等效)20!1^(基数等效于21.%^ 的氢氯化物)是可行的。示范性剂量可以是10mg/m2，20mg/m2, 30mg/m2, 50mg/m2,100mg/m2, 150mg/m2，175mg/m2，200mg/m2，225mg/m2，250mg/m2，275mg/m2，300mg/m2，350mg/m2，400mg/m2， 425mg/m2,450mg/m2,475mg/m2, 500mg/m2。当然，所有的这些剂量都是示范性的，并且也预计 到这些点之间的任何剂量可以用于本发明。丝裂霉素(也称为突变霉素和/或丝裂霉素-C)是一种由头状链霉素的培养物中 分离出来的抗生素，其具有抗肿瘤活性。该化合物是热稳定的，熔点高，可以大量溶于有机 溶剂中。丝裂霉素选择性抑制脱氧核糖核酸(DNA)的合成。鸟嘌呤和胞嘧啶的含量与丝裂 霉素诱导的交联程度相关。在高浓度的该药物下，细胞RNA和蛋白合成也是受抑制的。在人体中，在静脉注射给药后，丝裂霉素会被迅速地从血清中清除。在快速浓注 30mg之后血清浓度降低50%所需的时间为17分钟。在静脉注射30mg、20mg、或IOmgI. V.之 后，最高血清浓度分别是2. 4mg/ml,l. 7mg/ml，和0. 52mg/ml。清除主要受肝脏中代谢的影 响，但是代谢也会发生在其他组织中。由于认为降解通路的饱和，清除的速度与最高血清浓 度呈反比。大约10%剂量的丝裂霉素未改变地分泌到尿中。由于代谢途径在相对低的剂量下是饱和的，分泌到尿中的丝裂霉素的百分数随着剂量的增加而增加。对于儿童，静脉注射 给药的丝裂霉素的分泌与此是相似的。放线菌素D(更生霉素)[50-76-0] ；C62H86N12O16(1255. 43)是一种抗肿瘤药物，其抑 制DNA依赖的RNA聚合酶。它是用于治疗绒毛膜癌、胚胎性横纹肌肉瘤、睾丸瘤、维尔姆斯 氏瘤的首选组合中的一种成分。对系统化治疗应答失败的肿瘤有时会应答局部灌注治疗。 更生霉素可增强放射疗法。它是继发性(传出性)免疫抑制剂。放线菌素D与主要的外科手术、放射疗法以及其他药物尤其是长春新碱和环磷酰 胺联合使用。其抗肿瘤活性在尤因氏瘤、卡波济氏肉瘤和软组织肉瘤中表现显著。更生霉 素可在晚期绒毛膜癌病例的女性中有效。它与苯丁酸氮芥和甲氨蝶呤联合使用对转移性睾 丸癌的病人也产生相同的反应。有时会在霍奇金氏症和非霍奇金氏淋巴瘤的病人身上观察 到应答。更生霉素也被用于抑制免疫学应答，尤其对肾脏移植的排斥。一半剂量被原封不动地分泌到胆汁中而10%到尿中；半衰期约为36小时。药物 不通过血-脑屏障。放线菌素D以冻干粉的形式供应(每小瓶0/5mg)。通常每日的剂量 是10-15mg/kg ；静脉注射5天；如果没有产生毒性表现，可以以3-4周的时间间隔再给予一 个疗程。给儿童每日注射100-400mg，持续10-14天；在其他方法中，使用3_6mg/kg，总共 125mg/kg,以及每周固定剂量为7. 5mg/kg。虽然将药物输入静脉输注的导管中更为安全， 但还是给予直接的静脉注射，为避免皮下反应，其预防措施是废弃用于从小瓶中抽取药物 的针头。示范性的剂量可以是 100mg/m2，150mg/m2,175mg/m2, 200mg/m2, 225mg/m2, 250mg/m2, 275mg/m2，300mg/m2，350mg/m2，400mg/m2，425mg/m2，450mg/m2，475mg/m2，500mg/m2。当然，所 有的这些剂量都是示范性的，并且也预计到这些点之间的任何剂量可以用于本发明。博来霉素是由轮丝链霉菌中分离出来的细胞毒素糖肽抗生素的混合物。虽然博来 霉素的确切作用机制未知，有可用的证据表明看来其主要作用机制是抑制DNA的合成，还 有一些证据表明次要抑制RNA和蛋白的合成。在小鼠中，发现高浓度的博来霉素存在于皮肤、肺、肾脏、腹膜和淋巴管中。与在造 血组织中的低浓度相反，可发现皮肤和肺的肿瘤细胞含有高浓度的博来霉素。骨髓中发现 的低浓度的博来霉素可能与在这些组织中发现高水平的博来霉素降解酶有关。在肌酐清除>每分钟35ml的病人中，血清或血浆最终排除博来霉素的半衰期大 约是115分钟。在肌酐清除每分钟< 35ml的病人中，血浆或血清最终排除的半衰期随着肌 酐清除的减弱呈指数增长。在人体中，60%-70%所给的剂量以活性博来霉素的形式回收到 尿中。可以通过肌肉、静脉或皮下途径给予博来霉素。它在水中可以大量地溶解。博来霉素应该被考虑用于舒缓疗法。有报道显示它以单个试剂形式或以被证实 的与其他经认可的化学治疗剂组合的形式可有效治疗以下肿瘤鳞状细胞癌如头部和颈部 (包括口、舌、扁桃体、鼻咽、口咽、窦、上颚、唇、口腔黏膜、齿龈、会厌、喉)，皮肤，阴茎，子宫 颈和阴门。它也被用于治疗淋巴瘤和睾丸癌。由于淋巴瘤病人有过敏反应的可能性，对于最初的两次剂量应该用2个单位或更 少来治疗病人。如果不发生急性反应，那么就可以遵循常规的剂量表。在两周内可迅速和显著改善霍奇金氏症和睾丸癌。如果在这一时间内没看到改 善，那么改善的可能性就不大。鳞状细胞癌响应更慢，有时需要长达3周才能看到一些改善。
有丝分裂抑制剂。有丝分裂抑制剂包括植物生物碱和其他天然试剂，其可以抑制 细胞分裂所需的蛋白的合成或有丝分裂。它们在细胞周期的特殊阶段起作用。有丝分裂抑 制剂包括多西他赛、鬼白乙叉苷(VP16)、紫杉醇、红豆杉醇、紫杉特尔、长春碱、长春新碱和
长春瑞滨。VP16也称为鬼臼乙叉苷，它主要与博来霉素和顺氯氨钼联合使用用于治疗睾丸肿 瘤，与顺氯氨钼联合使用用于治疗小细胞肺癌。它也有抗非霍奇金氏淋巴瘤、急性非淋巴细 胞性白血病、乳腺癌以及与获得性免疫缺陷综合症(AIDQ相关的卡波济氏肉瘤的活性。VP16可以以溶液(20mg/ml)形式用于静脉注射给药以及以50mg液态填充胶囊的 形式用于口服给药。对于肺小细胞癌而言，静脉注射剂量(在联合疗法中)可以高达IOOmg/ m2或低至ang/m2，通常也可以使用每天给药35mg/m2连续4天-每天给药50mg/m2连续5天。 当口服给药时，剂量需要加倍。因此对小细胞肺癌而言，剂量可以高达200-250mg/m2。用于 膀胱癌的静脉注射剂量(在联合疗法中)为每天给药50-100mg/m2连续5天，或隔天给药 lOOmg/m2连续三剂。治疗周期通常每3-4周重复一次。应该在30-60分钟内缓慢输注给药 从而避免可能是由于配方中的溶剂引起的血压过低和支气管痉挛。红豆杉醇是实验上的抗有丝分裂试剂，由灰树红豆杉Taxusbrevifolia的树皮分 离而来。它结合于微管蛋白(与长春花生物碱所用的位点截然不同)并且促进微管组装。 目前正对红豆杉醇进行临床评定；它有抗恶性黑素瘤和卵巢癌的活性。最大剂量是每天给 药30mg/m2连续5天或每3周给药210-250mg/m2。当然，所有这些剂量都是示范性的，并且 也预计到这些点之间的任何剂量也可以用于本发明。长春碱是植物生物碱的另一个例子， 它可以与曲格列酮联合使用用于治疗癌症和前期癌。当用长春碱培养细胞时，会发生微管 的解体。据报道在口服给予的长春碱或长春新碱后，会有出乎意料的吸收。在给予常规的 临床剂量后，血浆中每种药物的最高浓度大约为0. 4mM。长春碱和长春新碱结合于血浆蛋 白。它们广泛集中于血小板而在较低程度上存在于白细胞和红血球中。在静脉注射之后，长春碱有多种从血浆中清除的形式；在分配后，药物从血浆中消 失的半衰期大约为1和20个小时。长春碱在肝脏中被代谢为有生物学活性的衍生物去乙 酰长春碱。在胆汁分泌之后，大约15%的给药剂量会完整无损地在尿中检测出来，而10% 被回收到粪中。对于肝功能障碍的病人应该降低剂量。如果血浆胆红素的浓度大于:3mg/ dl (约50mM)，那么至少需减少50%的剂量。硫酸长春碱提供的形式是可用于注射的制品。该药物通过静脉注射给药；需要采 取特殊的预防措施来对抗皮下渗血，因为这会引起疼痛刺激和溃疡。不应将药物注射到循 环削弱的身体端部。在按体重给予单个剂量0. ;3mg/kg后，在7-10天内骨髓抑制达到其最 高值。如果不能获得白血球减少症的缓和水平(大约3000CellS/mm3)，每周的剂量可以按 体重以0. 05mg/kg的增值逐步提高。在设计用于治疗膀胱癌的疗法中，长春碱的使用剂量 为每3周0. 3mg/kg而不用考虑血细胞数或毒性。长春碱的最重要的临床应用是与博来霉素和顺氯氨钼一起用于治愈性治疗转移 性膀胱瘤。据报道在多种淋巴瘤中具有有利的应答，尤其是霍奇金氏症，在50-90%的该病 例中可以看到显著的改善。当疾病难以被烷基化试剂治愈时，长春碱在高比例的淋巴瘤中 的效力并不降低。它也对卡波济氏肉瘤、成神经细胞瘤、和莱特勒-西韦病(组织细胞增多病X)，以及女性的乳腺癌和绒毛膜癌起作用。长春碱的剂量是由临床医生根据每个病人的需要而确定。可以给予0. 1-0. 3mg/ kg或者也可以给予1. 5-2mg/m20选择性地，可以给予0. lmg/m2，0. 12mg/m2,0. 14mg/m2， 0. 15mg/m2,0. 2mg/m2,0. 25mg/m2,0. 5mg/m2，1. Omg/m2，1. 2mg/m2，1. 4mg/m2，1. 5mg/m2，2. Omg/ m2，2. 5mg/m2，5. Omg/m2，6mg/m2，8mg/m2,9mg/m2,1 Omg/m2, 20mg/m2。当然，所有的这些剂量都
是示范性的，并且也预计到这些点之间的任何剂量可以用于本发明。长春新碱阻断有丝分裂并且引起分裂中期停止。似乎很可能该药物的大部分生物 学活性可以由它能特异性结合于微管蛋白并阻断蛋白聚合到微管的能力而解释。通过破坏 有丝分裂器官的微管，细胞分裂就会停止在分裂中期。在有丝分裂中不能正确分离染色体 可能会导致细胞死亡。长春新碱对正常骨髓细胞和上皮细胞的相对低的毒性使该试剂在抗肿瘤药物中 与众不同，并且它通常与其他骨髓抑制剂联合使用。据报道在口服给予长春碱或长春新碱后，会有出乎意料的吸收。在给予常规的临 床剂量后，血浆中每种药物的最高浓度大约为0. 4mM。长春碱和长春新碱结合于血浆蛋白。它们广泛集中于血小板而在较低程度上存在 于白细胞和红血球中。长春新碱含有多种从血浆中清除的形式；其最终的半衰期大约M小时。该药物在 肝脏中被代谢，但是没有鉴定出其有生物学活性的衍生物。对于肝功能障碍的病人应该降 低剂量。如果血浆胆红素的浓度大于:3mg/dl (约50mM)，那么至少需降低50%的剂量。硫酸长春新碱可以溶液形式(lmg/ml)用于静脉注射。长春新碱与皮质类甾醇联 合使用是目前用于促使缓解儿童白血病可选的疗法；这些药物的最佳剂量看来是按体表面 积每周静脉注射长春新碱ang/m2，以及每天口服给予强的松40mg/m2。霍奇金氏症或非霍奇 金氏症淋巴瘤的成年病人通常接受长春新碱作为联合疗法的一部分。当在MOPP疗法中使 用时，长春新碱的推荐剂量是l.^ig/m2。白血病的儿童对高剂量的长春新碱的耐受性看起 来比成人好，成人可能会经受严重的神经毒性。比7天一次更频繁的给药或更高的剂量看 起来会提高毒性表现而在反应比率上并不成比例改善。在静脉注射给予长春新碱时，也应 该采取预防措施来避免渗血。在毒性类似的条件下，长春新碱(和长春碱)可以被输注到 肿瘤动脉供应血中的剂量比可以通过静脉注射给药的剂量高数倍。长春新碱在霍奇金氏症和其他淋巴瘤中有作用。虽然当它单独用于霍奇金氏症 时，它看起来比长春碱的效力稍微低一些，但是当与氮芥、强的松和甲基苄胼联合使用时 (所谓的MOPP疗法)，它是这些疾病晚期(III和IV)的首选疗法。在非霍奇金氏淋巴瘤中， 长春新碱是一种重要的试剂，尤其当与环磷酰胺、博来霉素、阿霉素和强的松联合使用时。 在淋巴细胞性白血病中，长春新碱比长春碱更有效。据报道在多种其他肿瘤的病人中具有 有利应答，尤其是维尔姆斯氏瘤，成神经细胞瘤，脑瘤，横纹肌肉瘤，和乳腺、膀胱以及男性 和女性的生殖系统癌症。长春新碱所使用的剂量是由临床医生根据每个病人的需要而确定的。可以给予 0. 01-0. 03mg/kg或0. 4-1. 4mg/m2，或者也可以给予1. 5-2mg/m20选择性地，可以持续静 脉输注给予 0. 02mg/m2，0. 05mg/m2,0. 06mg/m2,0. 07mg/m2,0. 08mg/m2,0. lmg/m2，0. 12mg/m2， 0. 14mg/m2,0. 15mg/m2,0. 2mg/m2,0. 25mg/m2。当然，所有的这些剂量都是示范性的，并且也预料到这些点之间的任何剂量可以用于本发明。喜树碱是一种源自中国的树喜树的生物碱。喜树碱及其衍生物有独特的能力，能 通过稳定称为“可剪切复合物”的共价反应中间产物，来抑制DNA拓扑异构酶，最终导致肿 瘤细胞死亡。普遍认为，喜树碱类似物呈现显著的抗肿瘤和抗白血病活性。由于其严重的 副作用和不良的水溶性，喜树碱在临床上的应用是有限的。目前，一些喜树碱类似物(托泊 替康；依连洛特肯)，不管是合成的还是半合成的，已被用于癌症治疗并且显示出令人满意 的临床效果。喜树碱的分子式是C2tlH16N2O4，分子量是348. 36。它以黄色粉末形式供应，并且 可以在DMSO IN氢氧化钠中溶解为50mg/ml的清澈的黄色溶液。如果储存在2-8 的干燥 密封避光的环境中，它可以至少稳定2年。亚硝基脲。亚硝基脲，与烷基化试剂一样，抑制DNA修复蛋白。它们被用于治疗非 霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑素瘤以及脑瘤。实施例包括亚硝基脲氮芥和环己亚 硝脲。亚硝基脲氮芥(无菌的亚硝基脲氮芥)是用于治疗特定肿瘤疾病的亚硝基脲中的 一种。它是1，3双(2-氯乙烷)-1-亚硝基脲。它是淡黄色冻干片或者冻干块，分子量为 214.06。它在酒精和脂类中的溶解度高，在水中难溶。建议亚硝基脲氮芥的给药是在其复 原后通过静脉输注给予。无菌的亚硝基脲氮芥通常以IOOmg单个剂量小瓶的冻干物质的形 式提供。虽然通常认为亚硝基脲氮芥烷基化DNA和RNA，但是它不交叉抵抗其他烷基化试 剂。与其他亚硝基脲一起，它也可以通过使蛋白中的氨基酸甲氨酰化而抑制多个关键的酶 促进程。现已表明，亚硝基脲氮芥可以单个试剂形式，或以与其他经认可的化学治疗剂一 起建立的联合疗法形式作为减缓疗法用于脑瘤如成胶质细胞瘤、脑干神经胶质瘤、成神经 管细胞瘤、星细胞瘤、室鼓膜瘤和转移性脑瘤的治疗。它也与强的松联合用于治疗多发性骨 髓瘤。已证明亚硝基脲氮芥在治疗霍奇金氏症和非霍奇金氏淋巴瘤上是有效的，并与其他 经认可的药物联合使用作为二次疗法治疗首次疗法后复发或对首次疗法不应答的的病人。亚硝基脲氮芥作为单个试剂在先前未经治疗的病人身上的推荐剂量是每6周静 脉注射150-200mg/m2。该给药可以作为单个剂量给予或分成每日注射如75-100mg/m，连 续注射2天。当亚硝基脲氮芥与其他骨髓抑制剂联合使用或使用于骨髓储备耗尽的病 人身上时，应该相应地调整剂量。应该根据病人对上述剂量的血液应答来调整初始剂量 后的剂量。当然应该理解的是其他剂量也可以用于本发明，例如10mg/m2，20mg/m2，30mg/ m2，40mg/m2，50mg/m2，60mg/m2，70mg/m2，80mg/m2，90mg/m2，或 100mg/m2。请专业技术人员参 考"Remington' s Pharmaceutical Sciences"第15版，61章。根据治疗的患者的情况， 剂量必须有所改变。人体对给药的反应在任何情况下会决定个体患者的适当剂量。环己亚硝脲是用于治疗特定的肿瘤疾病的亚硝基脲中的一种。它是1-(2-氯乙 烷)-3-环己基-1亚硝基脲。它是黄色粉末，化学式是C9H16ClN3O2，分子量是233. 71。环己 亚硝脲可溶于10%的乙醇(0. 05mg/mL)和纯乙醇(70mg/mL)中。环己亚硝脲在水中是相对 不溶的(< 0. 05mg/mL)。它在生理pH值下是相对非电离的。环己亚硝脲胶囊中的非活性 成分是硬脂酸镁和甘露醇。虽然普遍认为环己亚硝脲使DNA和RNA烷基化，但是它不交叉抵抗其他烷基化试剂。与其他亚硝基脲一起，它也可以通过使蛋白中的氨基酸甲氨酰化而抑制多个关键的酶 促进程。环己亚硝脲可以口服给药。在口服给予30mg/m2-100mg/m2剂量的放射性的环己亚 硝脲后，大约一半所给的放射性在M小时内以降解产物的形式分泌。代谢物的血清半衰期 为16小时-2天。在静脉注射给药15分钟后，组织水平与血浆水平是相当的。据报道，环己亚硝脲除了其他疗法外，可以作为单个试剂或以与其他经认可的化 学治疗剂一起建立的联合疗法的形式使用，用于治疗已接受适当外科治疗和/或放射疗法 程序的病人的原发性和转移性脑瘤。也已证实它与其他经认可的药物联合在二次治疗病人 的霍奇金氏症中有效，该病人在首次疗法后复发或对首次疗法不应答。环己亚硝脲作为单个试剂在成人和儿童中的推荐剂量是在先前未经治疗的病人 身上是每6周130mg/m2作为单个口服剂量。对于骨髓功能减弱的个体，其剂量应减至每6 周100mg/m2。当环己亚硝脲与其他骨髓抑制剂药物联合使用时，应该相应调整剂量。应当 理解的是其他剂量也可以使用，例如 20mg/m2，30mg/m2,40mg/m2, 50mg/m2,60mg/m2, 70mg/m2, 80mg/m2,90mg/m2,100mg/m2,120mg/m2或这些数据之间的任意剂量，这是由临床医生根据正 在治疗的个体的所需决定的。其他试剂。可以使用的其他试剂包括阿瓦斯汀、易瑞沙、艾比特思、硼替佐米和 格列卫。此外，生长因子抑制剂和小分子激酶抑制剂也在本发明中有用。在此将Cancer: Principles and Practice of Oncology(2001)中所描述的所有的疗法引入作为参考。也 包含以下的其他疗法。ii.免疫疗法免疫疗法通常依赖于对靶标使用免疫效应细胞和分子并且破坏癌细胞。免疫效应 分子可以是，例如，肿瘤细胞表面特定标记物的特异性抗体。单独的抗体可以作为治疗的 效应分子，或者它可以募集其他细胞来真正地实现细胞的杀伤。抗体也可以与药物或毒素 (化学疗法的、放射性核素、篦麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素，等等)结合并仅仅作为目 标试剂。选择性地，效应分子可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子 的淋巴细胞。各种效应分子细胞包括细胞毒素T细胞和NK细胞。因此，免疫疗法可以被用作联合疗法的一部分，与呼肠孤病毒或其他溶瘤病毒疗 法结合。在以下讨论联合疗法的常规步骤。通常，肿瘤细胞必须携带适用于锚定的特定标 记物，亦即，该标记物在大多数的其他细胞中不存在。肿瘤标记物有很多种，在本发明的内 容中这些标记物的任意一种都可以适用于锚定。常见的肿瘤标记物包括癌胚抗原、前列腺 特异性抗原、泌尿系统肿瘤相关抗原、胚胎抗原、酪氨酸酶(P97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液 酸化的路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erb B和pl55。此外， 感染呼肠孤病毒或另一种溶瘤病毒的肿瘤细胞或其他过度增生细胞会在细胞表面表达病 毒抗原，从而也使它们呈现出对免疫系统攻击的敏感性。肿瘤坏死因子是一种糖蛋白，该糖蛋白杀伤某些种类的癌细胞，激活细胞因子产 物，激活巨噬细胞和内皮细胞，促进胶原蛋白和胶原酶的产生，它是一种炎性介质也是感染 性休克的介质，并且促进分解代谢、发热和睡眠。一些感染性试剂通过TNF产生的刺激引起 肿瘤衰退。当以有效剂量单独使用时，TNF是非常有毒性的，因此最佳疗法可能将它以较低 的剂量与其他药物联合使用。它的免疫抑制作用可被Y-干扰素增强，因此联合疗法是有潜在危险的。TNF和干扰素-α的混合物也被发现具有抗癌作用。iii.激素疗法根据这里所描述的方法将性激素用于治疗癌症。虽然这里所描述的方法并不限于 特定癌症的治疗，激素的使用对乳腺、前列腺和子宫内膜(子宫的内膜)癌是有益的。这些 激素的例子有雌激素、抗雌激素、孕酮和雄激素。皮质留类激素在治疗某些类型的癌症(淋巴瘤，白血病和多发性骨髓瘤)上是有 效的。皮质留类激素可以提高其他化学治疗剂的效力，因此，它们经常被用于联合治疗中。 皮质留类激素的例子有强的松和地塞米松。iv.放射疗法放射疗法，也称为放射线疗法，是用电离辐射治疗癌症和其他疾病的方法。电离辐 射积存的能量通过破坏其遗传物质而毁坏或损坏被治疗的区域的细胞，使这些细胞不可能 继续生长。虽然放射线破坏癌细胞和正常细胞，但是后者能自身修复并且正确行使功能。放 射疗法可以被用于治疗局部化的实体瘤，如皮肤、舌、喉、脑、乳腺或子宫颈癌。它也可以被 用于治疗白血病和淋巴瘤(分别为血液形成细胞的癌症和淋巴系统的癌症)。依据本发明所使用的放射线疗法可以包括但不限于，对肿瘤使用Y-射线、X-射 线和/或将放射性同位素直接传递到肿瘤细胞。也可以考虑利用其他形式的DNA损伤因素， 如微波和UV照射。最有可能的是所有这些因素可对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及 染色体的组装和维持产生广范围的损伤。X-射线的剂量范围从长周期(3-4周)的每天用 50-200伦琴的剂量到2000-6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，其取 决于同位素的半衰期、发射的放射线的强度和种类，以及肿瘤细胞的吸收。放射疗法可以包括使用放射性标记的抗体来将放射线剂量直接传送到癌的位置 (放射免疫疗法)。抗体是高特异性蛋白，它是由机体对抗原(被免疫系统识别为外源物 质)存在的应答而产生的。一些肿瘤细胞包含特异性抗原，可引发肿瘤特异性抗体的产生。 大量的这些抗体可以在实验室制备并且结合于放射性物质(称为放射性标记的过程)。一 旦注入到机体中，抗体就会积极地找出癌细胞，通过放射线的细胞杀伤性(细胞毒性)作用 来破坏癌细胞。这种方法可以使健康细胞被放射线损伤的风险最小化。适形放射疗法跟常规的放射疗法一样使用相同的放射疗法仪器即线性加速器，但 是在X射线光束的通路上放置金属块来改变它的形状从而使其与癌的形状匹配。这就保证 给予肿瘤更高的放射线剂量。健康的周围细胞和附近结构接受较低剂量的放射线，所以副 作用的可能性就降低了。现已开发了一种称为多叶准直器的装置并且可以用作金属块的替 代物。多叶准直器包括一些固定于线性加速器上的金属片。可以调整每一片层从而使放射 疗法光束可以匹配治疗区域的形状而不需要金属块。放射疗法仪器的精确定位对于适形放 射疗法而言是非常重要的，并且在每次治疗的开始，可以使用一个特殊的扫描仪器来检查 你的内在器官的位置。高分辨率强度调制放射疗法也使用多叶准直器。在这种治疗中，当给予治疗时多 叶准直器的片层被去除。这一方法可能会使治疗光束的形状达到甚至更精确并且使放射疗 法的剂量在整个治疗区域保持恒定。虽然调查研究显示适形放射疗法和强度调制放射疗法可以减少放射疗法的副作 用，但是有可能如此精确定形治疗区域可以阻止刚好在治疗区域外微小的癌细胞被破坏。这就意味着使用这些专业的放射疗法技术会使癌症在未来复发的风险更高。立体定位放射 疗法被用于治疗脑瘤。这一技术从很多不同的角度来进行放射疗法，从而使进入肿瘤的剂 量非常高而影响周围健康组织的剂量非常低。在治疗之前，通过计算机分析多个扫描从而 确保放射疗法精确锚定，并且当接受放射疗法时，病人的头部被固定在一个特殊制造的框 架中。给予多个剂量。对脑瘤进行的立体定位放射手术(Y刀)不是使用刀，而是使用非常精确地靶定 的来自数百个不同角度的Y放射疗法光束。只需要一次放射疗法，大约需要四到五个小 时。对于这一治疗而言，会有一个特殊制造的金属框连接你的头部。然后进行多次扫描和X 射线来寻找需要治疗的精确的区域。在放射疗法中，病人躺卧并且他们的头部在一个大的 头盔中，头盔上有数百个洞从而使放射疗法光束能够通过。科学家也寻找提高放射线疗法效力的途径。他们研究了两种研究性药物对经受放 射线后的细胞的作用。放射增敏剂使肿瘤细胞被破坏的可能性更大，并且放射增敏剂会保 护正常组织免受放射线的影响。人们也研究了使用热量的高热疗法在使组织对放射线敏感 方面的效果。v.再行手术大约60%的癌症患者会经历某些类型的手术，包括预防性的、诊断性的或阶段性 的、治疗性的和减缓性的手术。治疗性手术治疗癌症，它可以与其他疗法结合，如本发明的 疗法、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或选择性疗法。治疗性手术包括切除术，在切除术中所有的或一部分的癌组织被物理去除、切除 和/或破坏。肿瘤切除术指物理去除至少部分肿瘤。除了肿瘤切除术外，手术治疗包括激 光手术、冷冻手术、电外科和显微控制手术(莫氏手术)。可以进一步预期到本发明可以与 浅表性癌，前期癌，或正常组织偶发量的去除联合使用。在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤之后，会在体内形成一个空腔。可以用另外 的抗癌疗法通过灌注、直接注射或局部涂敷该区域来完成治疗。这类治疗可以例如每1，2， 3，4，5，6 或 7 天，或者每 1，2，3，4 和 5 周或者每 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11 或 12 月重复一 次。这些治疗也可以使用不同的剂量。


以下附图形成本发明的一部分并且被包括用于进一步论证本发明的特定部分。通 过引用一个或多个附图并结合此处所示的特定实施例的详细描述可以使本发明更易于理解。图IA-B呼肠孤病毒和粘液瘤病毒优选感染P53-/-MEF和ATM缺损的L3。(图1A) 用40M0I的WT/AV呼肠孤病毒或5M0I的表达GFP的粘液瘤病毒(Myx_GFP，是MYXV的洛 桑(ATCC)毒株的GFP表达版本，该描述参见(Johnston et al，2003))感染p53_/_MEF和 p53+/+MEF(分别为p53敲除或p53野生型的鼠胚胎成纤维细胞)。感染3天后，对细胞进 行固定/渗透并且使用呼肠孤病毒抗血清和第二 FITC抗血清通过FACS对其进行分析。结 果显示野生型和减毒型呼肠孤病毒均可以优选感染P53-/-MEF。对于粘液瘤病毒感染的研 究，感染细胞M小时后在相位对比显微镜和荧光显微镜下进行观察。表达GFP的细胞呈现 粘液瘤病毒感染。Mock 模拟感染。(图1B)用40M0I的WT/AV呼肠孤病毒或5M0I的粘液瘤病毒(Myx-GFP)感染BT (ATM正常的类淋巴母细胞C3ABR细胞；Kozlov et al，2003)和 L3 (ATM缺陷的类淋巴母细胞细胞；Kozlov et al，2003)。感染3天后，对细胞进行固定/渗 透并且使用呼肠孤病毒抗血清和第二 FITC抗血清通过FACS对其进行分析。结果显示野生 型和减毒型呼肠孤病毒均可以优选感染P53-/-MEF。对于粘液瘤病毒感染的研究，感染细胞 48小时后在相位对比显微镜和荧光显微镜下进行观察。表达GFP的细胞呈现粘液瘤病毒感 染。C35ABR(B3)和L3细胞系分别是由MLavin博士 (昆士兰州医学研究所)和Y Shiloh 博士(台拉维夫大学)友情提供。Mock 模拟感染。图2A-C呼肠孤病毒和粘液瘤病毒优选感染p53和ATM功能障碍的人类淋巴瘤。 (图2A)p53和ATM缺陷增强了对顶刺激的应答。用2Gy电离辐射套细胞淋巴瘤(Granta， HBL-2(p53 突变，Turker et al, 2006) Z138C, JVM-2))和伯基特淋巴瘤(Raji 和 Ramos) 2 小时然后收获细胞。用NET-N裂解缓冲液(1%ΝΡ-40)处理制备全细胞裂解液，随后是 超声破碎。然后将50 μ g蛋白进行8%或10% SDS-PAGE，将其转至硝酸纤维素膜并且用 标记抗体进行探测(Phospho-ATM，pSerl981 ATM 和 Phospho_p53，pSerl5 和 p53 购自 Rocklandlmmunochemicals for Researchand Cell Signaling ;ATM 特异性兔多克隆抗体 4BA是由M Lavin博士友情赠送)。BT和L3细胞作为对照。(图2B)p53和ATM应答正常 细胞(BT，Z138C，JVM-2，Ramos)，和 p53 和 / 或 ATM 应答功能障碍细胞(L3，HBL-2，Grant, Raji)对呼肠孤病毒和粘液瘤病毒的病毒敏感性图示。1 ；对病毒敏感。O ；对病毒有抵抗力。 应答正常的细胞对病毒感染有抵抗力而应答功能障碍的细胞对病毒感染敏感。(图2C)用 40M0I的WT/AV呼肠孤病毒或5M0I的粘液瘤病毒(Myx-GFP)感染细胞。先前的研究显示 Raji细胞对呼肠孤病毒是敏感的而Ramos细胞对呼肠孤病毒是有抵抗力的(Alain et al, 2002)。感染3天后，将细胞固定/渗透并且使用呼肠孤病毒抗血清和第二 FITC抗血清通 过FACS对其进行分析。结果显示呼肠孤病毒和粘液瘤病毒均优选感染p53和/或ATM不 应答的淋巴瘤。对于粘液瘤病毒感染的研究，感染细胞48小时后在相位对比显微镜和荧光 显微镜下进行观察。表达GFP的细胞呈现粘液瘤病毒感染。Mock:模拟感染。图3呼肠孤病毒和粘液瘤病毒感染成视网膜细胞瘤细胞。用40M0I的WT/AV呼肠 孤病毒或5M0I的粘液瘤病毒(Myx-GFP)感染成视网膜细胞瘤细胞(Y79和TORI_Rb_l，购自 ATCC)。在感染特定天数后，将细胞固定/渗透并且使用呼肠孤病毒抗血清和第二 FITC抗 血清通过FACS对其进行分析。对于粘液瘤病毒感染的研究，感染细胞48小时后在相位对 比显微镜和荧光显微镜下进行观察。表达GFP的细胞呈现粘液瘤病毒感染。Mock:模拟感染。
具体实施例方式以下实施例用于示范本发明的优选实施例。本领域技术人员应当认识到以下实施 例中公开的技术代表发明人所揭示的技术，在本发明的操作中运作良好，因此可以考虑将 其用于制定操作的优选方案。然而，在本公开文本的指引下，本领域技术人员应当认识到， 在没有偏离本发明的精神和范围之下，在已公开的特定实施例中可以进行许多改变并仍能 获得相同或相似的结果。实施例1-材料和方法细胞系。p53+MEF、BT、和ATM缺陷的L3细胞，以及人淋巴瘤HBL2、Granta、Z138C、Raji, Ramos和JVM2细胞，以及眼癌细胞系(Y-19和WERI-Rb-Ι)是购自American Type Culture Collection。细胞维持在 RPMI 1640，10% FBS 中。野生型和减毒型呼肠孤病毒的制备。用于这些研究的野生型呼肠孤病毒T3D毒株 在细胞中繁殖并根据之前所述进行纯化。除了 AV呼肠孤病毒是在HT10801和细 胞中繁殖之外，纯化源自HTRl培养基的减毒型呼肠孤病毒的方法与制备野生型呼肠孤病 毒的方法相同，。将5-10 MOI的呼肠孤病毒加入到细胞中并且在37°C维持48-72小时。在 观察到病毒溶瘤作用(典型地20-30%细胞裂解)之后，从沉降的细胞中纯化病毒。用SW41 转头以35，OOOrpm对病毒进行CsCl离心7-8小时。收集分层的病毒并且用150mM NaCl， 10mMMgC12，和IOmM Tris (pH 7.幻对其进行广泛透析。为进行野生型呼肠孤病毒的滴定， 将HEK 293细胞铺于6孔板上，每孔为&105个细胞。在37°C吸附2小时后，去除接种物。 然后用的琼脂和新鲜培养基覆盖细胞单层。感染5-7天后计算空斑数。为进行减毒型呼肠孤病毒的滴定，除了在感染5-7天后去除琼脂并且用细胞固定 /渗透试剂盒(BD Bioscience)将细胞单层固定/渗透，以便用呼肠孤病毒的抗血清和第 二 FITC抗体对其进行免疫染色之外，其余步骤与野生型的相同。通过免疫荧光检测鉴定AV 呼肠孤病毒的空斑。选择性地，对于减毒型呼肠孤病毒，也在细胞上进行常规的空斑 实验。感染后3天，琼脂用中性红覆盖，并且在空斑形成M小时后检测细胞单层。对于从 HT1080和HTRl感染的上清液中收集的减毒型呼肠孤病毒而言，要使用35，OOOrpm的高速超 速离心来使病毒沉降。粘液瘤病毒的制备。使用粘液瘤病毒(洛桑毒株)的Myx-GFP进行感染研 究，Myx-GFP是由基因内插入绿色荧光蛋白(GFP)表达盒而产生的，该表达盒由合成的 牛痘病毒早/晚期启动子驱动。通过如前所述的在BGMK细胞上集中形成来繁殖和滴定 Myx-GFP(Opgenorth et al，1992)。FACS分析。对于流式细胞仪分析，用细胞固定/渗透液(PharMingen，San Diego, CA)来使细胞胰蛋白酶化并且固定。将此已固定和渗透的细胞与第一呼肠孤病毒抗血清和 第二 FITC共价的抗兔IgG(Cedarlan^Ontario) —起温育，然后通过流式细胞仪进行分析。实施例2-结果呼肠孤病毒和粘液瘤病毒优选感染p53或ATM缺陷的细胞。为了检测肿瘤抑制 基因的调节是否影响溶瘤病毒的敏感性，发明人选择了在多种癌症中经常会突变的P53和 ATM肿瘤抑制基因。p53是原癌抑制基因并且在多种癌细胞中突变最频繁，据报道50%以 上的癌症保留P53突变(White，1994 ;Morris，2002)。ATM(共济失调毛细血管扩张症突 变的)是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，在DNA损伤时被激活。在共济失调毛细血管扩张症 中ATM基因的两个拷贝均为功能障碍，共济失调毛细血管扩张症是一种罕见的综合症，表 现为癌症倾向性、辐射敏感性和神经退行性变(Kitagawa et al，2005)。因此发明人使用 P53-/-MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)和ATM缺陷的L3淋巴样干细胞(Kozlov et al，2003)来 检测溶瘤病毒的敏感性。如图IA-B所示，通过FACS或显微镜检测荧光阳性的细胞(FITC+ 或GFP+的细胞)显示，相对于MEF (p53正常)和BT (ATM正常)的对照细胞而言，呼肠孤病 毒(WT和AV呼肠孤病毒；Kim et al，2007)和粘液瘤病毒均优选感染p53"lffiF或L3 (ATM 缺陷)的细胞。呼肠孤病毒和粘液瘤病毒优选感染p53或ATM功能障碍的人类淋巴瘤。由于呼肠孤病毒和粘液瘤病毒优选感染P53或ATM缺陷的细胞，发明人随后检测了呼肠孤病毒和粘 液瘤病毒能否优选感染携带P53或ATM缺陷的人类淋巴瘤。发明人测试了 6种淋巴瘤(HB L-2，Granta, Z138C，JVM2，Raji和Ramos)，在面对基因毒性攻击时，这些淋巴瘤呈现来自 P53和ATM依赖性通路的不同的细胞应答(图2A)。通过顶辐射和用western印迹检测 P53和ATM的磷酸化来鉴定p53和ATM的功能状态。BT (ATM正常)和L3 (ATM缺陷)被用 作由顶引发的ATM应答的对照。HBL-2和Raji对基因毒性的应激呈现p53功能障碍性应 答，这由P53的15位丝氨酸的构成性磷酸化所证明(Liet al,2006)(图2A)。Granta细胞 对基因毒性的应激呈现ATM功能障碍性应答并且在电离辐射(IR)刺激下ATM不被激活(图 2A)。在Z138C，JVM2和Ramos细胞的案例中，p53和ATM对基因毒性应激的应答正常，如由 IR刺激引起的P53和ATM的高度磷酸化所示(图2A)。有趣的是，通过FACS或显微镜检测 荧光阳性的细胞(FITC+或GFP+的细胞)显示，相对于ATM-和p53-应答的淋巴瘤(Z183C， JVM-2, Ramos)而言，p53和/或ATM功能障碍性淋巴瘤(HBL2, Granta,和Raji)-即当IR 刺激时，HBL-2和Raji呈现构成性的p53激活，而Granta呈现ATM缺陷-对呼肠孤病毒和 粘液瘤病毒感染是优选敏感的(图2C)，。如图2B所示，细胞的ATM或p53的功能障碍性应 答是与呼肠孤病毒和粘液瘤病毒的敏感性高度相关的。这强有力地证明P53和ATM均参与 建立细胞对病毒感染的抵抗力，而基因或其应答通路的缺损会赋予其病毒敏感性(图2A)。眼癌细胞对呼肠孤病毒和粘液瘤病毒的感染是敏感的。因为呼肠孤病毒和粘液瘤 病毒优选感染P53和ATM功能障碍癌细胞，发明人也检测了 RB缺损的癌细胞是否也连带对 呼肠孤病毒和粘液瘤病毒的感染敏感。如图3所示，通过FACS或显微镜检测荧光阳性的细 胞(FITC+或GFP+的细胞)显示，两种不同的人类眼癌细胞对呼肠孤病毒和粘液瘤病毒的 感染是敏感的。两种细胞均含有缺损的Rb基因(Reid et al.，1974)。氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺氺根据目前公开的内容，这里所公开和要求保护的所有方法均可进行和完成，而不 用进行过度的实验。虽然根据优选实施例描述了本发明的组合物和方法，显而易见，对于本 领域的技术人员而言，在不偏离本发明的内容、精神和范围的情况下，可以对这里所描述的 方法以及其步骤或方法中步骤的次序进行改变。更特别地，显而易见，只要得到相同或相似 的结果，在化学上和生理学上均相关的特定试剂可以替代这里所描述的试剂。所有这类相 似的替代物和变体对本领域技术人员而言显而易见应认为是在如所附的权利要求定义的 本发明的精神、内容和范围内。参考文献以下参考文献特在此引入作为参考，它们在某种程度上为这里所阐明的内容提供
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权利要求
1.一种确定过度增生紊乱是否对溶瘤呼肠孤病毒和/或粘液瘤病毒敏感的方法，包括(a)提供过度增生细胞；(b)测定源自所述的过度增生细胞的p53，Rb，和/或ATM基因或基因产物的结构、功能 或表达；以及(c)比较所述过度增生细胞的上述结构、功能或表达与野生型的p53，Rb，和/或ATM基 因或基因产物的结构、功能或表达，其中p53，Rb，和/或ATM在结构、功能或表达上的缺陷表明上述的过度增生紊乱对呼 肠孤病毒或粘液瘤病毒的溶瘤作用是敏感的。
2.如权利要求1的方法，进一步包括治疗病人，该病人是获得所述的过度增生细胞的 来源。
3.如权利要求2的方法，其中疗法包括呼肠孤病毒疗法。
4.如权利要求3的方法，其中所述的呼肠孤病毒疗法是野生型呼肠孤病毒疗法。
5.如权利要求3的方法，其中所述的呼肠孤病毒疗法是减毒型的呼肠孤病毒疗法。
6.如权利要求5的方法，其中所述的减毒型呼肠孤病毒疗法使用一种Ol衣壳蛋白表 达缺损、σ 1衣壳蛋白检测不到或无σ 1衣壳蛋白的呼肠孤病毒。
7.如权利要求3的方法，其中治疗包括用所述的呼肠孤病毒疗法来对来自所述的病人 的骨髓细胞进行间接体内治疗。
8.如权利要求3的方法，其中治疗包括对所述的病人给予所述的呼肠孤病毒疗法。
9.如权利要求7的方法，进一步包括用第二次抗过度增生疗法接触所述的骨髓细胞。
10.如权利要求8的方法，进一步包括对所述的患者给予第二次抗过度增生疗法。
11.如权利要求9或10的方法，其中所述的第二次抗过度增生疗法是化学疗法、放射疗 法、激素疗法、基因疗法或免疫疗法。
12.如权利要求3的方法，其中治疗包括用p53、Rb或ATM功能或表达的抑制剂的疗法。
13.如权利要求12的方法，其中所述的抑制剂是蛋白或肽、抗体、siRNA、反义分子、核 糖酶或小分子。
14.如权利要求2的方法，其中治疗包括粘液瘤病毒疗法。
15.如权利要求2的方法，其中治疗包括非病毒性抗过度增生疗法。
16.如权利要求15的方法，其中所述的非病毒性癌症疗法是化学疗法、放射疗法、激素 疗法、基因疗法或免疫疗法。
17.如权利要求1的方法，其中所述的过度增生细胞是恶性细胞或良性细胞。
18.如权利要求1的方法，在步骤(a)之前进一步包括从病人身上获得所述的过度增生 细胞。
19.如权利要求1的方法，其中测定表达包括Northern印迹、Western印迹、免疫组织 化学、RT-PCR、微阵列分析、转录组分析、蛋白质组分析或代谢组分析。
20.如权利要求1的方法，其中测定结构包括测序、原位杂交、免疫组织化学或结构蛋白组学。
21.如权利要求1的方法，其中测定功能包括测定p53、Rb或ATM下游靶标的表达或活性。
22.治疗病人过度增生紊乱的方法，包括(a)用p53、Rb或ATM功能或表达的抑制剂接触过度增生细胞；以及(b)用呼肠孤病毒或粘液瘤病毒疗法接触所述的过度增生细胞。
23.如权利要求22的方法，其中所述的病人用呼肠孤病毒疗法治疗。
24.如权利要求23的方法，其中所述的呼肠孤病毒疗法是野生型呼肠孤病毒疗法。
25.如权利要求M的方法，其中所述的呼肠孤病毒疗法是减毒型呼肠孤病毒疗法。
26.如权利要求25的方法，其中所述的减毒型呼肠孤病毒疗法使用一种Ol衣壳蛋白 表达缺损、σ 1衣壳蛋白检测不到或无σ 1衣壳蛋白的呼肠孤病毒。
27.如权利要求22的方法，其中所述的病人是用粘液瘤病毒疗法治疗。
28.如权利要求22的方法，其中治疗包括对来自所述的病人的骨髓细胞进行间接体内 治疗。
29.如权利要求22的方法，其中治疗包括对所述病人进行体内治疗。
30.如权利要求观的方法，进一步包括用第二次抗过度增生疗法接触所述的骨髓细胞。
31.如权利要求四的方法，进一步包括对所述的病人给予第二次抗过度增生疗法。
32.如权利要求30的方法，其中所述的第二次抗过度增生疗法是化学疗法、放射疗法、 激素疗法、基因疗法或免疫疗法。
33.如权利要求31的方法，其中所述的第二次抗过度增生疗法是化学疗法、射疗法、激 素疗法、基因疗法或免疫疗法。
34.如权利要求22的方法，其中所述的过度增生细胞是恶性细胞或良性细胞。
全文摘要
本发明涉及使用溶瘤病毒如呼肠孤病毒和粘液瘤病毒来治疗癌症的方法。特别地，本发明建立于肿瘤抑制因子异常的癌细胞比含正常或“野生型”肿瘤抑制因子的细胞对溶瘤病毒的感染更敏感这一发现的基础上。特别地，有关p53、Rb和ATM的缺失均会赋予癌细胞对溶瘤病毒疗法的敏感性。
文档编号G01N33/50GK102124335SQ200980126543
公开日2011年7月13日 申请日期2009年5月22日 优先权日2008年5月22日
发明者曼博克·基姆, 雷纳尔·N·约翰斯顿 申请人:曼博克·基姆, 雷纳尔·N·约翰斯顿