专利名称：分枝杆菌感染的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及分枝杆菌感染并且提供副结核病(Johne's disease)的病原体鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) (Map)感染的诊断方法，以及用在这种诊断中的试剂盒和疫苗。
背景技术：
副结核病，或副结核 ，是由Map引起的动物的致命慢性肉芽肿性小肠炎。所述疾病的特征在于严重消瘦，身体状况损失和在一些种类中是腹泻。所述疾病主要通过摄食来自感染动物的粪便而传播。感染动物还可以在初乳或乳中传递感染并且跨越胎盘将感染传递给未出生的动物。一般相信的是，年幼动物比成体更易于感染。在感染以后，存在2至4年的长潜伏期，在所述潜伏期期间内动物可以不显示临床疾病病征并且可以间歇地散布Map。 这种动物经常描述为“亚临床感染的，，并且作为所述疾病的“携带者”。所述疾病通常通过购买亚临床感染的群体而引入到农场。副结核病在世界范围内发生并且通过成年动物的生产力降低、消耗增加以及控制、监控和诊断的成本而导致相当大的经济损失。关于Map是否涉及局限性回肠炎 (Crohn' s disease)的发展还存在某些争论。污染的乳将构成感染源并且存在对于从食品链消除Map的驱动力。副结核病的诊断是有问题的并且没有可以检测所述疾病的所有阶段的单一诊断试验。亚临床感染的动物是特别难以诊断的并且现行试验的结果可能是阴性的。最通常使用的诊断试验是血清酶联免疫吸附测定(ELISA)。这检测感染动物中对于Map的循环抗体。 它将检测其中通常出现临床症状的所述疾病后期阶段中的动物，其一般是散布大量Map的那些。然而，它不会检测感染早期的动物，典型地是亚临床的，其中抗体水平在试验的灵敏性阈值以下。其它最普遍使用的试验是粪便涂片和细菌学培养。粪便涂片检测粪便中耐酸细菌的存在并且很可能仅检测兽群/鸟群中感染动物的三分之一。细菌学培养是更灵敏的和特异性的，但是要花费6周以上，不太合乎需要。而且，低散布者有时可能难以检测，并且亚临床感染的动物经常被遗漏，因为它们间歇地散布。基于PCR的试验至今还没有常规使用，但是可用于检测乳、血液或粪便中的Map。 关于将PCR试验施用到乳、血液和粪便样品也存在特殊的问题。因此，对于可以检测早期感染和亚临床感染的动物的试验存在需要。本发明的目的之一是避免和/或减轻上述缺点的至少一种。发明概述本发明是基于能够引起细胞介导的免疫反应的Map抗原的鉴定。第一方面提供检测对于动物中一种或多种纯化的Map抗原的细胞介导的免疫反应的方法，所述方法包括下列步骤通过测定响应于所述一种或多种纯化的Map抗原的淋巴细胞激活和/或增殖的程度检测细胞介导的免疫反应。例如，通过使用抗体或通过RT-PCR或微列阵间接从mRNA检测细胞因子如干扰素Y (IFN-Y)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、转化生长因子β (TGF-β)、白介素(IL-2，IL-6， IL-10, IL-12，IL-17)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平，可以测定细胞_介导的免疫反应。可以通过将DNA或蛋白质的标记前体结合到经历增殖的淋巴细胞中而检定增殖。所述方法可以在从受试者分离的血样或其级分上进行，或可以是皮肤试验，诸如迟发超敏皮肤试验。 便利的是，血样是从待测试的动物获得的全血样品。备选地，可以采用包括淋巴细胞和单核细胞的全血的纯化或半纯化级分。测试所需的典型样品量可以是10μ 1至10ml。 有利地，单血样将可以测试动物对于各式各样抗原的响应性并因此诊断其它疾病。应当理解，血样一般将与所述一种或多种纯化的Map抗原温育一段时间(例如1 分钟至96小时，但是典型地是4至72小时)以便容许任何细胞介导的反应(例如IFN- γ 产生)，作为所述一种或多种纯化的Map抗原显现的结果。IFN-Y是从血样中存在的T细胞产生的，将其用所述一种或多种纯化的Map抗原刺激以产生IFN- γ。不像已知的使用未表征的称为“纯化蛋白质衍生物”(PPD)或“原生质抗原”(PPA) 用于检测被例如鸟分枝杆菌和/或结核分枝杆菌感染的动物的其它类似的细胞介导的测试，本发明是基于预期是特异性的纯化抗原的应用。本文将Map特异性抗原定义为蛋白质或其片段，所述蛋白质或其片段是由Map表达并且在被Map感染的动物中引起的免疫反应要大于由被其它密切相关的鸟分枝杆菌亚种(Mycobacterium avium)(鸟分枝杆菌鸟亚种 (Mycobacterium avium subsp. avium)禾口鸟分枝杆菌森林土壤亚禾中(Mycobacterium avium subsp. silvaticum))的动物引起的免疫反应。以这样的方式，本方法可以在暴露于其它分枝杆菌感染(包括环境分枝杆菌)的动物或动物群上进行，以便可以获得明确区别。因而， 将通常选择本发明的一种或多种Map特异性抗原，以便对于Map是高度特异性的和/或与其它相关的种类诸如鸟分枝杆菌的其它亚种、牛分枝杆菌和/或结核分枝杆菌不显示或几乎不显示交叉-反应性。所述一种或多种纯化的Map特异性抗原可以经由电泳分离Map分离株(isolate) 的蛋白质组并且将这与高度相关的分枝杆菌种类诸如鸟分枝杆菌鸟亚种进行比较而鉴定， 以便鉴定对于Map是独特的和/或差异表达的蛋白质。可以使用本领域众所周知的2-D凝胶电泳技术(见例如，RichardSimpson-蛋白质和蛋白质组学由冷泉港实验室出版社出版的实验室手册，美国2002)和与其它亚种的蛋白质组比较的Map分离株的蛋白质组进行典型电泳分离。以这样的方式，可以鉴定独特的和/或差异表达的蛋白质用于进一步研究并且用作根据本发明的抗原。以这样的方式，本发明的发明人已经鉴定了超过30种蛋白质，其可以单独地和/ 或组合地用于本发明的方法。所述蛋白质的细节可以在附表1中找到。优选地，本发明的方法使用两种或多种Map特异性抗原，诸如3、4、5、6或更多种抗原。应当理解，纯化抗原可以是整个蛋白质，或免疫原性蛋白质片段。这样的免疫原性蛋白质片段必须能够引起细胞介导的免疫反应。一旦整个蛋白质已经鉴定为能够引起适当的细胞介导免疫反应，则容易产生所述蛋白质的蛋白质片段并且鉴别适合的片段是否也能够引起细胞介导的免疫反应。本文中鉴定了四种特别优选的Map蛋白质是MAP0268C、MAP 1297、MAP 1365和 MAP3651c,并且分别对应于具有下列NCBI数据库登记号的蛋白质，AAS02585、AAS03614、AAS03682和AAS06201，其中一种或多种可以用于本发明。上述登记号鉴定的序列是来自 Map分离株K-IO (Li等2005)并且显示在图5_8中。应当理解，可以鉴定一个Map分离株与另一个Map分离株在蛋白质序列方面的微小差异，并且因而本文中鉴定的蛋白质在序列上可以不必与在蛋白质数据库中鉴定的相应的Map K-IO蛋白质相同。然而，本领域技术人员将能够容易地确定蛋白质是否相互对应。在这方面，本发明的Map特异性蛋白质或其免疫原性片段将与图5-8中所示的Map K-IO蛋白质或片段至少95%、98%或99%相同。本发明扩展至通过克隆和在宿主细胞诸如大肠杆菌中表达，从细菌或真核表达系统中纯化重组Map特异性蛋白质的方法(见例如，Sambrook.分子克隆实验室手册(第三版)，冷泉港实验室出版社)。在另一个方面中，本发明提供一种或多种纯化的Map特异性蛋白质或其免疫原性片段在诊断动物中的Map感染的方法中的用途。所述Map特异性蛋白质或其免疫原性片段优选是本文中鉴定的一种或多种蛋白质，诸如名称为MAP0268c、MAP1297, MAP1365和MAP3651c的那些或其免疫原性片段；或显示具有与如图5-8所示蛋白质或其片段的实质同一性的蛋白质或蛋白质片段。还提供用于进行Map感染的诊断方法的试剂盒，所述试剂盒包括能够引起细胞介导的免疫反应的一种或多种纯化的Map特异性蛋白质或其免疫原性片段。这样一种试剂盒可以进一步包括在诊断方法中使用的其它试剂，诸如抗-IFN-Y抗体。本发明还提供可以用于防止动物、特别是牲畜感染MAP的疫苗和免疫原性制剂。 在一个方面中，本发明提供本文所描述的一种或多种MAP抗原(或其片段，类似物或衍生物)用于激发动物中的免疫反应。在还有的进一步的方面中，本发明提供包括本文所描述的一种或多种MAP抗原 (或其片段、类似物或衍生物)的免疫原性制剂。在一个实施方案中，本文所描述的疫苗和免疫原性制剂包括本文所描述的两种或多种MAP抗原(或其片段、类似物或衍生物)的组合。本领域技术人员将理解，适合用作疫苗类型的免疫原性制剂可以配制成口服或局部施用。另外地或备选地，免疫原性制剂可以配制成直接注射，优选腹内注射或肌肉注射。本发明还提供针对MAP感染给动物接种疫苗或免疫动物的方法，所述方法包括施用本文所描述的一种或多种MAP抗原(或其片段、类似物或衍生物)的步骤。在一个实施方案中，本发明可以扩展到用于保护动物免受由Map引起或促成的疾病发展的疫苗、免疫原性组合物和方法。这样的疾病可以包括，例如，副结核病。在其它实施方案中，本发明提供的疫苗和免疫原性制剂可以不必防止Map感染，而可以减少疾病的进展，宿主生物中Map建群水平和/或由Map引起或促成的疾病症状的严重性。发明详述现在将通过实施例并且参考附图来描述本发明，所述附图显示
图1显示IFN-γ ELISA的结果，其显示对于单个的亚临床Map感染的绵羊(P7、 P33、W363、W395、PC212、(^69)与对照动物(724A、3^A、463A、307A)相比的 Map 特异性蛋白质的细胞介导的免疫反应。图2显示图1中的数据图，其显示在感染组和对照组中对于Map特异性蛋白质的细胞介导的免疫反应之间的相对差异，具有原始平均值和标准误差；
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图3显示Map K_10分离株蛋白质(AAS02588)的蛋白质序列，对应于本发明的 MAP0268c ；图4显示Map K_10分离株蛋白质(AAS03614)的蛋白质序列，对应于本发明的 ΜΑΡ1297 ；
图5显示Map K_10分离株蛋白质(AAS03682)的蛋白质序列，对应于本发明的 MAP 1365 ；和图6显示Map K_10分离株蛋白质(AAS06201)的蛋白质序列，对应于本发明的 MAP3651c。图7显示使用Map特异性抗原的混合物(cocktai 1 s)的刺激增强。将血液用 113. 8μ g/ml 的重组 3651c、125y g/ml 的 1365 和 113. 8μ g/ml 的 3651c 加 65 μ g/ml 的 1365的混合物刺激。Bovigam IFN-γ ELISA响应于抗原，表示为产生的IFN-γ的皮克数。 PC12和W63是从天然Map感染得到的亚临床绵羊副结核病例。图8显示Map实验感染的和未感染的牛犊对于抗原(终浓度4 μ g/ml)的Bovigam IFN-γ ELISA反应，表示为光密度(OD)。对于每个牛犊组的一式两份样品计算平均0D。注意，将Map感染的牛犊用文中所给出的三种不同浓度的Map接种。图9显示与Maa感染的牛犊相比较，Map感染的牛犊对于重组3651c的细胞介导的免疫反应的特异性。将血液用7. 3 μ g/ml的重组3651c,4 μ g/ml PPDA和2 μ g/ml PPDJ 刺激。还没有对诊断测定优化抗原浓度。响应于抗原的Bovigam IFN-γ ELISA表示为光密度(OD)。对于每个牛犊组的一式两份样品计算平均OD ；Maa感染的，η = 6, Map感染的，η =2。实施例部分随后的方法和表1对应于本发明的发明人提交到临床和疫苗免疫学(Clinical and Vaccine Immunology) (Hughes, V. , Bannantine, J. P, Denham, S.等，2008)的论文中描述的信息，其著作权应当承认。微生物菌株的来源和生长最初从具有临床副结核的鹿分离Map菌株(JD88/107)。它是分枝杆菌素依赖的并且是IS900阳性的。最初从鹿分离鸟分枝杆菌鸟亚种菌株(JD88/118)并且是IS901阳性的。如Hughes等(2007)中所描述，进行分枝杆菌的常规繁殖和维持。对于繁殖用于蛋白质组分析的分枝杆菌，通过将1全环分枝杆菌(来自具有汇合生长的7H11斜面)接种到 IOml体积的补充有10% (体积)MiddlebrookOADC 0. 1% (重量/体积)吐温_80、2 μ g/ ml分枝杆菌素J和2. 5% (体积)甘油的Middlebrook 7H9培养基中而启动起子培养。在多位置低热传递磁性搅拌器上使用磁性搅拌子连续搅拌50ml烧瓶中包含的培养物。在48h 温育以后，将3ml起子培养物转移到升瓶中的300ml预温的培养基中。在连续搅拌情况下将培养物在37°C温育并通过600nm的光密度(OD)监控生长，如由Hughes等(2007)所描述。当认为培养已经达到指数或稳定期并且实现OD至少为1时，将它们用Ziehl Nielsen染色和光学显微术评价污染。无菌移出50ml等分部分，在冰上冷却并然后离心(4000g，30min, 4°C )。将上清液倾出并将细胞沉淀小心再悬浮在25ml的冰冷PBS中。然后将细胞悬浮液再次离心(4000g， 30min,4°C )，除去上清液并将所述沉淀储存在-20°C。在蛋白质组分析的进一步处理以前， 将细胞沉淀储存不长于一周。用于2-D凝胶电泳的蛋白质制备 这基本如前所述(Hughes等2007)。简要地，将细胞(0. 2-0. 3g湿重)悬浮在2% (重量/体积)SDS，0. 04M Tris, 0. 06M DTT中。将悬浮液分层到洗涤过的0. Imm锆/ 二氧化硅珠(Biospec产品(Biospec Products)，巴特而斯维尔，Ok, USA)上。使用Fastpr印 120 (Qbiogene，剑桥，UK)以6. 5冲击/秒将混合物裂解六次，每轮之间将混合物在冰上冷却lmin。将得到的悬浮液离心(500g，30s，室温)以减少起泡。将上清液移液到微量离心管中并加热到100°C达5min。然后将其快速冷却并且离心(21000g，20min，在室温下)。将蛋白质提取物储存在-70°C直到需要。如 PlusOne 2—D 清洁试剂盒(Amersham Bioscience, Bucks, UK)所带的方案中所述，进行蛋白质清洁。清洁步骤后获得沉淀，将其制备用于基本如Hughes等2007所述的等电聚焦 (IEF)。立即使用可溶性蛋白质提取物或将其储存在-70°C。使用PlusOne Quant 试剂盒(Amersham Biosciences,Bucks,UK)测定蛋白质提取物的浓度并且如产品所附的规程中所述进行。由视觉评价加样到I-D SDS聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质来常规证实分析的结果。蛋白质组分析如前所述(Hughes等2007)进行蛋白质的IEF(150-200 μ g用于银染凝胶，或 300-500 μ g用于胶体考马斯亮蓝[CBB]染色凝胶)。将条带储存在_70°C直到需要或在第二维电泳之前平衡。将IEF条带在温和的摇动情况下在SDS平衡缓冲液(0. 05M Tris, 6M脲，0. 065M DTT, 30% (ν/ν)甘油，2% (w/v) SDS 和 0. 002 % (w/v)溴酚蓝)中温育 15min，然后在新鲜的等分部分的含有碘乙酰胺(0. 135M)的平衡缓冲液中进行类似的温育。使用Ettan Dalt 系统(Amersham Biosciences)将聚丙烯酰胺凝胶(26x20cm 12. 5% (w/v) ,Amersham Biosciences)进行电泳，Iff/凝胶，过夜，15°C。然后将功率增加至2-4W/凝胶直到染料前端在凝胶的底部Icm之内。使用Morrissey，1981描述的方法将凝胶用银染色，不同的是省略戊二醛固定(步骤2)；或使用Neuhoff等描述的方法将凝胶用胶态CBB染色。贞 _ Umax PowerLook III Imagescanner g Imagemaster Labscan v3. 01 软件(Amersham Bioscience, Bucks, UK)获得扫描的凝胶图像。随后使用Imagemaster Progenesis软件(非线性动态.Newcastle-on-Tyne，UK)进行图像分析和凝胶比较。对于每个单独的斑点，使用Marm-Whitney检验，评价Map和鸟分枝杆菌鸟亚种之间的中位数斑点体积的差异。因为进行许多检验，所以必需调节来自每个检验的P-值以便允许该多个检验。使用Benjamini和Hochberg，1995的假发现率(FDR)方法；用5%的FDR， 预期差异表达鉴定为5%的斑点将为假阳性。蛋白质的鉴定和质谱用15或30mm ‘斑点拣取机，(凝胶公司(The Gel Company)，旧金山，CA，美国)将所关心的蛋白质从凝胶中切除并且切成大致直径1至2mm的小片，不从斑点周围取过量凝胶。用0. IM碳酸氢铵，50% (体积/体积)ACN将凝胶片在室温下温育15分钟，至少更换三次，直到已经除去染色剂。最终用ACN 100% (体积/体积)对凝胶片脱水10分钟。除去ACN并且使用真空离心蒸发浓缩器(热电公司(Thermo Electron Corporation)，MA，美国)干燥凝胶片。将凝胶片在0. OlM DDT, 0. IM碳酸氢铵中再水化并且在56°C温育1小时， 接着用0. 055M碘乙酰胺，0. IM碳酸氢铵在室温下在黑暗中处理30分钟。将凝胶片用0. IM 碳酸氢铵，ACN 50% (体积/体积)洗涤，至少更换两次，在ACN 100%中脱水IOmin然后在真空离心蒸发浓缩器上干燥20分钟。使用胰蛋白酶溶液(在0.025M碳酸氢铵中IOng/ μ 1 ‘Promega测序级修饰的’)在37°C进行蛋白水解消化至少16小时。将蛋白质消化物 (0. 5 μ 1)与 0. 5 μ 1 含有 10mg/ml CHCA, 50 % (体积 / 体积)ACN, 0. 1% (体积 / 体积)TFA 的溶液混合，用于在Voyager-DE Pro质谱仪(PerS印tive生物系统有限公司(PerS印tive Biosystems Inc)，弗雷明汉，MA，美国)上的MALDI-T0F分析，选择600_5000Da的质量范围。首先在第一个脱水步骤之前，使用商业试剂盒(SilverQuest，Invitrogen, Paisley,UK)将银染色斑点褪色。全部随后的步骤与如上所述的用于CBB染色斑点的步骤相同。使用数据探索者(Data Explorer)以应用的曲线光滑函数以从原始数据产生峰值列表，信号对噪声的相关因子设置在0. 7并且用下列参数对数据进行基线矫正峰宽 32，柔性0.5和度数0.1。计算矩心处的峰高是50%并且峰值是去-同位素的。质谱的分辨率大于10，000，具有+/-0.01%的质量准确度。采用校准每个光谱的封闭外部方法 (close-external means)，而不是已知污染物离子(诸如角蛋白)排除法。生物信息学Map菌株K10(检索号NC_002944，AE016958)的蛋白质组含有用于编制蛋白质数据库的4350个预测的可读框，并且这是使用MaSCot2.0(基质科学公司(Matrix Science Ltd.)，伦敦，英国)(Perkins等，1999)查询的。胰蛋白酶裂解图谱的搜索使用IOOppm的片段离子质量准确度，选择脲基甲基修饰并且容许至多一个遗漏的裂解位点。使用该步骤鉴定的蛋白质是使用Entrez nr肽序列数据库(国家生物技术信息中心[NCBI])使用蛋白质-蛋白质BLAST程序表征的。将NCBI保守域搜索服务用于鉴别蛋白质查询序列中存在的结构域，并且将京都基因和基因组大全(http://www. keRR. com)用于鉴别相关的代谢途径。Map特异性序列的克隆和表达 通过使用pMAL_c2X载体(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，贝弗利， MA，美国)在大肠杆菌中产生30个Map预测编码序列的麦芽糖结合蛋白质(MBP)融合。从每个编码序列的阅读框设计引物并且在5'引物中包含XbaI位点并且在3'引物中包含 HindIII位点，用于克隆目的。通过使用AmpliTaq Gold聚合酶(应用生物系统(Applied Biosystems)，CA，美国)和Map基因组DNA作为模板，在之前描述的条件(Bannantine，等， 2002)下进行扩增。将载体和扩增产物用XbaI和HindIII消化。这些限制性DNA片段的连接导致在载体中的malE基因和所关注的阅读框之间的框内融合。在连接以后，将产物转化到大肠杆菌DH5 α中并且在含有100 μ g氨苄青霉素/ml的LB琼脂板上选择。(Bannantine等，2004) 基本上如pMAL 蛋白质融合和纯化系统说明手册(5. 1版，1/06)中所描述，有一些微小修改，制备重组蛋白质。将提取重组蛋白质的培养物在含有50 μ g/ml氨苄青霉素的培养基中培养。使用FastPr印FP 120 (速度5. 5，20秒，每轮之间在冰上冷却三次)在含有2%吐温-80和蛋白酶抑制剂混合物组III (Merck目录号539134)的柱缓冲液中进行大肠杆菌的裂解。从包含如上所述的用于Map重组蛋白质的亲代质粒pMAL_c2X的大肠杆菌DH5 α 或TBI制备MBP融合蛋白质，并且用作全部实验中的对照。来自该对照菌株的纯化蛋白质由LacZ α肽的MBP融合体组成(Bannantine等，2004)。绵羊外周血淋巴细胞的制备和刺激通过静脉穿刺收集20ml血液并将其放到含有无防腐剂的肝素的管中。将血液在638g离心(15分钟，15°C )。将血浆样品除去并储存在-20°C直到用ELISA分析。将血沉棕黄层除去并与IOml的HanksAfep缓冲液(Hanks平衡盐溶液，w/o Ca2+ 或Mg2+，含有肝素[Sigma-Aldrich，普尔，英国])混合，并且然后将这个在IOml的 Lymphopi^p (Axis-Shield，奥斯陆，挪威)上分层并在1133g离心(30min，15°C )。抽出淋巴细胞带，用15ml的HanksAfep溶液稀释，并在238g离心(lOmin，4°C )。将淋巴细胞沉淀再悬浮在Iml裂解缓冲液(1份Tris 9份0. 83%氯化铵，pH7. 2)中并在冰上温育10分钟。添加9ml的HanksAfep并将悬浮液再次离心238g (lOmin，4°C )。将细胞沉淀在Iml RPMI完全培养基中再悬浮，所述RPMI完全培养基含有RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen, Paisley, UK)， 胎牛血清 10 体积％，(Gibco，Invitrogen，Paisley，UK)，谷氨酰胺 ImM(Gibco, Invitrogen, Paisley, UK)，25mM HEPES (Sigma-Aldrich,普尔，多塞特，UK) 0. 08% (V/V)碳酸氢钠，50 μ M β -巯基乙醇(Gibco，Invitrogen, Paisley, UK)和抗生素混合物(青霉素/链霉素100U/ ml (100 μ g/ml)庆大霉素(100 μ g/ml))，并且在改进的Neubauer室中使用苯胺黑排除 (20ul细胞悬浮液，与20μ1 0. 苯胺黑混合)计算该悬浮液中的活细胞。将悬浮液在 RPMI完全培养基中稀释到2Χ106细胞/ml溶液。将50 μ 1重组蛋白质(RPMI完全培养基中， 110 μ g/ml)和100 μ 1淋巴细胞(RPMI完全培养基中，2Χ10Χ6)添加到微滴定孔中并在37°C 的加湿箱中在加湿气氛中温育96h。将微滴定板在443g离心(5min，15°C )。从每个孔取出 400ul的上清液并储存在4°C直到ELISA分析。牛IFN- γ 测定如来自B0VIGAM试剂盒(Prionics A.G，瑞士)的手册中所描述，在来自淋巴细胞的一式两份上清液上进行IFN- γ测定。在反应终止5min内在450nm读取ELISA孔中光密度的读数。用Map特异性抗原的混合物刺激全血如前所述制备重组抗原并且在无菌PBS中稀释。通过混合113. 8 μ g/ml的 MAP_3651c加上65 μ g/ml的MAP_1365而制备重组Map特异性蛋白质3651c和1365的混合物。使用Bovigam IFN-γ ELISA，根据制造商说明书在下列改进的情况下测定羊的细胞介导免疫反应。将五十微升的PBS中的抗原制剂与750微升全血在24孔无菌培养板中混合。 在收集的1小时内培养血液。在48小时温育期以后收集大约400微升的上清液。与生色团的温育在 37°C进行 15 分钟。用 113. 8μ g/ml 的重组 MAP_3651c、125 μ g/ml 的 MAP_1365 和MAP_3651c和MAP_1365的混合物刺激血液。牛犊的实验感染从通过ELISA测试和粪便培养测定的无副结核病的兽群获得18头霍斯坦种乳牛雄性牛犊。将牛犊随机指定到三组，每组六头牛犊。一组在16周(14-17)的平均年龄用鸟分枝杆菌鸟亚种(Maa)的IS 901阳性菌株感染，每头牛犊接收IO9个生物的单剂量。将第二组在19周(18-21)的平均年龄用Map感染。两头牛犊接收IO7个生物的单剂量，两头接收 IO8个生物并且两头接收IO9个生物。第三组，未感染的对照，接收磷酸盐缓冲盐水(PBS)。 使用湿重法估计生物数目并且将接种物作为PBS中的细菌悬浮液口服给予。分别对Maa和 Map感染的牛犊在感染后54、57和48、51周取血样用于分析。感染的牛犊的细胞介导反应的测定使用Bovigam IFN-y ELISA (Prionics, Schieren，瑞士)根据制造商的说明书在下列改进的情况下测量感染的牛犊的细胞介导反应。使用的刺激抗原是图例中提供的浓度下的PPDA、PPDJ和重组蛋白质3651c、1365、1297、0268c。从VLA获得PPDA并且首先渗析以除去苯酚。从Douwe Bakker获得PPDJ(Wageningen大学中心兽医研究所，Lelystad，荷兰)。如前所述制备重组抗原。将PBS中25微升的抗原制剂与200微升全血在96孔无菌培养板中混合。在收集的1小时内培养血液。在24小时温育期以后收集大约120微升上清液。对于每个温育步骤，在Bovigam ELISA板中在37°C温育1小时。在步骤之间使用自动板洗涤器将板洗涤六次。将与生色团的温育在37°C进行10分钟。全部抗原以一式两份测试。实施例1 :Map特异性蛋白质的蛋白质组鉴定通过比较Map和IS901+鸟分枝杆菌鸟亚种的蛋白质组来鉴定Map-特异性抗原， 所述鸟分枝杆菌鸟亚种是与Map最密切相关的分枝杆菌并且能够感染动物。该方法的原理是，两种生物的蛋白质组的比较将鉴别亚种特异性蛋白质，包括不会被比较基因组学方法检测的差别基因调节的产物。为了进行IS901+鸟分枝杆菌鸟亚种和Map的比较，必需首先进行显著的开发工作以优化并标准化所需实验和分析步骤。标准化方法详述如上。因为蛋白质组在生长周期期间改变，所以还在从生长周期中不同阶段的生物获得的蛋白质组之间进行比较(研究了对数和稳定期)。关于蛋白质组的比较，将Map中呈现独特表达或上调的蛋白质从凝胶挑出并通过 MALDI-T0F分析进行进一步的研究。可以表征这些Map蛋白质中的32种，并且在MALDI-T0F 和Mascot分析以后定义相应的基因。从所述生物的不同菌株比较蛋白质组以确保鉴定的蛋白质代表亚种。与Map的体内蛋白质组的比较证实，在靶种类的自然感染期间表达所述蛋白质。Map蛋白质组的实例和蛋白质组数据概述提供在表1中，其鉴别对于Map是特异性的并且在本发明的用途中是潜在合适的抗原。编码Map特异性蛋白质的基因是通过PCR扩增的，并且将30种Map特异性蛋白质克隆到pMAL-c2X载体(新英格兰生物实验室公司)中并表达为与MBP的融合蛋白质。使用上述步骤，制备纯化的重组蛋白质用于免疫测定。实施例2 通过感染的绵羊的细胞_介导免疫反应的Map特异性蛋白质识别为确定是否任一 Map特异性蛋白质将适于在细胞_介导免疫性测定中使用，关键是确定它们是否通过Map-感染动物的细胞-介导免疫反应识别。为了进行这些实验， 需要鉴别亚临床感染的绵羊，其将增强对Map的细胞-介导反应。为鉴别这些动物，使用 PPD-J (来自Map)，PPD-A (来自鸟分枝杆菌鸟亚种)和PPD-B (来自牛分枝杆菌)作为刺激抗原，使用全血Bovigam IFN-γ测定来筛选来自己知感染的羊群的35只绵羊。作为促细胞分裂剂对照，包括半刀豆球蛋白A(ConA)以评价细胞的健康状态。确定具有对PPD-J的显著阳性反应的九只动物，并且选择用于进一步研究。对照动物取自没有副结核历史的羊群并且在IFN-Y测定中使用PPD-J和PPD-A测试阴性反应。将来自对照动物的血清送到 BioBest 实验室有限公司(BioBest Laboratories Ltd.) (Pentlands 科学园，Penicuik，苏格兰) 用于通过ELISA测试以保证动物不具有对Map的循环抗体，所述对Map的循环抗体显示临床感染。通过Ziehl Nielsen染色，对来自对照动物的粪便涂片进行染色，作为最终检验以保证它们没有被Map感染。血液取自动物并且在低渗裂解和Iymphopr印分离(如上所述)之后将外周血淋巴细胞纯化。使用30个重组Map特异性蛋白，MBP、PPD-J、ConA以及培养基进行IFN-γ测定。对培养基背景和用于Map特异性蛋白质的MBP都矫正OD值。取矫正的OD > 0. 1的截断值和在2个或多个亚临床感染的绵羊的阳性结果，30个重组Map特异性蛋白质中的10 个似乎引起细胞-介导反应。在IFN-Y测定中50%或更多的动物识别这些蛋白质中的四种(MAP3651c，MAP1297, MAP1365和MAP0268c)并且它们是用于对Map的细胞-介导免疫性试验的潜在试剂。使用来自6只亚临床感染的和四只对照动物的血液，用这四种Map特异性蛋白质重复实验。在图1和后面的图2中的统计分析中给出来自使用这四种蛋白质重复三次进行的Bovigam测定的数据。三次重复测定数据的平均值用于随后的分析。图1显示IFN-γ ELISA的结果，所述IFN-γ ELISA显示对单个的亚临床Map感染的绵羊(P7，P33， W363，W395，PC212，0269)与对照动物(724A，329A，463A，307A)比较的Map特异性蛋白质的细胞-介导免疫反应。绘制方块图以比较在感染动物组(以I放在前的蛋白质)和对照动物组(以C放在前的蛋白质)之间对于Map特异性蛋白质的细胞-介导免疫反应的变异性的差异。存在某一在各组之间变异性差异和明显的异常值的证据(观察20，对于感染组的动物W363的0268c的值)。OD值是比另一个可比较值高一个数量级，并且将该数据点从随后的分析去除。因为这是感染动物的最高值，所以它不会使结果关于感染组偏离。图2显示数据图，所述数据图显示在感染组和对照组中对于Map特异性蛋白质的细胞介导的免疫反应之间的相对差异，具有原始平均值和标准误差。由于变异性，所以使用线性混合模型分析调整数据(一式三份的平均值)，组(对照/感染的)和蛋白质拟合为分类固定效应，将动物拟合为随机效应。计算一式三份的平均值(而不是原始平均值)的秩并将其用于统计模型。存在组X蛋白质相互作用(P = 0. 025)的证据，其表明一些蛋白质在对照组和感染组之间存在真实差异。整个蛋白质平均水平在感染组中更高，并且对于MAP0268c、MAP1365 和MAP3651C的差异是显著不同的。这支持图2中的原始数据，并且两个样品的t_检验证实MAP0268c和MAP3651c在5%显著性水平上是显著的。MAP1365的P值却缺少统计显著性(P = 0. 1)。虽然本发明特别涉及羊和牛中Map感染的诊断，但是本发明的方法扩展到检测任何其它易感动物种类中的Map感染，所述动物种类例如，鹿、山羊、獾、水牛、野牛、负鼠、猪、 骆驼以及甚至是人。
实施例3使用Map特异性抗原的混合物，在绵羊血液中细胞因子生产的增强刺激。通常可以通过使用抗原的混合物来增加免疫测定的灵敏度。在小型中间试验中， 测定两只亚临床感染Map的绵羊响应于如上所述的单一抗原制剂和重组Map -特异性蛋白质3651c和1365的混合物的细胞-介导的免疫反应。结果显示在图7中。与单一抗原制剂相比，两种Map特异性抗原的组合在Bovigam IFN- y ELISA中刺激增强的响应，虽然响应的量值在绵羊之间改变。Map特异性重组抗原的不同组合将需要评价以确定用于诊断测定的最佳混合物。实施例4通过实验感染的牛犊的细胞_介导响应的Map特异性蛋白质的识别为确定Map特异性蛋白质是否被另一种宿主种类的细胞-介导免疫反应识别，使用牛犊感染模型。如上所述用Map和Maa实验感染牛犊。收集血液，用重组抗原制剂对其刺激并且使用如上所述的Bovigam IFN-γ测定测量细胞-介导反应。结果显示，与未感染的对照牛犊相比较，Map感染的牛犊增强(mount) 了对全部抗原的可检测的细胞-介导免疫反应(图8)。与Maa-感染的牛犊相比较，评价Map-感染的牛犊对重组3651c的细胞-介导免疫反应的特异性。使用如上所述的Bovigam IFN- y ELISA，分别分析来自两只用IO9Map感染的牛犊和6只用IO9Maa感染的牛犊在感染后48周和54周的血液。用重组3651c，PPDA和 PPDJ刺激血液。结果显示在图9中。在Map-感染的牛犊中有比Maa-感染的牛犊更大的对于3651c的细胞-介导的反应，虽然反应的量值在动物之间改变。这些结果显示MAP3651C 可用于区分Map-和Maa-感染的动物。
权利要求
1.对动物中的一种或多种纯化的Map抗原的细胞-介导免疫反应的检测方法，所述方法包括以下步骤通过测定响应于所述一种或多种纯化的Map抗原的淋巴细胞激活和/或增殖的程度来检测细胞-介导的免疫反应。
2.权利要求1的方法，其中通过使用抗体或通过RT-PCR或微列阵间接从mRNA来检测细胞因子如干扰素Y (IFN-γ)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、转化生长因子β (TGF-β)、白介素(IL-2，IL-6，IL-10, IL-12，IL-17)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平，测定所述细胞-介导的免疫反应。
3.任一前述权利要求的方法，其中所述方法是在从受试者分离的血样或其级分上进行的，或是皮肤试验诸如迟发超敏皮肤试验。
4.权利要求3的方法，其中将所述血样或其级分与所述一种或多种纯化的Map抗原温育，以容许任何细胞-介导的反应显现。
5.任一前述权利要求的方法，其中所述抗原是由Map表达的蛋白质或其片段并且在被Map感染的动物中引起可检测的免疫反应，所述免疫反应大于由其它密切相关的鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)亚禾中(鸟分枝杆菌鸟亚禾中(Mycobacterium avium subsp. avium)禾口鸟分枝杆菌森林土壤亚种(Mycobacterium avium subsp. silvaticum))的抗原弓| 起的免疫反应。
6.任一前述权利要求的方法，其中所述抗原与其它相关的种类如鸟分枝杆菌的其它亚种、牛分枝杆菌(M. bovis)和/或结核分枝杆菌(M. tuberculosis)不显示或几乎不显示交叉-反应性。
7.任一前述权利要求的方法，其中所述方法使用两种或多种Map-特异性抗原。
8.任一前述权利要求的方法，其中Map抗原选自下组MAP0268c；MAP1297 ；MAP 1365和 MAP3651c。
9.一种或多种纯化的Map-特异性蛋白质或其免疫原性片段在诊断动物中Map感染方法中的用途。
10.权利要求9的用途，其中所述一种或多种纯化的Map-特异性蛋白质选由 MAP0268c ；MAP1297 ；MAP1365 ；和 MAP3651c 组成的组。
11.用于进行诊断Map感染的方法的试剂盒，所述试剂盒包括能够引起细胞-介导的免疫反应的一种或多种纯化的Map-特异性蛋白质或其免疫原性片段。这种试剂盒可以进一步包括用于所述诊断方法中的其它试剂，诸如抗-IFN-γ抗体。
12.权利要求11的试剂盒，其中所述一种或多种纯化的Map-特异性蛋白质选自由 MAP0268c ；MAP1297 ；MAP1365 ；和 MAP3651c 组成的组。
13.用于引发动物中的免疫反应一种或多种蛋白质，所述蛋白质选自由以下组成的组: MAP0268c ；MAP1297 ；MAP1365 ；和 MAP3651c ；及其片段。
14.一种免疫原性制剂疫苗，所述免疫原性制剂疫苗包括选自由以下组成的组的一种或多种蛋白质MAP0268c ；MAP1297 ；MAP1365 ；和 MAP3651c ；及其片段。
15.一种针对MAP感染的给动物接种疫苗或免疫的方法，所述方法包括施用选自由以下组成的组的一种或多种MAP抗原的步骤MAP0268c ；MAP1297 ；MAP1365 ；和MAP3651c ；及其片段。
16.一种或多种蛋白质用于保护动物免受Map感染或用于减少Map建群或由Map引起或促成的疾病的严重性的用途，所述蛋白质选自由以下组成的组MAP0268c ；MAP1297 ； MAP1365 ；和 MAP3651c ；及其片段。
17.权利要求16的用途，其中所述Map引起或促成的疾病是副结核病。
全文摘要
本发明涉及分枝杆菌感染并且提供诊断副结核病的病原体鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis)(Map)感染的方法。另外，本发明还提供用于诊断Map感染的试剂盒和疫苗/免疫原性组合物。
文档编号G01N33/569GK102159952SQ200980128321
公开日2011年8月17日 申请日期2009年5月29日 优先权日2008年5月29日
发明者凯伦·斯蒂文森, 瓦莱里·玛格丽特·休斯 申请人:莫登研究院