专利名称：L-岩藻糖α1→6特异性凝集素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素，及其制备方法，以及其 应用。特别地，本发明涉及一种新型的得自担子菌或子囊菌的凝集素，及其制备方法，以及 使用该凝集素检测和分别糖链的方法。
背景技术：
人们公知的是，α 1 — 6岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的表达与肝细胞的癌变是一 致的，α —6岩藻糖基转移酶将L-岩藻糖残基经由α —6链合转移到N-联聚糖的还 原端N-乙酰葡糖胺上从而形成中心岩藻糖基化。当前，肝细胞癌使用对中心岩藻糖基化的 单和双叉N-葡聚糖具有亲和力的小扁豆凝集素(LCA)通过凝集素亲和力电泳检测。抗体依赖性细胞毒性(以下称为ADCC活性)是一种人体自带的免疫功能。ADCC 活性是一种经由抗体例如天然杀伤细胞和单核细胞的粒性白细胞经由其杀死例如癌细胞 的靶细胞的活性。ADCC活性与通过例如作为人源化抗体的赫赛汀(转移乳腺癌治疗剂)和 作为嵌合抗体的B细胞单克隆抗体(非Hodgkin淋巴瘤治疗剂)(非专利文献1)的抗体医 疗药物对抗肿瘤的抗肿瘤机理相关。当这些抗体医疗药物具有较低ADCC活性时，就需要较 大的抗体医疗药物的使用量，这将同时导致例如成本和副作用(即，免疫低下引起的感染) 增加的问题。在转移了 α 1 — 6L-岩藻糖的抗体和未转移L-岩藻糖的抗体之间，ADCC活性相 差50-200倍(非专利文献幻。如果可以得到未转移L-岩藻糖的抗体，就可以提供具有高 ADCC活性的抗体制品。一般地，除LCA外，其他已知的中心岩藻糖结合的凝集素有例如豌豆凝集素 (PSA)，橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)，黄水仙凝集素(NPA)，蚕豆凝集素(VFA)，和米曲霉凝集 素(AOL)(专利文献 1-5)。非专利文献 1 =Clynes RA等，Inhibitory Fc receptors modulate in vivocytoxicity against tumor targets. NATURE MED 2000 APR ；6 (4) :443-446 # 专禾ll文献 2 :Toyohide Shinkawa 等，The absence of L-fucose but notthe presence of galactose or bisecting N—acetyl glucosamine of human IgGlcomplex—type oligosaccharides shows the critical role of enhancingantibody-dependent cellular cytotoxicity. J Biol Chem. 2003 年 1 月 31 日；278 (5) :3466-73. Epub 2002 年11月8日。专利文献1 :W02002/030954专利文献2 :W02003/084569专利文献3 特 开平H02-083337的实施例专利文献4 特开2002-112786的实施例5专利文献5 特开 2007-161633
发明公开已知用于L-岩藻糖α 1 — 6糖链检测的凝集素还对L-岩藻糖α 1 — 6连接糖链 以及具有除α 1 — 6连接的L-岩藻糖的糖脂糖链和不具有L-岩藻糖的高甘露糖糖链有 亲和力。特别地，AAL和AOL还对例如α 1 — 2L-岩藻糖和α 1 — 3L-岩藻糖具有亲和力。甘露糖特异的LCA，PSA和VFA还对非岩藻糖基化的单和双叉N-葡聚糖具有亲和力。因此， L-岩藻糖α 1 — 6糖链的精确检测是不可能的，同时分离L-岩藻糖α —6糖链也是不可 能的。目前只对L-岩藻糖α 1 — 6糖链特异性结合的凝集素是未知的。综上所述，本发明的一个目的是提供一种新型的凝集素，其可以特异性地结合到 L-岩藻糖α 1 — 6糖链。本发明可以提供一种相比传统方法更精确的使用新型凝集素检测 L-岩藻糖α 1 — 6糖链的方法，以及一种基于L-岩藻糖α 1 — 6糖链检测的分离L-岩藻 糖α 1 — 6糖链和非L-岩藻糖α 1 — 6糖链的方法。本发明发明人发现了一种新型的凝集素，其具有对具有L-岩藻糖α —6的糖 链很高的亲和力。发明人发现，该新型凝集素可以特异性地检测L-岩藻糖α 1 — 6糖链， 并且该凝集素可以用于L-岩藻糖α —6糖链或非L-岩藻糖α —6糖链(L_岩藻糖 α —2，1 — 3，1 — 4糖链)的提纯。术语“L_岩藻糖α 1 — 6糖链”指的是一种结构，在 该结构中，L-岩藻糖通过一个α —6键连接于N-联聚糖还原末端的N-乙酰葡萄糖胺。 术语“非L-岩藻糖α —6糖链”指的是在分子中不具有α —6连接的L-岩藻糖的糖。特别地，本发明发明人提供了一种L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素(1)其得自于 担子菌类或子囊菌，( 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳其具有4，000-40，000 的分子量，和⑶其对L-岩藻糖α 1 — 6糖链具有缔合常数为LOXlO4M-1或更高(25°C 时)的亲和力。这里的缔合常数指的是在25°C的试验温度下通过正面亲和色谱(FAC)测定 的数值。L-岩藻糖α 1 — 6糖链可以包括唾液N-聚糖。此外，L-岩藻糖α —6特异性凝集素(4)优选地基本上不与不包含L-岩藻糖 α 1 — 6糖链的高甘露糖糖链和/或糖脂结合。此外，L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素优选地(5)对α 1 — 6岩藻糖基化的、单、 双、三和四叉N-聚糖具有1.0Χ IO4M-1或更高(25°C时)缔合常数的亲和力。担子菌属于例如球盖茹科、口蘑科、捕蝇蕈科或多孔菌科。担子菌是例如土生环锈伞，翅磷伞，多脂鳞伞，大球盖菇，亚砖红沿丝伞，花脸香 蘑，或毒蝇伞。特别地，L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素(6)的氨基酸序列显示在序列号1中。本发明还提供了 L-岩藻糖α —6特异性凝集素，其是(a)包括显示在序列号 2-5的任一序列中的氨基酸序列的蛋白质或肽，或(b)其中显示在序列号2-5的任一序列中 的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被删除，插入或取代的蛋白质或肽，并且这些蛋白质或 肽与具有显示在序列号2-5中的任一氨基酸序列是功能相当的。术语“功能相当”指的是 对L-岩藻糖α 1 — 6糖链具有缔合常数为1.0Χ IO4M4或更高(25°C时)的亲和力。显示在(b)中的蛋白质或肽具有例如序列号6显示的氨基酸序列。本发明还提供了一种L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素，其是与显示在序列号2_6 的任一序列中的氨基酸序列具有至少37%的同源性，并且与具有显示在序列号2-6的任一 序列中的氨基酸序列的蛋白质或肽功能相当的蛋白质或肽。本发明还提供了一种L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素的制备方法，通过该方法， 担子菌和/或子囊菌的水性介质提取物(水溶性提取物)可以应用于(i)疏水色谱和反相 色谱，(ii)亲合色谱，或(iii)离子交换色谱和凝胶过滤，从而可以获得凝集素，该凝集素
5(vi)具有4，000-40，000的由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的分子量，和(ν) 对L-岩藻糖α 1 — 6糖链具有缔合常数1. OX IO4M4或更高(25°C时)的亲和力。担子菌优选地选自至少球盖茹科，口蘑科，捕蝇蕈科，多孔菌科的一种。担子菌优选地至少是选自土生环锈伞，翅鳞伞，多脂鳞伞，大球盖菇，亚砖红沿丝 伞，花脸香蘑，或毒蝇伞的一种。L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素制备方法中使用的担子菌和/或子囊菌优选地是 子实体柄(子实体)。本发明还提供了一种检测L-岩藻糖α 1 — 6糖链的方法，包括使糖链作用于L-岩 藻糖α 1 — 6特异性凝集素的步骤。糖链例如是一种肿瘤标记物。本发明还提供了一种分别L-岩藻糖α 1 — 6糖链的方法，包括使糖链作用于L-岩 藻糖α —6特异性凝集素的步骤。特别地，本发明提供了一种通过使用固定化的L-岩藻 糖α 1 — 6特异性凝集素分别L-岩藻糖α 1 — 6糖链和非L-岩藻糖α 1 — 6糖链的方法。分别方法中作用的糖链例如与抗体结合。本发明还提供了一种检测L-岩藻糖α 1 — 6糖链的诊断剂和诊断剂试剂盒。该 诊断剂包括作为活性成分的L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素。本发明的新型凝集素相比传统凝集素对具有L-岩藻糖α 1 — 6的糖链、糖肽和糖 蛋白具有缔合常数为1. OX IO4M-1或更高的亲和力。特别地，只有具有L-岩藻糖α 1 — 6的 糖链可以被特异性地识别。使用该特异性，L-岩藻糖α —6特异性凝集素可以用于下面 所示的各种应用。与具有对L-岩藻糖α 1 — 6糖链的亲和力的传统凝集素大不相同的是，本发明可 以以更加选择特异性的方式检测α 1 — 6L-岩藻糖糖链。本发明提供了分别L-岩藻糖α —6糖链的方法，其基于al —6L_岩藻糖的精 确识别，L-岩藻糖α —6糖链和非L-岩藻糖α —6糖链之间的严格分别。因此，L-岩 藻糖α —6糖链或非L-岩藻糖α —6糖链可以以高纯度提纯。特别地，通过使用本发 明的分别方法从包括L-岩藻糖α 1 — 6糖链和非L-岩藻糖α 1 — 6糖链混合物的抗体制 品中除去L-岩藻糖α —6糖链，抗体医疗药物可以具有增强的ADCC活性。因此，可以以 减少的剂量制得抗体制品，从而实现例如成本的降低和副作用的减少。此外，抗体制品还可 以根据症状和副作用进行配药。
附图简要说明附
图1是本发明操作实施例和对照实施例中所用的α 1 — 6L-岩藻糖低聚糖和 非al —6L-岩藻糖低聚糖的结构图。附图2是本发明操作实施例和对照实施例中所用的 L-岩藻糖α —6低聚糖和非L-岩藻糖α —6低聚糖的结构图。附图3表明了实施例 1中PTL的提纯过程。附图4是实施例1的PTL离子交换色谱的洗脱图。附图5是实施例 1的PTL亲合色谱的洗脱图。附图6表明了实施例1的PTL的SDS-PAGE结果(照片作为图 画的替代)附图7表明了实施例2的SRL的提纯过程。附图8是实施例2的SRL的疏水色 谱的洗脱图。附图9是实施例2的SRL的反相色谱的洗脱图。附图10图示了实施例2的 SRL的SDS-PAGE结果(照片作为图画的替代)。附图11图示了实施例1的PTL的MS光谱的结果。附图12图示了实施例2的SRL的MS光谱的结果。附图13图示了使用实施例1的 PTL的西式印迹法的结果(照片作为图画的替代)。附图14图示了使用实施例1的SRL的 西式印迹法的结果(照片作为图画的替代)。附图15图示了使用对照实施例1的AAL的西 式印迹法的结果(照片作为图画的替代)。附图16图示了使用对照实施例2的AOL的西式 印迹法的结果(照片作为图画的替代)。附图17图示了使用对照实施例3的LCA的西式印 迹法的结果(照片作为图画的替代)。附图18图示了当只有蛋白质由作为对照的CBB染色 时的结果(照片作为图画的替代)。附图19图示了使用实施例1的PTL的ELISA糖蛋白检 测结果。附图20图示了使用实施例2的SRL的ELISA糖蛋白检测结果。附图21图示了使 用对照实施例1的AAL的ELISA糖蛋白检测结果。附图22图示了使用对照实施例2的AOL 的ELISA糖蛋白检测结果。附图23图示了使用对照实施例3的LCA的ELISA糖蛋白检测 结果。附图M图示了糖链中α-胎蛋白Ll和L3之间不同的使用实施例1的PTL的ELISA 检测结果。附图25图示了糖链中α -胎蛋白Ll和L3之间不同的使用实施例2的SRL的 ELISA检测结果。附图沈图示了糖链中α-胎蛋白Ll和L3之间不同的使用对照实施例1 的AAL的ELISA检测结果。附图27图示了糖链中α -胎蛋白Ll和L3之间不同的使用对 照实施例2的AOL的ELISA检测结果。附图观图示了糖链中α -胎蛋白Ll和L3之间不 同的使用对照实施例3的LCA的ELISA检测结果。附图四图示了实施例3的NSL的提纯 过程。附图30是实施例3的NSL疏水色谱洗脱图。附图31是实施例3的NSL反相色谱洗 脱图。附图32图示了实施例3的NSL的SDS-PAGE结果(照片作为图画的替代)。附图33 图示了实施例4的LSL的提纯过程。附图34是实施例4的LSL疏水色谱洗脱图。附图35 是实施例4的LSL反相色谱洗脱图。附图36图示了实施例4的LSL的SDS-PAGE结果(照 片作为图画的替代)。附图37图示了实施例3的NSL的MS光谱结果。附图38图示了实施 例4的LSL的MS光谱结果。
实现发明的最佳模型下面的内容将给出一个L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素结合的L-岩藻糖α 1 — 6 糖链的例子。
权利要求
1.一种L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素，其(1)提取自担子菌或子囊菌，( 具有 4，000-40，000的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分子量，和(；3)对L-岩 藻糖α 1 — 6糖链具有亲和力，该亲和力由1.0Χ IO4M-1或更高的缔合常数(25°C时)表征。
2.根据权利要求1的L-岩藻糖α1 — 6特异性凝集素，其中L-岩藻糖α 1 — 6糖链 在其非还原端具有唾液酸。
3.根据权利要求1的L-岩藻糖α1 — 6特异性凝集素，其中L-岩藻糖α 1 — 6特异 性凝集素(4)基本上不与高甘露糖糖链和/或不包括L-岩藻糖α 1 — 6糖链的糖脂结合。
4.根据权利要求1的L-岩藻糖α —6特异性凝集素，其中L-岩藻糖α —6特 异性凝集素(5)对L-岩藻糖α —6单、双、三、四叉N-聚糖具有亲和力，该亲和力由 LOXlO4M-1或更高的缔合常数(25°C时)表征。
5.根据权利要求1的L-岩藻糖α —6特异性凝集素，其中担子菌属于球盖茹科，口 蘑科，捕蝇蕈科，或多孔菌科。
6.根据权利要求1的L-岩藻糖α —6特异性凝集素，其中担子菌是土生环锈伞，翅 磷伞，多脂鳞伞，大球盖菇，亚砖红沿丝伞，花脸香蘑，或毒蝇伞。
7.根据权利要求1的L-岩藻糖α1 — 6特异性凝集素，其中L-岩藻糖α 1 — 6特异 性凝集素还(6)包括序列号1所示的氨基酸序列。
8.—种L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素，其是(a)包括任何序列号2_5所示的氨基酸 序列的蛋白质或肽，或(b)其中显示在序列号2-5的任一序列中的氨基酸序列中一个或多 个氨基酸被删除，插入或取代的蛋白质或肽，并且其与具有显示在序列号2-5中的任一氨 基酸序列的蛋白质或肽是功能相当的。
9.根据权利要求8的L-岩藻糖α1 — 6特异性凝集素，其中L-岩藻糖α 1 — 6特异 性凝集素具有序列号6所示的氨基酸序列。
10.一种L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素，其是具有与任何序列号2-6所示氨基酸序 列至少37%或更高同源性的蛋白质或肽，并且其与具有任何序列号2-6所示氨基酸序列的 蛋白质或肽功能相当。
11.一种制备L-岩藻糖α —6特异性凝集素的方法，包括步骤将担子菌和/子 囊菌的水性溶剂提取物经过任何以下色谱，(i)疏水色谱和反相色谱，(ii)亲和色谱，或 (iii)离子交换色谱和凝胶过滤，和获得具有(vi)4，000-40，000SDS-PAGE分子量和(ν)由 1.0Χ IO4M4或更高的缔合常数(25°C时))表征的对L-岩藻糖α —6糖链的亲和力的凝 集素。
12.根据权利要求11的制备L-岩藻糖α —6特异性凝集素的方法，其中担子菌选自 至少球盖茹科，口蘑科，捕蝇蕈科，或多孔菌科的一种。
13.根据权利要求11的制备L-岩藻糖α —6特异性凝集素的方法，其中担子菌是至 少选自土生环锈伞，翅磷伞，多脂鳞伞，大球盖菇，亚砖红沿丝伞，花脸香蘑，或毒蝇伞的一 种。
14.根据权利要求11的制备L-岩藻糖α —6特异性凝集素的方法，其中使用担子菌 和/子囊菌的子实体柄(子实体)。
15.一种检测L-岩藻糖α —6糖链的方法，包括使糖链作用于根据权利要求IL-岩 藻糖α —6凝集素的步骤。
16.根据权利要求15的检测L-岩藻糖α —6糖链的方法，其中糖链是肿瘤标记物。
17.一种分别L-岩藻糖α —6糖链的方法，包括使糖链作用于根据权利要求IL-岩 藻糖α —6凝集素的步骤。
18.根据权利要求17的分别L-岩藻糖α1 — 6糖链的方法，其中糖链结合到抗体。
19.一种用于检测L-岩藻糖α —6糖链的诊断剂或诊断剂试剂盒，其中诊断剂包括 作为活性成分的根据权利要求1的L-岩藻糖α 1 — 6特异性凝集素。
全文摘要
本发明公开了一种新型凝集素，其可以特异性地结合到L-岩藻糖α1→6糖链。本发明还公开了该凝集素的用途。本发明L-岩藻糖α1→6特异性凝集素的特征在于(1)该凝集素提取自担子菌或子囊菌，(2)该凝集素具有4,000-40,000的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分子量，和(3)该凝集素对L-岩藻糖α1→6糖链具有亲和力，该亲和力由1.0×104M-1或更高的缔合常数(25℃时)表征。该凝集素可用于特定地检测L-岩藻糖α1→6糖链，并且对于L-岩藻糖α1→6糖链和非L-岩藻糖α1→6糖链的提纯是有用的。
文档编号G01N33/53GK102105490SQ20098012857
公开日2011年6月22日 申请日期2009年7月15日 优先权日2008年7月22日
发明者小林夕香, 平林淳, 河岸洋和, 道罗英夫, 馆野浩章 申请人:J-制油株式会社